Name: Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę SPOt do szybkiego profilowania poziomów tRNA w próbkach biologicznych przy użyciu znakowania metabolicznego i analizy makromacierzowej. Technika umożliwia pomiar wszystkich tRNA w ciągu 24 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant SC INBRE z National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 do R.G.) oraz granty CA555536 & CA154664 z National Cancer Institute dla P.H.H. Program ten był częściowo wspierany przez grant dla College of Charleston z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach Programu Edukacji Przedszkolnej i Licencjackiej oraz przez granty z National Center for Research Resources (5 P20 RR016461) i National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) z National Institutes of Health.

1. Etykietowanie kultur i metabolizmu
<ol>
	<li>Szturchnij raz środek nakrętki sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml igłą o rozmiarze 18, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Zaszczepić 500 μl uzupełnionego sterylnego bulionu 7H9 z 5 μl M. smegmatis z kultury starterowej wyhodowanej przez noc12. 
	UWAGA: Przepis na jeden litr bulionu 7H9 to: 4,7 g komercyjnego proszku 7H9, 2 ml glicerolu, 1 ml Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g albuminy, 2 g dekstrozy, H2O (aby uzyskać całkowitą objętość do 1 l).
	<ol>
		<li>(UWAGA) Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami ochrony przed promieniowaniem, należy zwiększyć pożywkę hodowlaną o 20 μCi/ml [32P] Na2HPO4. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C i mieszaniu 1 200 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką umieszczonym za akrylową osłoną o grubości 9 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W fazie midlog (O.D.600 nm ~ 0,5) przenieś całą kulturę do probówki z zakrętką o pojemności 2 ml i osadź radioaktywne bakterie w temperaturze pokojowej, wirując przez 2 minuty przy 10 000 x g. Zebrać supernatant zawierający niewłączony radioaktywny ortofosforan do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
</ol>
2. Przygotowanie całkowitej liczby RNA
UWAGA: Całkowite RNA są ekstrahowane z granulek bakteryjnych za pomocą komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA (zawierającego tiocyjanian guanidyny, fenol i chloroform) zgodnie z protokołem producenta.
<ol>
	<li>Dodać 1 ml dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji RNA i około 200 μl szklanych kulek na osad. Szczelnie zamknij probówkę i rozbij bakterię w homogenizatorze na 2 minuty przy maksymalnym zamieszaniu (ustawienie numer pięć na wybranym instrumencie (patrz Tabela Materiałów)).</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i odpowiednio wyrzucić kulki. Dodaj 0,2 ml chloroformu i energicznie potrząsaj probówką ręcznie przez 15 sekund. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pobrać fazę wodną próbki do nowej probówki, ustawiając probówkę pod kątem 45°. Unikaj rysowania jakiejkolwiek warstwy interfazowej lub organicznej. Dodać 2 μl kolorowego środka strącającego i 0,5 ml 100% izopropanolu. Potrząsaj energicznie tubką ręcznie przez 5 sekund. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Usunąć supernatant z probówki i odpowiednio wyrzucić, ponieważ frakcja ciekła może zawierać śladowe ilości promieniotwórczości. Suchy na powietrzu granulat przez 5 minut, a następnie ponownie zamieszać w 200 μL 2X cytrynian soli sodowej (SSC), 0,1% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) final. 
	UWAGA: Skład zapasu 20 X SSC to 3,0 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,0.</li>
</ol>
3. Przygotowanie 96-dołkowych płyt do drukarek
UWAGA: mikromacierze tRNA są ręcznie drukowane z czterdziestoma dwoma 70-merowymi oligonukleotydami DNA komplementarnymi do końca 3' każdego M. smegmatis tRNA (z wyłączeniem terminala CCA) za pomocą ośmiopinowej tablicy. Podano sekwencje sond oligonukleotydowych DNA, jak również układ sondy w płytce studzienkowej i matrycy (plik uzupełniający 1 - arkusz 1 do 3 odpowiednio).
<ol>
	<li>Projektuj sondy DNA, najpierw pobierając sekwencje tRNA lub geny kodujące tRNA z baz danych tRNA, takich jak Genomic tRNA Database13. Przyciąć zachowany koniec 3' CCA, jeśli jest zakodowany. Odwrotne uzupełnienie wynikowej sekwencji. Zamów sondę na podstawie pierwszych 70 nukleotydów.</li>
	<li>Zawieś suche sondy DNA w wodzie. Dostosuj stężenie sondy do 100 μM. Na 96-dołkowej płytce przygotować 120 μl 50 μM oligonukleotydów w 3X SSC, 0,01% (w/v) SDS final (rozcieńczyć 60 μL sond wyjściowych w indywidualnym dołku z 60 μL 6X SSC, 0,01% (w/v) SDS.</li>
	<li>Przykryj płytę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu lub zanieczyszczeniu, natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
</ol>
4. Drukowanie tablicy
<ol>
	<li>Rozmrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej (trwa około 20 minut).</li>
	<li>Oznacz szkiełka ze szkła pokrytego aminą pisakiem diamentowym. Umieść szkiełka w jednostce indeksującej. Postępuj zgodnie z rozmieszczeniem siatki i wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Ostrożnie zanurz kołki replikatora w studzienkach.</li>
		<li>Delikatnie wydrukuj tablicę na szkiełkach, używając minimalnego nacisku (poczujesz niewielki opór). Kontynuuj drukowanie bez czyszczenia macierzy, aż skończysz z blokiem A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do przejścia do następnego bloku, postępuj zgodnie z procedurą prania opisaną poniżej.
	<ol>
		<li>Zanurz replikator w 5% wybielaczu i delikatnie wstrząśnij.</li>
		<li>Wciśnij replikator w papier chłonny.</li>
		<li>Zanurz replikator w wodzie destylowanej, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier. Powtórz ten krok raz.</li>
		<li>Zanurz replikator w izopropanolu, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier.</li>
		<li>Wysuszyć replikator na wentylatorze przez około 20 sekund przed przejściem do następnego bloku płytki 96-dołkowej. Przejdź do żądanej liczby wydruków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, a następnie usieciuj oligonukleotydy ze szkiełkiem za pomocą środka sieciującego UV o długości fali 254 nm.
	<ol>
		<li>Ustaw poziom energii na 999,990 μJ/cm2.</li>
		<li>Połóż szkiełka stroną zadrukowaną do góry na czystej powierzchni w sieciowniku. Naciśnij "start".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokować matryce na noc w 450 ml roztworu blokującego na mieszadle magnetycznym, w temperaturze pokojowej i przy powolnym mieszaniu. Zbierz i ponownie użyj roztworu blokującego do czterech razy. 
	UWAGA: Przepis na roztwór blokujący to: 125 mM bufor fosforanowy (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5X SSC, 1% BSA (w/v).</li>
	<li>Myć szkiełka 2 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 500 ml wody destylowanej. Wysuszyć szkiełka, wirując przez 10 s w temperaturze pokojowej w wirówce z mikromatrycą. Przechowuj tablice w suchym i ciemnym miejscu do 6 miesięcy.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja tablicy
<ol>
	<li>Przed hybrydyzacją przepłukać szkiełka we wrzącej wodzie i wysuszyć przez odwirowanie (jak w ppkt 4.6).</li>
	<li>Umieść matrycę w kasecie hybrydyzacyjnej i załaduj znakowaną radioaktywnie próbkę RNA.</li>
	<li>Uruchom zautomatyzowaną stację hybrydyzacji i mycia, aby uzyskać maksymalną powtarzalność.
	<ol>
		<li>Kroki programu w następujący sposób. Kondycjonować uszczelki przez 2 minuty w temperaturze 75 °C. Wprowadzić sondę w temperaturze 60 °C. 
		Denaturyzacja sond i próbek 5 minut w temperaturze 90 °C. Hybrydyzować próbki przez 3 godziny w temperaturze 60 °C.
		<ol>
			<li>Umyć szkiełka w temperaturze 50 °C dwukrotnie za pomocą 2X SSC, 0,1% (w/v) SDS, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s. Umyć szkiełka w temperaturze 42 °C dwukrotnie za pomocą 0,1X SSC, 0,1% SDS, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s. Umyć szkiełka w temperaturze 42 °C dwukrotnie za pomocą 0,1 X SSC, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suche szkiełka przez odwirowanie (jak w ppkt 4.6).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja tablicy
<ol>
	<li>Owiń szkiełka cienką folią z tworzywa sztucznego. Sprawdź slajdy pod kątem sygnału radioaktywnego za pomocą licznika Geigera na jego najbardziej czułym ustawieniu. Umieść szkiełka na ekranie luminoforowym do przechowywania w kasecie naświetlającej w temperaturze pokojowej przez 10 do 90 godzin, w zależności od siły sygnału. 
	UWAGA: Ponieważ czułość liczników Geigera różni się w zależności od instrumentu, czasy ekspozycji muszą być zoptymalizowane empirycznie.</li>
	<li>Zeskanuj szkiełko z rozdzielczością 50 μm za pomocą luminoobrazurów. Określ ilościowo i odejmij intensywność promieniotwórczości w każdym punkcie sondy za pomocą bezpłatnego oprogramowania Image J zaktualizowanego o profiler mikromacierzy.</li>
	<li>Organizuj i przetwarzaj dane za pomocą elektronicznego arkusza kalkulacyjnego. Generuj mapy skupień za pomocą narzędzia do formatowania warunkowego. Przedstaw na przykład każdy sygnał sondy jako ułamek (wyrażony w ‰) całkowitego sygnału sondy.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).</li>
<li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li>
<li>Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+transfer+RNAs%3A+similarity+and+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li>
<li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li>
<li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOt%3A+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939(2017).</li>
<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
<li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Emisje cząstek beta są znanymi czynnikami bakteriostatycznymi i bakteriobójczymi14, jednak promieniowanie w badanym zakresie nie ma znaczącego wpływu na sprawność komórek. Zliczanie scyntylacyjne wykazało, że radioaktywność jest włączana do 25% ekstraktów komórkowych, a następnie do 1% oczyszczonych całkowitych RNA.
Identyczne rozmiary sond, porównywalna temperatura topnienia i zawartość GC, wraz z jednolitym protokołem wykrywania makromacierzy, hybrydyzacji i kwantyfikacji pozwalają na bezstronny pomiar poziomów tRNA bezpośrednio z sygnałów punktowych.
SPOt jest powtarzalny i specyficzny. Jego duży zakres dynamiki i łatwo regulowany próg umożliwiają profilowanie gatunków o niskiej liczebności, takich jak tRNA związane z polisomami, po prostu poprzez wydłużenie czasu ekspozycji matrycy9. Po początkowej inwestycji w niezbędny sprzęt koszt eksploatacji na próbkę, w tym materiały eksploatacyjne, wynosi średnio 15 USD za próbkę.
SPOt ma zastosowanie do każdego organizmu, którego genom jest dostępny do zaprojektowania sondy. Organizmy modelowe hodowane in vitro są idealnymi kandydatami do znakowania metabolicznego. Ponieważ genomy ssaków często kodują wiele izodekoderów (tRNA, które mają identyczne antykodony, ale wykazują niewielkie różnice w sekwencjach ciała), sondy muszą być częściowo zdegenerowane, aby zachować jednorodną hybrydyzację bliskich gatunków tRNA. Wreszcie, przylegające komórki ssaków dają zazwyczaj mniejsze ilości całkowitego RNA w porównaniu z organizmami hodowanymi w zawiesinie, takimi jak M. smegmatis, więc hodowle muszą być znacznie zwiększone.

Poziomy komórkowego tRNA zmieniają się w zależności od warunków takich jak typ komórki, środowisko i stres1,2,3. SPOt, Streamlined Platform for Observing tRNA, to oryginalna, niezawodna i prosta technika, która umożliwia szybkie i precyzyjne określanie ilościowe poziomów transferowego RNA w organizmach hodowanych w laboratorium.
tRNA mają niezwykle stabilne struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe4. Wyświetlają również liczne modyfikacje potranskrypcyjne5. Cechy te reprezentują znaczące strukturalne i sekwencyjne przeszkody, stronnicze lub czasami uniemożliwiające bezpośrednie i powtarzalne profilowanie tRNA przy użyciu standardowych wzorcowych technik kwantyfikacji RNA6. Grupy badawcze na całym świecie zostały zmuszone do opracowania kreatywnych, ale często zawiłych technik oceny poziomu komórkowego tRNA. Niektóre z tych metod obejmują: (1) dwuwymiarową elektroforetyczną separację metabolicznie znakowanych tRNA w połączeniu z metodycznym przypisywaniem miejsca za pomocą Northern blot1; (2) indywidualna kwantyfikacja metodą Northern blot przy użyciu starannie standaryzowanych radioaktywnych sond DNA7; (3) znakowanie po ekstrakcji fluorochromami cyjaninowymi, a następnie analiza mikromacierzy<klasa sup = "xref">3 oraz (4) usuwanie in vitro modyfikacji tRNA przy użyciu rekombinowanych enzymów demodyfikacyjnych w połączeniu z odwrotną transkrypcją i późniejszym sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości<klasa sup = "xref">8.
SPOt to prosta i oryginalna kombinacja dwóch standardowych i nieskomplikowanych podejść: (1) znakowanie ciała RNA, które polega na syntezie, w rosnących organizmach, radioaktywnych całkowitych RNA i (2) makromacierz tRNA, systematyczne i zminiaturyzowane narzędzie genomiczne zoptymalizowane pod kątem segregacji tRNA.
Próbki są przesyłane z żywych organizmów do platformy kwantyfikacji. Są one bezpośrednio analizowane po ekstrakcji i nie są dalej przetwarzane, co znacznie ogranicza odchylenia w porównaniu z technikami wymagającymi amplifikacji po ekstrakcji lub zabiegów enzymatycznych. SPOt jest wszechstronny i można go łatwo połączyć z frakcjonowaniem polisomów w celu identyfikacji i ilościowego określenia subpopulacji tRNA, które są fizycznie związane z translacją rybosomów.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem Mycobacterium smegmatis, a także został z powodzeniem wykorzystany do profilowania tRNA u Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, myszy i hodowle komórek ludzkich11.

<table><tbody><tr><td>System indeksowania szkieł</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Replikator prowadnic szklanych</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy system indeksowania mikropłytek</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Stacja do mycia i osuszania</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do sworzni replikatora</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka powlekane aminą</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydyzator / Zautomatyzowana stacja hybrydyzacji i mycia</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętka rurki 2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>Tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane 0,5 mm</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini młyn do kulek</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie sita fosforowego</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimager</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td>Idt</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Środek sieciujący UV</td><td>Spectroline</td><td>Select series 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka mikromacierzowa</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Igły jednorazowego użytku</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Środek strącający (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 bulion</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemicals</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td> Kaseta do hybrydyzacji <td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia o spektrum</td><td>albumin</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td> <td>Odczynniki Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Bufor fosforanowy pH 7,2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych rna za pomocą płaszczek macroarray

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transferowe RNA (tRNA) to obfite krótkie niekodujące gatunki RNA, które zazwyczaj mają długość od 76 do 90 nukleotydów. tRNA są bezpośrednio odpowiedzialne za syntezę białek poprzez translację kodonów w mRNA na sekwencje aminokwasów. tRNA przez długi czas były uważane za cząsteczki porządkowe, które nie pełniły funkcji regulacyjnych. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na to, że poziomy tRNA w komórkach wahają się w zależności od różnych warunków, takich jak typ komórki, środowisko i stres. Fluktuacja ekspresji tRNA bezpośrednio wpływa na translację genów, sprzyjając lub hamując ekspresję poszczególnych białek. Ostateczne zrozumienie dynamiki syntezy białek wymaga opracowania metod zdolnych do dostarczania wysokiej jakości profili tRNA. Metoda, którą tutaj prezentujemy, nosi nazwę SPOt, co oznacza Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt składa się z trzech etapów, począwszy od znakowania metabolicznego kultur komórkowych radioaktywnym ortofosforanem, następnie ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem radioaktywnych całkowitych RNA, a na końcu hybrydyzacja na drukowanych we własnym zakresie makromacierzach. Poziomy tRNA szacuje się poprzez ilościowe określenie intensywności radioaktywności w każdym punkcie sondy. W przedstawionym tutaj protokole profilujemy tRNA w Mycobacterium smegmatis mc2155, niepatogennej bakterii często wykorzystywanej jako organizm modelowy do badania gruźlicy.

Trzy niezależne powtórzenia biologiczne wykazują, że w badanych warunkach wzrostu wszystkie tRNA M. smegmatis są ekspresjonowane powyżej poziomu tła (Rycina 1). W tym konkretnym eksperymencie obserwowane odchylenie standardowe dla każdej sondy mieści się w przedziale od 2% (Arg (TCT)) do 22% (Cys (GCA)), przy medianie wynoszącej 5% (Rycina 1). Błędne zmiany między powtórzeniami są w znacznym stopniu zależne od takich czynników, jak przygotowanie macierzy i hybrydyzacja. Wysoką powtarzalność osiągnięto dzięki starannemu i spójnemu nanoszeniu macierzy oraz zautomatyzowanej hybrydyzacji próbek. Różnica między tRNA Ile (GAT) a tRNA Val (TAC) – odpowiednio najliczniejszym i najrzadszym gatunkiem – wynosi 5-krotność. Metoda SPOt pokazuje, że ekspresja izoakceptorów tRNA nie jest jednorodna. Izoakceptory to gatunki, które wiążą ten sam aminokwas, lecz posiadają różne sekwencje antykodonów, a tym samym dekodują różne kodony w mRNA. Na przykład wszystkie izoakceptory alaniny są ekspresjonowane na podobnym poziomie, podczas gdy różnica między najwyżej i najniżej ekspresjonowanymi tRNA akceptującymi argininę jest 3-krotna.
<img alt="wyniki mikroarray wiązania tRNA; analiza plamek tRNA; wykres słupkowy porównujący M. smegmatis, M. musculus, H. sapiens." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki makroarray tRNA. (A) Zeskanowane makroarray bakterii, myszy i człowieka. Tablice dla M. smegmatis wykorzystują tylko 43 sondy zamiast 48 w przypadku myszy i człowieka. W konsekwencji tablica bakteryjna wykazuje 40 pustych plamek (sondy są powtórzone ośmiokrotnie na każdej tablicy), które zlewają się z tłem. Większość z nich skupiona jest w lewym górnym rogu. (B) Przedstawienie profilu tRNA w M. smegmatis w optymalnych warunkach wzrostu w formie histogramu i mapy ciepła. Sygnały z sond stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów (obejmujących wzrost bakterii, znakowanie metaboliczne, ekstrakcję i hybrydyzację z tablicą) i są wyrażone jako wartości na tysiąc całkowitej liczby tRNA. Odchylenia standardowe dla trzech powtórzeń są zaznaczone jako słupki błędów na histogramie oraz odcienie pomarańczowego na mapie ciepła. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesny pomiar poziomów komórkowych wszystkich transferowych RNA w próbkach biologicznych poprzez połączenie znakowania metabolicznego in vivo z analizą makromacierzową. Transferowe RNA przez długi czas były uważane za cząsteczki porządkowe, które nie pełniły funkcji regulacyjnych. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że poziomy tRNA w komórkach zmieniają się w odpowiedzi na różne warunki, takie jak typ komórki, środowisko i stres.Fluktuacja ekspresji tRNA bezpośrednio wpływa na translację genów, sprzyjając lub hamując ekspresję poszczególnych białek. Zrozumienie dynamiki syntezy białek wymaga metod zdolnych do dostarczenia wysokiej jakości profili tRNA. Przedstawiamy tutaj niezawodną i prostą technikę, która umożliwia szybkie i precyzyjne określenie ilościowe poziomów transferowego RNA w organizmach hodowanych w laboratorium.Na początek za pomocą igły o rozmiarze 18 umieść pojedynczy otwór w środku nasadki sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Następnie, za pomocą pięciu mikrolitrów Mycobacterium smegmatis z nocnej kultury starterowej, zaszczepić 500 mikrolitrów uzupełnionego sterylnego bulionu 7H9. Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami ochrony przed promieniowaniem, należy nabić pożywkę hodowlaną 20 mikrokiurami na mililitr ortofosforanu znakowanego fosforem-32.Hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 1 200 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką umieszczonym za akrylową osłoną o grubości dziewięciu milimetrów. W fazie midlog przenieś całą kulturę do dwumililitrowej probówki z nakrętką i osadzaj radioaktywne bakterie w temperaturze pokojowej, wirując przy 10 000 razy większej grawitacji przez dwie minuty. Zebrać supernatant zawierający niezmieszany radioaktywny ortofosforan do odpowiedniego pojemnika na odpady.Aby przygotować całkowite RNA, dodaj jeden mililitr komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA i około 200 mikrolitrów szklanych kulek do osadu. Bezpiecznie zakryj probówkę i rozbij bakterie w homogenizatorze pod maksymalnym mieszaniem przez dwie minuty. Odwirować próbkę w temperaturze 12 000 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i odpowiednio wyrzuć kulki. Dodaj 0,2 mililitra chloroformu i energicznie potrząsaj probówką ręcznie przez 15 sekund. Następnie odwiruj próbkę pod ciśnieniem 12 000 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Pobrać fazę wodną próbki do nowej probówki, ustawiając probówkę pod kątem 45 stopni. Unikaj rysowania jakiejkolwiek warstwy interfazowej lub organicznej. Do fazy wodnej dodać dwa mikrolitry kolorowego środka strącającego i 0,5 mililitra 100% izopropanolu.Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez pięć sekund i ponownie odwiruj. Usunąć supernatant z probówki i odpowiednio go wyrzucić, ponieważ frakcja ciekła może zawierać śladowe ilości promieniotwórczości. Następnie, po wysuszeniu pelety na powietrzu przez pięć minut, ponownie zawieś je w 200 mikrolitrach 2X SSC o wadze 0,1% na objętość SDS.Korzystając z genomowej bazy danych tRNA, zaprojektuj sondy DNA, najpierw pobierając sekwencje tRNA lub geny kodujące tRNA. Po przycięciu konserwatywnych trzech głównych końców CCA, jeśli są zakodowane, i wygenerowaniu odwrotnego dopełniacza, zamów sondy na podstawie pierwszych 70 nukleotydów. Aby przeprowadzić drukowanie matrycowe, rozmrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej.Za pomocą pisaka diamentowego oznacz szkiełka pokryte aminą. Następnie umieść szkiełka w jednostce indeksującej. Podążając za rozmieszczeniem siatki, ostrożnie zanurz kołki replikatora w studzienkach.Używając minimalnego nacisku, delikatnie wydrukuj matrycę na szklanych szkiełkach. Kontynuuj drukowanie bez czyszczenia macierzy, dopóki nie skończysz z blokiem A.It wymaga trochę praktyki, aby móc drukować konsekwentnie. Zalecamy drukowanie nie więcej niż ośmiu do 10 tablic na sesję.Policz od 10 do 15 minut na tablicę. Łatwo jest stracić kontrolę nad kolejnością wzorów drukowania, więc poświęć całą swoją uwagę na zadanie i wyłącz wszelkie rozpraszacze. Gdy będziesz gotowy do przejścia do następnego bloku, zanurz replikator w 5% wybielaczu i delikatnie wstrząśnij.Wcisnąć replikator w chłonny papier. Następnie zanurz replikator w wodzie destylowanej, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier. Powtórz ten krok raz.Następnie zanurz replikator w izopropanolu, delikatnie wstrząśnij i wciśnij go w papier. Wysuszyć replikator na wentylatorze przez około 20 sekund przed przejściem do następnego bloku płytki 96-dołkowej. Kontynuuj do żądanej liczby wydruków.Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia. Umieść wysuszone szkiełka stroną zadrukowaną do góry na czystej powierzchni w 254-nanometrowym urządzeniu sieciującym UV. Ustaw poziom energii na 999 990 mikrodżuli na centymetr kwadratowy, a następnie naciśnij start.Przenieś matryce do 450 mililitrów roztworu blokującego i inkubuj je w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym, pod powolnym mieszaniem przez noc. Umyj szkiełka w 500 mililitrach wody destylowanej o temperaturze pokojowej, dwa razy po pięć minut każde. Wysuszyć szkiełka, wirując w wirówce z mikromatrycą w temperaturze pokojowej przez 10 sekund.Przechowuj tablice w suchym i ciemnym miejscu przez okres do sześciu miesięcy. Przed hybrydyzacją opłucz szkiełka we wrzącej wodzie i wysusz je przez odwirowanie. Umieść macierz w kasecie hybrydyzacyjnej i załaduj próbkę RNA znakowaną radioizotopem.Próbki należy uruchomić na zautomatyzowanej stacji hybrydyzująco-myjącej, aby uzyskać maksymalną powtarzalność zgodnie z protokołem tekstowym. Pod koniec cyklu wysuszyć szkiełka przez odwirowanie. Owiń slajdy cienkim plastikiem.Następnie użyj licznika Geigera na jego najbardziej czułym ustawieniu, aby sprawdzić szkiełka pod kątem sygnału radioaktywnego. Umieść slajdy na ekranie luminoforowym do przechowywania w kasecie naświetlającej w temperaturze pokojowej przez 10 do 90 godzin, w zależności od siły sygnału. Czas ekspozycji, który może trwać od kilku godzin do kilku dni, zależy bezpośrednio od sygnału matrycy.Potrzeba trochę wprawy, aby móc przeliczyć zliczenia na liczniku Geigera na czas ekspozycji. Zeskanuj szkiełko w rozdzielczości 50 mikrometrów za pomocą luminowizora. Określ ilościowo i odejmij intensywność radioaktywności w każdym punkcie sondy za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ zaktualizowanego o profiler mikromacierzy.Generuj mapy cieplne zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazane tutaj są zeskanowane makromacierze bakteryjne, mysie i ludzkie. Macierze M.smegmatis używają tylko 43 sond zamiast 48 używanych dla myszy i ludzi.W rezultacie matryca bakteryjna wyświetla 40 pustych miejsc, które zlewają się z tłem. Trzy niezależne kontrpróby biologiczne pokazują, że w badanych warunkach wzrostu wszystkie tRNA M.smegmatis ulegają ekspresji powyżej poziomu tła. W tym konkretnym eksperymencie obserwowane odchylenie standardowe dla każdej sondy wynosi od 2% Argininy TCT do 22% Cysteiny GCA z medianą na poziomie 5%Ponadto eksperyment ten pokazuje, że ekspresja izoakceptorów tRNA nie jest jednolita.Na przykład wszystkie izoakceptory alaniny ulegają ekspresji na podobnych poziomach, podczas gdy najwyższe i najniższe tRNA akceptujące argininę różnią się trzykrotnie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo i jeśli sygnał punktowy jest odpowiedni. Nasza metoda ma zastosowanie do wszystkich organizmów, których genom jest dostępny do zaprojektowania sondy.Organizmy modelowe hodowane in vitro są idealnymi kandydatami do znakowania metabolicznego. Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem Mycobacterium smegmatis, ale z powodzeniem zastosowano go również do profilowania tRNA w E. coli, drożdżach, myszach i ludzkich komórkach hodowlanych. Nasza technika jest powtarzalna i specyficzna.Duży zakres dynamiki i łatwo regulowany próg umożliwiają profilowanie gatunków o niskiej liczebności, takich jak tRNA związane z polisomami, po prostu poprzez wydłużenie czasu ekspozycji matrycy.

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Użycie tiolowanego uracylu do wrażliwego i specyficznego oczyszczania nowo przepisanego RNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metodę SPOt do szybkiego profilowania poziomów tRNA w próbkach biologicznych przy użyciu znakowania metabolicznego i analizy makromacierzowej. Technika umożliwia pomiar wszystkich tRNA w ciągu 24 godzin.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Przeglądaj więcej filmów