Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesny pomiar poziomów komórkowych wszystkich transferowych RNA w próbkach biologicznych poprzez połączenie znakowania metabolicznego in vivo z analizą makromacierzową. Transferowe RNA przez długi czas były uważane za cząsteczki porządkowe, które nie pełniły funkcji regulacyjnych. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że poziomy tRNA w komórkach zmieniają się w odpowiedzi na różne warunki, takie jak typ komórki, środowisko i stres.

Fluktuacja ekspresji tRNA bezpośrednio wpływa na translację genów, sprzyjając lub hamując ekspresję poszczególnych białek. Zrozumienie dynamiki syntezy białek wymaga metod zdolnych do dostarczenia wysokiej jakości profili tRNA. Przedstawiamy tutaj niezawodną i prostą technikę, która umożliwia szybkie i precyzyjne określenie ilościowe poziomów transferowego RNA w organizmach hodowanych w laboratorium.

Na początek za pomocą igły o rozmiarze 18 umieść pojedynczy otwór w środku nasadki sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Następnie, za pomocą pięciu mikrolitrów Mycobacterium smegmatis z nocnej kultury starterowej, zaszczepić 500 mikrolitrów uzupełnionego sterylnego bulionu 7H9. Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami ochrony przed promieniowaniem, należy nabić pożywkę hodowlaną 20 mikrokiurami na mililitr ortofosforanu znakowanego fosforem-32.

Hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 1 200 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką umieszczonym za akrylową osłoną o grubości dziewięciu milimetrów. W fazie midlog przenieś całą kulturę do dwumililitrowej probówki z nakrętką i osadzaj radioaktywne bakterie w temperaturze pokojowej, wirując przy 10 000 razy większej grawitacji przez dwie minuty. Zebrać supernatant zawierający niezmieszany radioaktywny ortofosforan do odpowiedniego pojemnika na odpady.

Aby przygotować całkowite RNA, dodaj jeden mililitr komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA i około 200 mikrolitrów szklanych kulek do osadu. Bezpiecznie zakryj probówkę i rozbij bakterie w homogenizatorze pod maksymalnym mieszaniem przez dwie minuty. Odwirować próbkę w temperaturze 12 000 razy większej niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i odpowiednio wyrzuć kulki. Dodaj 0,2 mililitra chloroformu i energicznie potrząsaj probówką ręcznie przez 15 sekund. Następnie odwiruj próbkę pod ciśnieniem 12 000 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Pobrać fazę wodną próbki do nowej probówki, ustawiając probówkę pod kątem 45 stopni. Unikaj rysowania jakiejkolwiek warstwy interfazowej lub organicznej. Do fazy wodnej dodać dwa mikrolitry kolorowego środka strącającego i 0,5 mililitra 100% izopropanolu.

Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez pięć sekund i ponownie odwiruj. Usunąć supernatant z probówki i odpowiednio go wyrzucić, ponieważ frakcja ciekła może zawierać śladowe ilości promieniotwórczości. Następnie, po wysuszeniu pelety na powietrzu przez pięć minut, ponownie zawieś je w 200 mikrolitrach 2X SSC o wadze 0,1% na objętość SDS.

Korzystając z genomowej bazy danych tRNA, zaprojektuj sondy DNA, najpierw pobierając sekwencje tRNA lub geny kodujące tRNA. Po przycięciu konserwatywnych trzech głównych końców CCA, jeśli są zakodowane, i wygenerowaniu odwrotnego dopełniacza, zamów sondy na podstawie pierwszych 70 nukleotydów. Aby przeprowadzić drukowanie matrycowe, rozmrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej.

Za pomocą pisaka diamentowego oznacz szkiełka pokryte aminą. Następnie umieść szkiełka w jednostce indeksującej. Podążając za rozmieszczeniem siatki, ostrożnie zanurz kołki replikatora w studzienkach.

Używając minimalnego nacisku, delikatnie wydrukuj matrycę na szklanych szkiełkach. Kontynuuj drukowanie bez czyszczenia macierzy, dopóki nie skończysz z blokiem A.It wymaga trochę praktyki, aby móc drukować konsekwentnie. Zalecamy drukowanie nie więcej niż ośmiu do 10 tablic na sesję.

Policz od 10 do 15 minut na tablicę. Łatwo jest stracić kontrolę nad kolejnością wzorów drukowania, więc poświęć całą swoją uwagę na zadanie i wyłącz wszelkie rozpraszacze. Gdy będziesz gotowy do przejścia do następnego bloku, zanurz replikator w 5% wybielaczu i delikatnie wstrząśnij.

Wcisnąć replikator w chłonny papier. Następnie zanurz replikator w wodzie destylowanej, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier. Powtórz ten krok raz.

Następnie zanurz replikator w izopropanolu, delikatnie wstrząśnij i wciśnij go w papier. Wysuszyć replikator na wentylatorze przez około 20 sekund przed przejściem do następnego bloku płytki 96-dołkowej. Kontynuuj do żądanej liczby wydruków.

Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia. Umieść wysuszone szkiełka stroną zadrukowaną do góry na czystej powierzchni w 254-nanometrowym urządzeniu sieciującym UV. Ustaw poziom energii na 999 990 mikrodżuli na centymetr kwadratowy, a następnie naciśnij start.

Przenieś matryce do 450 mililitrów roztworu blokującego i inkubuj je w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym, pod powolnym mieszaniem przez noc. Umyj szkiełka w 500 mililitrach wody destylowanej o temperaturze pokojowej, dwa razy po pięć minut każde. Wysuszyć szkiełka, wirując w wirówce z mikromatrycą w temperaturze pokojowej przez 10 sekund.

Przechowuj tablice w suchym i ciemnym miejscu przez okres do sześciu miesięcy. Przed hybrydyzacją opłucz szkiełka we wrzącej wodzie i wysusz je przez odwirowanie. Umieść macierz w kasecie hybrydyzacyjnej i załaduj próbkę RNA znakowaną radioizotopem.

Próbki należy uruchomić na zautomatyzowanej stacji hybrydyzująco-myjącej, aby uzyskać maksymalną powtarzalność zgodnie z protokołem tekstowym. Pod koniec cyklu wysuszyć szkiełka przez odwirowanie. Owiń slajdy cienkim plastikiem.

Następnie użyj licznika Geigera na jego najbardziej czułym ustawieniu, aby sprawdzić szkiełka pod kątem sygnału radioaktywnego. Umieść slajdy na ekranie luminoforowym do przechowywania w kasecie naświetlającej w temperaturze pokojowej przez 10 do 90 godzin, w zależności od siły sygnału. Czas ekspozycji, który może trwać od kilku godzin do kilku dni, zależy bezpośrednio od sygnału matrycy.

Potrzeba trochę wprawy, aby móc przeliczyć zliczenia na liczniku Geigera na czas ekspozycji. Zeskanuj szkiełko w rozdzielczości 50 mikrometrów za pomocą luminowizora. Określ ilościowo i odejmij intensywność radioaktywności w każdym punkcie sondy za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ zaktualizowanego o profiler mikromacierzy.

Generuj mapy cieplne zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazane tutaj są zeskanowane makromacierze bakteryjne, mysie i ludzkie. Macierze M.smegmatis używają tylko 43 sond zamiast 48 używanych dla myszy i ludzi.

W rezultacie matryca bakteryjna wyświetla 40 pustych miejsc, które zlewają się z tłem. Trzy niezależne kontrpróby biologiczne pokazują, że w badanych warunkach wzrostu wszystkie tRNA M.smegmatis ulegają ekspresji powyżej poziomu tła. W tym konkretnym eksperymencie obserwowane odchylenie standardowe dla każdej sondy wynosi od 2% Argininy TCT do 22% Cysteiny GCA z medianą na poziomie 5%Ponadto eksperyment ten pokazuje, że ekspresja izoakceptorów tRNA nie jest jednolita.

Na przykład wszystkie izoakceptory alaniny ulegają ekspresji na podobnych poziomach, podczas gdy najwyższe i najniższe tRNA akceptujące argininę różnią się trzykrotnie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo i jeśli sygnał punktowy jest odpowiedni. Nasza metoda ma zastosowanie do wszystkich organizmów, których genom jest dostępny do zaprojektowania sondy.

Organizmy modelowe hodowane in vitro są idealnymi kandydatami do znakowania metabolicznego. Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem Mycobacterium smegmatis, ale z powodzeniem zastosowano go również do profilowania tRNA w E. coli, drożdżach, myszach i ludzkich komórkach hodowlanych. Nasza technika jest powtarzalna i specyficzna.

Duży zakres dynamiki i łatwo regulowany próg umożliwiają profilowanie gatunków o niskiej liczebności, takich jak tRNA związane z polisomami, po prostu poprzez wydłużenie czasu ekspozycji matrycy.