Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie, w jaki sposób zmienia się poziom endogennych fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych w ipecac. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z regeneracją tkanek w kole kultur tkankowych roślin. Główną zaletą tej techniki jest endogenny poziom kwasu indolo-3-octowego, a cytokininy można po prostu analizować z dużą czułością.

Implikacje tej techniki rozciągają się na całe tworzenie się zwyrodnienia tkanki roślinnej, ponieważ zmiany poziomu endogennych fitohormonów wywołują przypadkowe tworzenie pędów. Na początek przygotuj pożywkę B5 bez fitohormonów i dodaj 0,2 procent gumy gellan. Następnie przeprowadź pożywkę w autoklawie, aby ją wysterylizować.

Za pomocą skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej pokrój osiem milimetrowych segmentów międzywęzłowych sadzonek ipecac i umieść je na podłożu. Następnie hoduj segmenty ipecac w temperaturze 24 stopni Celsjusza poniżej 15 mikromoli na metr kwadratowy sekundy światła w 14-godzinnym jasnym, 10-godzinnym cyklu ciemności przez pięć tygodni. Po wyhodowaniu segmentów ipecac zidentyfikuj regiony od jednego do czwartego w każdym segmencie.

Raz w tygodniu użyj mikroskopu, aby policzyć liczbę pędów przybyszowych w każdym regionie. Najpierw umieść pięciomilimetrowy koralik cyrkonu w czterech dwumililitrowych probówkach na próbki. Następnie użyj skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej, aby pociąć segmenty ipecac na obszary od I do IV. Następnie zbierz osiem segmentów z każdego regionu do jednej probówki z próbką.

Zważyć każdą z próbek i zamrozić ją w ciekłym azocie. Następnie użyj homogenizatora na bazie kulek, aby zmiażdżyć zamrożone próbki. Za pomocą mieszalnika wirowego zawiesić próbki w jednym mililitrze acetonitrylu z 500 pikogramami każdego wzorca wewnętrznego wołów i CK.

Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. A następnie odwirować próbki o sile 3500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj granulkę w 80-procentowym nitrylu acetalowym z jednym procentem kwasu octowego.

Następnie powtórzyć wirowanie i użyć jednorazowej probówki do połączenia supernatantów. Do połączonego supernatantu dodać 600 mikrolitrów wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby odparować nitryl acetalowy.

Załaduj roztwory próbek do indywidualnych zrównoważonych wkładów HLB. I umyj wkłady jednym mililitrem wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie nawiąż do wszystkich hormonów z dwoma mililitrami 80-procentowego acetylowo-nitrylowego z jednym procentem kwasu octowego w szklanej probówce.

Za pomocą koncentratora próżniowego odparować nitryl octowy, aby uzyskać ekstrakt w wodzie z jednym procentem kwasu octowego. Załaduj roztwory próbek do indywidualnych zrównoważonych wkładów MCX i umyj wkłady jednym mililitrem wody z jednoprocentowym kwasem octowym. Następnie nawiąż do IAA w szklanej probówce, z dwoma mililitrami 30-procentowego nitrylu acetalowego z jednym procentem kwasu octowego.

Następnie umyj wkłady dwoma mililitrami 80-procentowego nitrylu octowego z jednym procentem kwasu octowego. Następnie umyj wkłady dwoma mililitrami wody i jednym mililitrem wody z pięcioprocentowym wodnym roztworem amoniaku w komorze ciągu. Nawiąż do CK w szklanej probówce z dwoma mililitrami 60-procentowego nitrylu acetalowego z pięcioprocentowym wodnym roztworem amoniaku w komorze ciągu.

Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby odparować rozpuszczalnik każdej frakcji hormonu. Mieszaj próbki w temperaturze minus trzydziestu stopni Celsjusza do analizy LCMSMS. Najpierw rozpuść każdy ekstrakt hormonalny w tubce z 600 mikrolitrami metanolu.

Następnie przenieść roztwór do fiolki z całkowitą odzyskiem z gwintowaną szyjką i użyć koncentratora próżniowego do odparowania rozpuszczalnika. Frakcję IAA rozpuścić w 20 mikrolitrach 30-procentowego nitrylu acetalowego, a frakcje CK w 20 mikrolitrach wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie użyj potrójnego kwadrupolowego systemu MS wyposażonego w system HPLC do analizy próbek w trybie jonów dodatnich.

Na koniec określić ilościowo endogenne IAA w poziomach CK w stosunku do krzywej standardowej stosunku wzorców znakowanych nieznakowanych do deuteru. W tym protokole endogenną oksydacyjną cytokininę w zsypach przybyszowych mierzono za pomocą LCMSMS przez pięć tygodni. W pierwszym tygodniu nie utworzyły się żadne przypadkowe zsypy, a pierwsze małe zsypy pojawiły się w drugim tygodniu.

W trzecim i czwartym tygodniu liczba zsypów zwiększyła się głównie w regentach pierwszym i drugim. W piątym tygodniu liczba zsypów wynosiła około siedmiu w regionie pierwszym i pięciu w regionie drugim. Przed kulturą poziom IAA był nieco wyższy w regionie pierwszym niż w regionie drugim, trzecim i czwartym.

W pierwszym tygodniu poziom IAA znacznie wzrósł w regionie czwartym i nieznacznie spadł w regionie pierwszym, drugim i trzecim. Po pięciu tygodniach hodowli pojawił się gradient stężeń IAA. Z poziomami rosnącymi od regionu pierwszego do regionu czwartego.

Przed hodowlą większość CK wykazywała tylko śladowe poziomy. W pierwszym tygodniu poziom tZR wzrósł do 13,8 pikogramów na miligram w regionie drugim. I 18,1 pikogramów na miligram w regionie trzecim.

Natomiast poziomy tZ, iP i iPR zmieniły się tylko nieznacznie podczas hodowli. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że hormony endogennej części są stabilne. Po opracowaniu przez człowieka, technika ta toruje drogę badaczom w dziedzinie hodowli tkanek roślinnych.

Badanie powstawania przybyszowego w innych organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować endogenny kwas indolo-3-octowy i cytokininy.