Name: Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę monitorowania transmisji priopodobnych agregatów białkowych między komórkami u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia wizualizację in vivo i badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Kopito, Luo i Pearce za wiele pomocnych dyskusji podczas rozwoju tych metod. Dziękujemy również Brianowi Temsamritowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez fundusze z University of the Sciences i W.W. Smith Charitable Trusts.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+genetics+of+prions+causing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Biology and genetics of prions causing neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).</li>
<li>Haïk, S., Brandel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+prion+diseases+in+humans%3A+Cannibalism%2C+iatrogenicity+and+zoonoses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Genet+Evol%22%5BJournal%5D)">Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses.</a> Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).</li>
<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+Proteostasis+for+Disease+Intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting Proteostasis for Disease Intervention.</a> Science. 319 (5865), 916-919 (2008).</li>
<li>Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Regulation+of+Amyloid+Formation+in+Aging+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease.</a> Front Neurosci. 11, 64(2017).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).</li>
<li>Jucker, M., Walker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-propagation+of+pathogenic+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).</li>
<li>Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion+model+for+progression+and+diversity+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases.</a> Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).</li>
<li>Walker, L. C., Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases%3A+expanding+the+prion+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept.</a> Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).</li>
<li>Nonaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+pathological+TDP-43+aggregates+from+diseased+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains.</a> Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).</li>
<li>Ren, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).</li>
<li>Trevino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+structure+and+charge+determine+the+interaction+of+polyglutamine+protein+aggregates+with+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface.</a> J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).</li>
<li>Zeineddine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOD1+protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+in+neurons+to+facilitate+their+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation.</a> Mol Neurodegener. 10, 57(2015).</li>
<li>Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+SOD1+misfolding+and+motor+neuron+disease+spread+along+neuroanatomical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways.</a> Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).</li>
<li>Clavaguera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+homogenates+from+human+tauopathies+induce+tau+inclusions+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+pathology+in+a+model+of+early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebral+beta-amyloidosis%3A+intracerebral+versus+systemic+Abeta+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Rey, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transneuronal+propagation+of+alpha-synucleinopathy+triggered+in+olfactory+bulb+mimics+prodromal+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease.</a> J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-synaptic+spread+of+tau+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), 31302(2012).</li>
<li>Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nat Commun. 6, 6768(2015).</li>
<li>Pearce, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+pathogenic+protein+aggregates+in+genetic+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).</li>
<li>Pecho-Vrieseling, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+propagation+of+mutant+huntingtin+contributes+to+non-cell+autonomous+pathology+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons.</a> Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).</li>
<li>Wu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+enhances+tau+propagation+and+tau+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo.</a> Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).</li>
<li>Jackson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine-expanded+human+huntingtin+transgenes+induce+degeneration+of+Drosophila+photoreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons.</a> Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).</li>
<li>Warrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+polyglutamine+protein+forms+nuclear+inclusions+and+causes+neural+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila.</a> Cell. 93 (6), 939-949 (1998).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+In+Vivo+Model+for+Human+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Huntington disease.</a> Nat Rev Dis Primers. 1, 15005(2015).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
<li>Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+behavior+in+vitro+supports+a+recruitment+mechanism+of+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity.</a> J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Riabinina, O., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q-System%3A+A+Versatile+Expression+System+for+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+polyglutamine+aggregates+in+neuronal+cells+occurs+in+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes.</a> J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).</li>
<li>Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unwrapping+glial+biology%3A+Gcm+target+genes+regulating+glial+development%2C+diversification%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function.</a> Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).</li>
<li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17487202">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+One-step+Dissection+Protocol+for+Whole-mount+Preparation+of+Adult+Drosophila+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AccPbFRET%3A+an+ImageJ+plugin+for+semi-automatic%2C+fully+corrected+analysis+of+acceptor+photobleaching+FRET+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images.</a> BMC Bioinformatics. 9, 346(2008).</li>
<li>Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+pathological+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases.</a> Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ liczba pacjentów cierpiących na choroby neurodegeneracyjne stale rośnie, istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia patogenezy molekularnej tych chorób, aby można było opracować lepsze terapie. W tym miejscu opisano metody, które pozwalają na monitorowanie podobnej do prionów transmisji patogennych agregatów białkowych między różnymi typami komórek w organizmie modelowym, Drosophila melanogaster. Niedawno zastosowaliśmy tę metodologię, aby zademonstrować podobną do prionów transmisję zmutowanych agreg...

Hipoteza prionowa mówi, że czynnik zakaźny odpowiedzialny za zakaźne encefalopatie gąbczaste (np. choroba Creutzfeldta-Jakoba u ludzi, trzęsawka u owiec, przewlekła choroba wyniszczająca u jeleni i łosi oraz "choroba szalonych krów" u bydła) składa się wyłącznie z białka i jest pozbawiona kwasów nukleinowych1. W chorobach prionowych komórkowe białko prionowe (PrPC) przyjmuje nienatywny, stabilny fałd (PrPSc), który jest wysoce bogaty w arkusze beta i może się samorozprzestrzeniać poprzez przekształcanie i rekrutację monomerycznych cząsteczek PrPC w stabilne agregaty amyloidowe. Agregacje PrPSc wykorzystują ten samoreplikujący się mechanizm do rozprzestrzeniania się między różnymi komórkami organizmu, a nawet między pojedynczymi organizmami2.
Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek jest również główną cechą większości chorób neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS))3. Powstawanie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych zagregowanych zespołów białkowych w tych chorobach jest ściśle związane z cytotoksycznością4 i postępuje wzdłuż wysoce powtarzalnych i specyficznych dla choroby ścieżek przez mózg w czasie5,6. Te wzorce rozprzestrzeniania się sugerują, że agregaty chorobotwórcze związane z tymi zaburzeniami mają właściwości podobne do prionów. Obecnie istnieje silne poparcie dla podobnej do prionów transmisji agregatów związanych z AD, PD, HD i ALS - rozprzestrzeniają się one z komórki do komórki i tworzą matrycę zmiany konformacyjnej monomerycznych form tego samego białka w wcześniej niedotkniętych komórkach7,8.
Większość dotychczasowych badań nad prionowym rozprzestrzenianiem się agregatów białkowych została przeprowadzona przy użyciu modeli hodowli komórek ssaków, gdzie agregaty przenoszą się do cytoplazmy komórek naiwnych z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub z cytoplazmy innej komórki9,10,11,12,13,14,15, lub poprzez wstrzyknięcie materiału zawierającego agregat do mózgów myszy i monitorowanie wyglądu agregatu poza miejscem wstrzyknięcia16,17,18,19,20,21,22,23. Ostatnio transgeniczne zwierzęta zostały wykorzystane do wykazania, że wewnątrzkomórkowe agregaty rozprzestrzeniają się na inne komórki w nienaruszonych mózgach24,25,26,27,28,29,30. W tym miejscu opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji zagregowanego transferu między poszczególnymi komórkami w nienaruszonym mózgu Drosophila melanogaster. Modele chorób HD/poliglutaminy (polyQ) zostały po raz pierwszy opracowane prawie dwie dekady temu31,32 i dostarczyły wielu bezcennych informacji na temat mechanizmów patogennych, które leżą u podstaw tych zaburzeń33. Choroba Huntingtona jest dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną autosomalną dominującą mutacją w genie kodującym białko huntingtynę (Htt)34. Mutacja ta powoduje ekspansję odcinka polyQ w pobliżu N-końca Htt poza próg patogenny ~ 37 glutamin, powodując nieprawidłowe fałdowanie i agregację białka35,36. Białka Htt typu dzikiego zawierające <37 glutaminy na tym odcinku osiągają swoje natywne fałdowanie, ale mogą być indukowane do agregacji po bezpośrednim kontakcie fizycznym z agregatem Htt "seed"12,27,37. Wykorzystujemy tę homotypową, jądrzastą agregację Htt typu dzikiego jako odczyt dla transferu podobnego do prionów i cytoplazmatycznego wejścia zmutowanych agregatów Htt pochodzących z innych komórek.
Określenie mechanizmów, za pomocą których agregaty podobne do prionów przemieszczają się między komórkami, może prowadzić do identyfikacji nowych celów terapeutycznych dla nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych. Wykorzystujemy szybki cykl życiowy, łatwość użycia i wykonalność genetyczną Drosophila melanogaster, aby zdefiniować mechanizmy molekularne rozprzestrzeniania się zmutowanych agregatów Htt z komórki na komórkę. Nasza strategia eksperymentalna wykorzystuje dwa binarne systemy ekspresji dostępne u Drosophila, dobrze znany system sekwencji aktywującej specyficzną dla Gal4 (Gal4-UAS)38 oraz niedawno opracowany system QF-QUAS39. Sprzężenie tych dwóch niezależnych systemów pozwala na ograniczenie ekspresji zmutowanych i dzikich transgenów Htt do różnych populacji komórek w obrębie tej samej klasy fly<sup="xref">40. Korzystając z tego podejścia, badamy podobne do prionów rozprzestrzenianie się zmutowanego Htt poprzez monitorowanie redystrybucji cytoplazmatycznego Htt typu dzikiego z jego normalnie rozproszonego, rozpuszczalnego stanu do stanu zagregowanego, co jest bezpośrednią konsekwencją fizycznego kontaktu z wcześniej uformowanym zmutowanym agregatem Htt "nasiona". Konwersję Htt typu dzikiego przez zmutowane Htt można potwierdzić za pomocą technik biochemicznych lub biofizycznych, które informują o interakcjach białko-białko, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)9,27,41.
Co ważne, możemy również uzyskać dostęp do dużej liczby narzędzi genetycznych u Drosophila, aby zidentyfikować geny i/lub szlaki, które pośredniczą w podobnym do prionów rozprzestrzenianiu się agregatów białkowych. Niedawno zastosowaliśmy to podejście, aby odkryć kluczową rolę receptora zmiatacza powierzchni komórki, Draper42,43, w przenoszeniu zmutowanych agregatów Htt z aksonów neuronalnych do pobliskiego gleju fagocytarnego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) Drosophila27. Tak więc podejście oparte na genetyce i obrazowaniu, które tutaj opisujemy, może ujawnić ważne podstawowe informacje biologiczne na temat zjawiska istotnego z punktu widzenia choroby w prostym w użyciu, ale potężnym organizmie modelowym, Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Rozcieńczony do 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS), filtrowana</td><td>Lampire Laboratoria biologiczne</td><td>7332500</td><td>Podaniec i zamrozić po otrzymaniu</td></tr><tr><td>Kurczak anty-GFP</td><td>Aves</td><td>Labs GFP-1020</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>Królik anty-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:2000; potrafi rozpoznać białka fluorescencyjne na bazie DsRed (np. mCherry, mStrawberry, tdTomato itp.)</td></tr><tr><td>Mysie badania rozwojowe anty-Bruchpilot</td><td>Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100; oznaczy aktywne struktury presynaptyczne w mózgu muchy</td></tr><tr><td>FITC anty-kurczak</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anty-królik</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 przeciwciało anty-mysie</td><td>Life Technologie</td><td>A21235</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:250</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td> Szkiełka mikroskopowe <td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>(25 x 75 x 1,0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont Biology Grade, styl 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>zastosowanie w niedominującej ręce</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont Biology Grade, Styl 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>zastosowanie w dominującej dłoni</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu LAS X</td> Oprogramowanie do analizy obrazu <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u drosophila melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Agregacja białek jest główną cechą większości chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona (HD) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Agregaty białkowe są ściśle związane z neuropatologią w tych chorobach, chociaż dokładny mechanizm, za pomocą którego nieprawidłowa agregacja białek zakłóca normalną homeostazę komórkową, nie jest znany. Pojawiające się dane dostarczają silnego wsparcia dla hipotezy, że patogenne agregaty w AD, PD, HD i ALS mają wiele podobieństw do prionów, które są czynnikami zakaźnymi odpowiedzialnymi za pasażowalne encefalopatie gąbczaste. Priony samoreplikują się, proponując konwersję natywnie sfałdowanych wersji tego samego białka, powodując rozprzestrzenianie się fenotypu agregacji. To, w jaki sposób priony i białka podobne do prionów w chorobach Alzheimera, Choroby Parkinsona, HD i ALS przemieszczają się z jednej komórki do drugiej, jest obecnie przedmiotem intensywnych badań. W tym artykule opisano model Drosophila melanogaster, który pozwala na monitorowanie prionopodobnej, międzykomórkowej transmisji zmutowanych agregatów huntingtyny (Htt) związanych z HD. Model ten wykorzystuje potężne narzędzia do manipulowania ekspresją transgenów w wielu różnych tkankach Drosophila i wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie białko cytoplazmatyczne do bezpośredniego raportowania podobnego do prionów transferu zmutowanych agregatów Htt. Co ważne, opisywane przez nas podejście może być wykorzystane do identyfikacji nowych genów i szlaków, które pośredniczą w rozprzestrzenianiu się agregatów białkowych między różnymi typami komórek in vivo. Informacje uzyskane z tych badań poszerzą ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów patogennych leżących u podstaw chorób neurodegeneracyjnych i ujawnią nowe możliwości interwencji terapeutycznej.

Metody opisane w niniejszym opracowaniu dostarczają wiarygodnych danych wykazujących prionopodobny transfer agregatów białka Htt z jednej populacji komórek do drugiej w nienaruszonym OUN muchy. Konwersja białka Htt typu dzikiego z formy rozproszonej w punktową jest obserwowana poprzez bezpośrednią fluorescencję tego białka fuzyjnego z YFP w glii biorcy jako wynik ekspresji HttQ91-mCherry w donorskich ORN (Rycina 2A-C oraz <strong class="xfig"...

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie priopodobnego rozprzestrzeniania się agregatów białkowych in vivo. Wykorzystanie muszek transgenicznych, które wyrażają białko podatne na agregację w rozpuszczalnej wersji tego samego białka w izolowanych populacjach komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki w dziedzinach neurodegeneracji, takie jak to, w jaki sposób mitologia agregatów białkowych lub inny materiał przenosi się z komórki do komórki w mózgu.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na obrazowanie rozprzestrzeniania się agregatu białkowego z jednego miejsca komórkowego oposa do drugiego w nienaruszonym ośrodkowym układzie nerwowym. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby Huntingtona i innych priopodobnych chorób neurodegeneracyjnych. Ponieważ rozprzestrzenianie się agregatów wydaje się być powszechnym mechanizmem leżącym u podstaw postępu tych śmiertelnych zaburzeń.Korzystając ze standardowych warunków hodowli, wygeneruj transgeniczne linie Drosophila melanogaster zawierające specyficzne tkankowo czynniki Gal4 lub QF. Jak również linie zawierające geny trans huntingtyny typu dzikiego lub zmutowanego poniżej Gal4-UAS lub QF-QUAS. Zbierz potomstwo genotypu pragnienia i postarzyj je, aż będą gotowe do sekcji.Aby przygotować się do sekcji mózgu, zbierz potrzebne roztwory i schłodź je na lodzie, wraz ze szklanym naczyniem wielodołkowym, końcówkami pipet i jedną parą kleszczy. Następnie znieczulono dorosłe muchy za pomocą dwutlenku węgla i przeniesiono je do studzienki szklanego naczynia. Następnie dodaj około pół mililitra PBST do studzienki z muchami i do sąsiedniej studzienki.Następnie pod mikroskopem preparacyjnym skup się na pojedynczej muchy i oświetl ją z obu stron światłami na gęsiej szyi. Następnie umieść złożoną chusteczkę pod naczyniem w celu wyczyszczenia narzędzi do preparowania. Teraz, używając kleszczy numer trzy w niedominującej ręce, przenieś pojedynczą muchę do studni zawierającej PBST.Unieruchom, chwytając muchę, chwytając ją za brzuch brzuszną stroną skierowaną do góry i całkowicie zanurz muchę. Teraz włóż jeden ząb kleszczy numer pięć pod naskórek w małej przestrzeni przylegającej do trąbki. Następnie zabezpiecz uchwyt na głowie, ściskając oko z obu stron i rozsuń kleszcze, aby odłączyć głowę.Wyrzuć ciało muchy na złożoną tkankę, utrzymując głowę zanurzoną w PBST. Następnie włóż ząb kleszczy numer trzy w tę samą przestrzeń po drugiej stronie trąbki i delikatnie rozsuń naskórek głowy, aby odsłonić mózg. Przed kontynuowaniem wyrzuć resztki naskórka na tkankę laboratoryjną.Podczas usuwania naskórka unikaj bezpośredniego kontaktu z mózgiem, aby nie uszkodzić go kleszczami. Teraz usuń wypreparowany mózg z PBST, chwytając przyczepioną tchawicę lub zasysając ją w przestrzeń między końcówkami kleszczy za pomocą działania kapilarnego. Następnie przenieś mózg muchy do probówki mikrowirówkowej zawierającej roztwór utrwalający na lodzie.Obserwuj uważnie, aby obserwować, czy mózg uwalnia się z kleszczy. Po wypreparowaniu wszystkich mózgów przenieś probówkę do nutatora w temperaturze pokojowej i zawiń ją na około pięć minut. Po okresie utrwalania należy usunąć większość roztworu utrwalającego za pomocą pipety p1000 i wyrzucić go, bardzo uważając, aby pozostawić mózgi w probówkach.Wymaga to delikatnego ssania i uważnej obserwacji. Następnie dodaj jeden mililitr świeżego PBST do mózgu. Przykryj tubkę i pozwól jej kołysać się na nutatorze przez około minutę, aby zmyć pozostały utrwalacz.Następnie usuń roztwór i powtórz ten krótki krok prania. Następnie wykonaj dwa krótkie mycia z jednym pięciominutowym myciem, następnie trzema 20-minutowymi myciami, a na koniec jednym godzinnym myciem. Po ostatnim praniu ostrożnie usuń większość PBST i zanurz mózgi w 30 mikrolitrach odczynnika zapobiegającego blaknięciu na bazie glicerolu.Następnie inkubuj mózgi w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności bez ruchu przez jedną do 24 godzin. Później wyjmij mózgi z probówki zbiorczej za pomocą końcówki pipety i przenieś je do szkiełka mikroskopowego. Następnie delikatnie ustaw mózgi w razie potrzeby do obrazowania za pomocą kleszczy.Wiele próbek można zamontować na tym samym szkiełku w oddzielnych rzędach. Następnie usuń nadmiar odczynnika zapobiegającego blaknięciu ze szkiełka za pomocą rogu złożonej chusteczki laboratoryjnej. Nie pozwól, aby tkanka miała kontakt z mózgiem.Następnie pozostaw próbki w ciemności na pięć do 10 minut, aby mózgi przylgnęły do szkiełka. Następnie weź małe kawałki potłuczonego szkła nakrywkowego i umieść je wokół mózgów pokrywających obszar o powierzchni około 19 milimetrów kwadratowych, a następnie delikatnie opuść szklankę o powierzchni 22 milimetrów kwadratowych na mozaikę mózgów i szkła, aby wykonać mocowanie mostu. Następnie powoli dozuj świeży odczynnik zapobiegający blaknięciu pod szkiełko nakrywkowe, aby wypełnił puste przestrzenie.Rób to bardzo ostrożnie, aby mózg i szkło pozostały na swoim miejscu. Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Najpierw po prostu nałóż go w rogach.Pozostaw narożne krople do wyschnięcia na pięć do 10 minut przed zakończeniem uszczelniania wzdłuż krawędzi. Mózg powinien zostać zobrazowany tak szybko, jak to możliwe. Wyobraź sobie zamontowane mózgi za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40X lub 63X, aby zebrać plasterki Z w obszarze mózgu, w którym dochodzi do ekspresji genów trans.Następnie przeanalizuj dane, określając ilościowo puncta w poszczególnych wycinkach Z lub alternatywnie po renderowaniu wycinków w trzech wymiarach. Aby określić ilościowo zmutowane agregaty huntingtyny, które są dobrze oddzielone i mają niewielki sygnał tła, otwórz konfokalną serię Z w trybie oglądania 3D. Następnie użyj kreatora analizy, aby zidentyfikować poszczególne miejsca w selektywnym kanale.W ustawieniach dostosuj progi i filtry, aby dokładnie odwzorować wszystkie agregacje o niejednorodnych rozmiarach jako pojedyncze obiekty na obrazie. Następnie włącz podział obiektów w filtrze wstępnym przetwarzania binarnego, aby oddzielić ściśle powiązane agregacje. Informacje ilościowe o obiektach zidentyfikowanych przez oprogramowanie są raportowane w ramach pomiarów.Po policzeniu puncta, scharakteryzuj je dalej w oprogramowaniu do analizy obrazu. Na przykład należy wykonać odpowiednie pomiary punktów lub powierzchni, aby uzyskać informacje o średnicy, objętości lub intensywności kruszywa. Niektóre agregaty huntingtyny typu dzikiego mogą być oznaczone ilościowo poprzez ręczne przesuwanie się przez stos Z i liczenie zielonych puncta, które można odróżnić od otaczającego sygnału rozproszonego.Należy uważać, aby nie liczyć pojedynczych agregacji dwukrotnie, jeśli występują one w więcej niż jednym wycinku. Inną interesującą analizą jest określenie częstości kolokalizacji między agregatami huntingtyny Q25-YFP i huntingtyny Q91-mCherry. Zrób to za pomocą ręcznego liczenia, przesuwając plasterek po wycinku przez konfokalny stos Z.Staranna selekcja czynników genetycznych i fuzji genów trans białek fluorescencyjnych pozwala na wyraźne wykrycie zmutowanych i dzikich białek huntingtyny w nienakładających się na siebie populacjach komórek. Konwersja huntingtyny typu dzikiego z rozproszonej do punktowej obserwuje się poprzez bezpośrednią fluorescencję białka fuzyjnego YFP w gleju biorcy w wyniku ekspresji huntingtyny Q91-mCherry w neuronach receptora węchowego dawcy. Staranna selekcja czynników genetycznych i fuzji genów trans białek fluorescencyjnych pozwala na wyraźne wykrycie zmutowanych i dzikich białek huntingtyny w nienakładających się na siebie populacjach komórek.Zmutowane i dzikie agregaty huntingtyny mogą być oznaczane ilościowo jako obiekty punktowe, zarówno ręcznie, jak i za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Agregaty mogą być mierzone i charakteryzowane dalej jako populacje i pod kątem częstotliwości ich kolokalizacji. Zlokalizowane co puncta mogą być dalej analizowane przez transfer rezonansu energii fluorescencji lub FRET w celu wykazania bliskiej odległości fuzji białek fluorescencyjnych.Po opanowaniu, sekcja mózgu i obrazowanie mogą być wykonane od początku do końca w mniej niż osiem godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym odróżnieniu punktowych zagregowanych obiektów od innych struktur fluorescencyjnych w tej samej tkance za pomocą odpowiednich kontroli. Procedura ta może być modyfikowana w celu uwzględnienia innych metod, takich jak knockdown genów, w celu określenia mechanizmów molekularnych transferu agregacji między różnymi typami komórek.Dzięki i życzę powodzenia w eksperymentach.

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Ten film demonstruje procedurę obrazowania in vivo C. elegans wyrażającego białka podobne do prionów oznaczone białkiem czerwonej fluorescencji. Protokół polega na unieruchomieniu nicieni na podkładce agarozowej w celu poklatkowej mikroskopii konfokalnej, ujawniając agregację i transport białek w obrębie komórek i między nimi. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla badania agregacji białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi.

Obrazowanie poklatkowe w celu monitorowania transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek podobnych do prionów u nicień transgenicznych

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Poznaj metodę monitorowania transmisji priopodobnych agregatów białkowych między komórkami u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia wizualizację in vivo i badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów