Name: Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej ipecac przy użyciu LC-MS/MS. Ta technika umożliwia analizę fitohormonów z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Panu Akirze Murakamiemu z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Toyo oraz Panu Koudai Taniguchi z Centrum Technologii Rolniczych Gunma za ich pomoc techniczną. Jesteśmy również wdzięczni profesorowi Shosaku Kashiwada i dr Umie Maheswari Rajagopalan z Uniwersytetu Toyo za ich sugestie. Badanie to było częściowo wspierane przez Centrum Badawcze Nauk o Życiu i Środowisku Uniwersytetu Toyo.

Uwaga: Ipecac (C. ipecacuanha) został użyty w tym badaniu, ponieważ ułatwia analizę endogennych fitohormonów.
1. Warunki wzrostu do wywołania przypadkowych pędów Ipecac
<ol>
	<li>Przygotuj wolne od fitohormonów podłoże B5 dostosowane do pH 5,710 i dodaj 0,2% gumy gellan. Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Wlać 25 ml autoklalawowanej pożywki na sterylną szalkę Petriego (90 mm × 20 mm).</li>
	<li>Wytnij 8-milimetrowe segmenty międzywęzłowe sadzonek ipecac za pomocą skalpela chirurgicznego z ostrzem nr 22 na sterylnej płytce akrylowej i umieść na podłożu (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Hodowla na pożywce B5 wolnej od fitohormonów w temperaturze 24 °C w temperaturze 15 μmol m−2 s−1 światła w 14-godzinnym cyklu światła/10-godzinnym ciemnym cyklu przez 5 tygodni.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszary od I (wierzchołkowe) do IV (podstawowe) w każdym segmencie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Raz w tygodniu policz pod mikroskopem liczbę pędów przybyszowych > długości 0,3 mm w każdym regionie.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja i oczyszczanie fitohormonów
<ol>
	<li>Umieść kulkę cyrkonu o średnicy 5 mm w każdej z czterech probówek na próbki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Pokrój segmenty na obszary od I do IV (każdy o długości 2 mm) za pomocą skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej.</li>
	<li>Zebrać osiem segmentów każdego regionu w oddzielnych probówkach na próbki (10-30 mg świeżej masy).</li>
	<li>Zważyć, a następnie zamrozić próbki w ciekłym azocie.</li>
	<li>Rozdrobnić zamrożone próbki za pomocą homogenizatora na bazie kulek.</li>
	<li>Zawiesić rozdrobnione próbki w 1 ml acetonitrylu zawierającym 500 pg każdego wewnętrznego wzorca auksyny i CK (d5-IAA, d 5-tZ, d5-tZR, d6-iP, d6-iPR) za pomocą mieszalnika wirowego.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie odwirować w temperaturze 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć osad w 80% (v/v) acetonitrylu zawierającym 1% (v/v) kwas octowy. Ponownie odwirować przy 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć supernatanty (z etapów 2.7 i 2.8) w jednorazowej szklanej probówce.</li>
	<li>Dodać 600 μl wody zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego do każdego połączonego supernatantu i odparować acetonitryl za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Zrównoważyć wkłady kolumny hydrofilowo-lipofilowej (HLB), nakładając po 1 ml acetonitrylu, metanolu i wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.</li>
	<li>Nałożyć jeden roztwór próbki na zrównoważony wkład HLB.</li>
	<li>Umyć wkłady 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.</li>
	<li>Eluować wszystkie hormony za pomocą 2 ml 80% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego w szklanej probówce.</li>
	<li>Odparować acetonitryl w eluacie w celu otrzymania ekstraktu w wodzie zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego za pomocą koncentratora próżniowego. 
	UWAGA: Nie susz tego całkowicie.</li>
	<li>Zrównoważyć wkłady kolumnowe z mocną kationowymiennością w trybie mieszanym (MCX), stosując 1 ml acetonitrylu, 1 ml metanolu, 0,5 ml 0,1 M HCl i 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.</li>
	<li>Nałożyć jeden roztwór próbki na zrównoważony wkład MCX.</li>
	<li>Umyć wkłady 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.</li>
	<li>Elute IAA za pomocą 2 ml 30% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego w szklanej probówce.</li>
	<li>Umyć wkłady 2 ml 80% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego.</li>
	<li>Umyj wkłady 2 ml wody i 1 ml wody zawierającej 5% wodnego roztworu amoniaku.</li>
	<li>Eluować CK za pomocą 2 ml 60% (v/v) acetonitrylu zawierającego 5% wodnego amoniaku w szklanej probówce.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik każdej frakcji hormonalnej za pomocą koncentratora próżniowego i przechowywać w temperaturze -30 °C do czasu analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
3. Analiza LC-MS/MS dla IAA i CK
<ol>
	<li>Rozpuścić każdy ekstrakt hormonalny w probówce z 600 μl metanolu i przenieść roztwór do fiolki z zakręcaną szyjką do całkowitego odzyskiwania. Odparować rozpuszczalnik za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Frakcję IAA rozpuścić w 20 μl 30% (v/v) acetonitrylu, a frakcje CK w 20 μl wody zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego w fiolkach z całkowitym odzyskiem z gwintowaną szyjką.</li>
	<li>Analizuj próbki w trybie jonów dodatnich w systemie MS z potrójnym kwadrupolem wyposażonym w system HPLC. 
	UWAGA: Ustawiamy warunki HPLC zgodnie z tabelą 1.
	<ol>
		<li>Do elucji IAA należy użyć gradientu binarnego 5%-50% rozpuszczalnika B przez 7 minut, następnie zwiększyć o 98% rozpuszczalnika B i przytrzymać przez 1 minutę, a następnie zrównoważyć przez 2 minuty przy 5% rozpuszczalniku B przez wstrzyknięcie gniazda.</li>
		<li>Do elucji CK należy użyć gradientu binarnego 2%-40% rozpuszczalnika B w ciągu 5 minut, 40%-70% rozpuszczalnika B w ciągu 7 minut, następnie zwiększyć o 95% rozpuszczalnika B i utrzymać przez 1 minutę, a następnie zrównoważyć przez 2 minuty przy 2% rozpuszczalniku B przez wstrzyknięcie gniazda.</li>
		<li>Ustawić parametry jonizacji elektronopryskowej (ESI)-MS źródła jonów zgodnie z tabelą 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście do monitorowania wielu reakcji (MRM) należy wykorzystać do oznaczania ilościowego każdego analitu wymienionego w tabeli 3.</li>
	<li>Określ ilościowo endogenne poziomy IAA i CK w stosunku do krzywej wzorcowej stosunku wzorców nieznakowanych do wzorców znakowanych deuterem.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Aby zidentyfikować rozmieszczenie fitohormonów biorących udział w organogenezie, ważne jest użycie materiałów roślinnych, w których organogenezę można zaobserwować na pożywce wolnej od fitohormonów, ponieważ gdy fitohormony są egzogennie stosowane do eksplantatów w celu indukowania pędów lub korzeni, wpływają one na cały eksplant, co utrudnia ocenę wrodzonej plastyczności roślin w różnicowaniu komórek i organogenezie. Pędy przybyszowe można indukować na pożywkach hodowlanych wolnych od fitohormonów u innych gatunków rośl...

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) zaproponował koncepcję "totipotencji", dzięki której komórki roślinne mogą dzielić, różnicować i regenerować całe rośliny, nawet po ich wcześniejszym różnicowaniu w określone typy komórek u dojrzałych roślin1. W kulturach tkankowych o tym, czy można indukować regenerację roślin, decyduje kombinacja i stężenie egzogennie stosowanych fitohormonów w pożywce wzrostowej. Skoog i Miller odkryli, że pędy przybyszowe mogą być indukowane z kalusa tytoniu na pożywce zawierającej wysoki stosunek CK do auksyn, podczas gdy korzenie przybyszowe mogą być indukowane na pożywce o niskim stosunku2. Od czasu tego odkrycia, hodowla tkankowa jest szeroko stosowana do rozmnażania roślin uprawnych o znaczeniu gospodarczym oraz do regeneracji roślin transgenicznych3. Pędy przybyszowe mogą być indukowane z tkanek innych niż merystem wierzchołkowy pędów, takich jak liście, korzenie i międzywęźla. Leczenie fitohormonami jest wymagane do indukcji pędów przybyszowych u większości gatunków roślin. Jednak optymalne stężenia i kombinacje różnią się w zależności od gatunku i tkanek stosowanych jako eksplantaty. W związku z tym wiele wysiłku wkłada się w określenie optymalnych stężeń i kombinacji fitohormonów do eksperymentów.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) to roślina lecznicza, która zawiera alkaloidy, takie jak emetyna i cefalina, głównie w korzeniach4. Ekstrakty z korzeni są używane jako środek wykrztuśny, wymiotny i amebiobójczy5. Chociaż ipecac rośnie naturalnie w tropikalnych lasach deszczowych Brazylii, niechętnie zawiązuje nasiona w kulturze, a szybkość kiełkowania spada podczas przechowywania nasion w Japonii, w chłodniejszym klimacie6. Zamiast tego rozmnaża się go przez hodowlę tkankową, w której najbardziej efektywną metodą jest przypadkowe tworzenie pędów na międzywęźlach7,8. Co ciekawe, pędy przybyszowe mogą być indukowane u tego gatunku bez leczenia fitohormonami8.
Pędy przybyszowe powstają na naskórku w okolicy wierzchołkowej segmentów międzywęzłowych bez modzelenia, ale nie w obszarze podstawnym9. Różnica ta wskazuje na polarność tkanek w segmentach międzywęzłowych, która prawdopodobnie podlega regulacji fitohormonalnej. System hodowli ipecac daje wyjątkową możliwość analizy zmian poziomu endogennych fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych. Tutaj przedstawiamy naszą metodę analizy endogennych poziomów jednej auksyny (kwasu indolo-3-octowego (IAA)) i czterech CK (izopentenyloadenina (iP), rybozyd izopentenylogeniny (iPR), trans-zeatyna (tZ) i rybozyd trans-zeatyny (tZR)) w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5]kwas indolo-3-octowy</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS[</td></tr><tr><td>2H5]trans-zeatin</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]rybozyd trans-zeatyny</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS[</td></tr><tr><td>2H6]N6-izopentenyloadenina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-izopentenyloadenozyna</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>Wewnętrzny wzorzec dla kwasu</td></tr><tr><td>indolo-3-octowego</td> LC-MS/MS <td>WAKO</td><td>098 00181</td><td>norma dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>trans-zeatin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>norma dla rybozydu trans-zeatyny LC-MS/MS</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>norma dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-izopentenyl adenina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>wzorzec dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-izopentenyloadenozyna</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>wzorzec dla LC-MS/MS</td></tr><tr><td>acetonitryl hypergrade dla LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>rozpuszczalnik do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Woda do chromatografii LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>rozpuszczalnik do LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Woda</td><td>WAT094225</td><td>kolumna nabojowa</td></tr><tr><td>Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Woda</td><td>186000252</td><td>kolumna naboju</td></tr> z <tr><td>szyjką fiolka do całkowitego odzyskiwania</td><td>Wody</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>niebieskie, 12 x 32 mm nakrętka z szyjką i przegrodą PTFE/silikon</td><td>Wody</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm</td><td>Woda</td><td>186002350</td><td>kolumna UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>Kolumna UPLC</td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Pióro</td><td>nr 22</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Feather</td><td>No. 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Separator pary z fregeracją</td><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td></tr><tr><td>Jednorazowa szklana toczka (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej ipecac

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Przypadkowe tworzenie pędów jest ważną techniką dla rozmnażania ważnych ekonomicznie roślin uprawnych i dla regeneracji roślin transgenicznych. Leczenie fitohormonami jest wymagane do indukcji pędów przybyszowych u większości gatunków. To, czy można indukować pędy przybyszowe, zależy od równowagi między poziomami auksyny i cytokininy (CK). Wiele wysiłku wkłada się w określenie optymalnych stężeń i kombinacji fitohormonów w każdej tkance używanej jako eksplantaty i w każdym gatunku rośliny. Jednak w ipecac pędy przybyszowe można indukować na segmentach międzywęzłowych w pożywce hodowlanej bez leczenia fitohormonami. Pozwala to na ocenę wrodzonej plastyczności ipecac dla różnicowania komórek. Aby wywołać pędy przybyszowe w ipecac, hodowaliśmy segmenty międzywęzłowe w temperaturze 24 °C pod 15 μmol m−2 s−1 światła w 14-godzinnym cyklu świetlnym/10-godzinnym cyklu ciemnym na wolnym od fitohormonów podłożu B5 zestalonym z 0,2% gumy gellan przez 5 tygodni. Aby zbadać dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przypadkowych, zmierzyliśmy endogenny kwas indolo-3-octowy i CK w segmentach za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas LC-MS / MS. Metoda ta pozwala w prosty sposób na analizę poziomu endogennego kwasu indolo-3-octowego i CKs. Może być stosowany do badania dynamiki endogennej auksyny i CK podczas organogenezy u innych gatunków roślin.

W 1.st tygodniu nie uformowały się żadne pędy przybyszowe. W 2.nd tygodniu pojawiły się małe pędy. W 3.rd i 4.th tygodniu liczba pędów wzrosła, głównie w obszarach apikalnych (I i II) (Rysunek 2A). W 5.th tygodniu liczba pędów wynosiła około 7 w obszarze I i 5 w obszarze II (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do tego, w obszarach III i IV uformow...

Pędy przybyszowe mogą być indukowane na międzywęzłowych segmentach ipecac bez leczenia fitohormonami. Aby ocenić dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych, zmierzyliśmy endogenną auksynę i cytokininę w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie, w jaki sposób zmienia się poziom endogennych fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych w ipecac. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z regeneracją tkanek w kole kultur tkankowych roślin. Główną zaletą tej techniki jest endogenny poziom kwasu indolo-3-octowego, a cytokininy można po prostu analizować z dużą czułością.Implikacje tej techniki rozciągają się na całe tworzenie się zwyrodnienia tkanki roślinnej, ponieważ zmiany poziomu endogennych fitohormonów wywołują przypadkowe tworzenie pędów. Na początek przygotuj pożywkę B5 bez fitohormonów i dodaj 0,2 procent gumy gellan. Następnie przeprowadź pożywkę w autoklawie, aby ją wysterylizować.Za pomocą skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej pokrój osiem milimetrowych segmentów międzywęzłowych sadzonek ipecac i umieść je na podłożu. Następnie hoduj segmenty ipecac w temperaturze 24 stopni Celsjusza poniżej 15 mikromoli na metr kwadratowy sekundy światła w 14-godzinnym jasnym, 10-godzinnym cyklu ciemności przez pięć tygodni. Po wyhodowaniu segmentów ipecac zidentyfikuj regiony od jednego do czwartego w każdym segmencie.Raz w tygodniu użyj mikroskopu, aby policzyć liczbę pędów przybyszowych w każdym regionie. Najpierw umieść pięciomilimetrowy koralik cyrkonu w czterech dwumililitrowych probówkach na próbki. Następnie użyj skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej, aby pociąć segmenty ipecac na obszary od I do IV. Następnie zbierz osiem segmentów z każdego regionu do jednej probówki z próbką.Zważyć każdą z próbek i zamrozić ją w ciekłym azocie. Następnie użyj homogenizatora na bazie kulek, aby zmiażdżyć zamrożone próbki. Za pomocą mieszalnika wirowego zawiesić próbki w jednym mililitrze acetonitrylu z 500 pikogramami każdego wzorca wewnętrznego wołów i CK.Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. A następnie odwirować próbki o sile 3500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj granulkę w 80-procentowym nitrylu acetalowym z jednym procentem kwasu octowego.Następnie powtórzyć wirowanie i użyć jednorazowej probówki do połączenia supernatantów. Do połączonego supernatantu dodać 600 mikrolitrów wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby odparować nitryl acetalowy.Załaduj roztwory próbek do indywidualnych zrównoważonych wkładów HLB. I umyj wkłady jednym mililitrem wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie nawiąż do wszystkich hormonów z dwoma mililitrami 80-procentowego acetylowo-nitrylowego z jednym procentem kwasu octowego w szklanej probówce.Za pomocą koncentratora próżniowego odparować nitryl octowy, aby uzyskać ekstrakt w wodzie z jednym procentem kwasu octowego. Załaduj roztwory próbek do indywidualnych zrównoważonych wkładów MCX i umyj wkłady jednym mililitrem wody z jednoprocentowym kwasem octowym. Następnie nawiąż do IAA w szklanej probówce, z dwoma mililitrami 30-procentowego nitrylu acetalowego z jednym procentem kwasu octowego.Następnie umyj wkłady dwoma mililitrami 80-procentowego nitrylu octowego z jednym procentem kwasu octowego. Następnie umyj wkłady dwoma mililitrami wody i jednym mililitrem wody z pięcioprocentowym wodnym roztworem amoniaku w komorze ciągu. Nawiąż do CK w szklanej probówce z dwoma mililitrami 60-procentowego nitrylu acetalowego z pięcioprocentowym wodnym roztworem amoniaku w komorze ciągu.Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby odparować rozpuszczalnik każdej frakcji hormonu. Mieszaj próbki w temperaturze minus trzydziestu stopni Celsjusza do analizy LCMSMS. Najpierw rozpuść każdy ekstrakt hormonalny w tubce z 600 mikrolitrami metanolu.Następnie przenieść roztwór do fiolki z całkowitą odzyskiem z gwintowaną szyjką i użyć koncentratora próżniowego do odparowania rozpuszczalnika. Frakcję IAA rozpuścić w 20 mikrolitrach 30-procentowego nitrylu acetalowego, a frakcje CK w 20 mikrolitrach wody z jednym procentem kwasu octowego. Następnie użyj potrójnego kwadrupolowego systemu MS wyposażonego w system HPLC do analizy próbek w trybie jonów dodatnich.Na koniec określić ilościowo endogenne IAA w poziomach CK w stosunku do krzywej standardowej stosunku wzorców znakowanych nieznakowanych do deuteru. W tym protokole endogenną oksydacyjną cytokininę w zsypach przybyszowych mierzono za pomocą LCMSMS przez pięć tygodni. W pierwszym tygodniu nie utworzyły się żadne przypadkowe zsypy, a pierwsze małe zsypy pojawiły się w drugim tygodniu.W trzecim i czwartym tygodniu liczba zsypów zwiększyła się głównie w regentach pierwszym i drugim. W piątym tygodniu liczba zsypów wynosiła około siedmiu w regionie pierwszym i pięciu w regionie drugim. Przed kulturą poziom IAA był nieco wyższy w regionie pierwszym niż w regionie drugim, trzecim i czwartym.W pierwszym tygodniu poziom IAA znacznie wzrósł w regionie czwartym i nieznacznie spadł w regionie pierwszym, drugim i trzecim. Po pięciu tygodniach hodowli pojawił się gradient stężeń IAA. Z poziomami rosnącymi od regionu pierwszego do regionu czwartego.Przed hodowlą większość CK wykazywała tylko śladowe poziomy. W pierwszym tygodniu poziom tZR wzrósł do 13,8 pikogramów na miligram w regionie drugim. I 18,1 pikogramów na miligram w regionie trzecim.Natomiast poziomy tZ, iP i iPR zmieniły się tylko nieznacznie podczas hodowli. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że hormony endogennej części są stabilne. Po opracowaniu przez człowieka, technika ta toruje drogę badaczom w dziedzinie hodowli tkanek roślinnych.Badanie powstawania przybyszowego w innych organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować endogenny kwas indolo-3-octowy i cytokininy.

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film demonstruje test hamowania wzrostu siewek w roślinie Arabidopsis thaliana. Określa się wpływ zwiększonego stężenia elicytora peptydów immunologicznych na wzrost siewek.

Pomiar indukowanego przez układ odpornościowy zahamowania wzrostu siewek

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego ().  Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Protokół opisany tutaj jest metodą pomiaru endoreduplikacji w bulwach ziemniaka (Solanum tuberosum). Obejmuje etapy plazmolizy i ekstrakcji protoplastów w celu zmniejszenia szumów i zanieczyszczeń w dalszej analizie cytometrycznej przepływowej.

Pomiar endoreduplikacji za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych protoplastów bulw

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego i specyficznego usuwania interesującego białka w drożdżach Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu AID β-est.

Dostrajanie degradacji w celu osiągnięcia specyficznego i wydajnego zubożenia białek

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Tutaj opisujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z silną wymianą anionów siewek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, która jest bardzo czułą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach.

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Poznaj metodę kwantyfikacji endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej ipecac przy użyciu LC-MS/MS. Ta technika umożliwia analizę fitohormonów z wysoką czułością.

Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

Przeglądaj więcej filmów