Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans
7 lutego 2018
Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie ratiometrycznego obrazowania wapnia wpływu aktywności neuronu specyficznego dla hermafrodyty lub HSN na zachowanie Caenorhabditis elegans. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej dotyczące tego, w jaki sposób aktywność obwodów neurologicznych powoduje zmiany w zachowaniu zwierząt, gdy zwierzęta zmieniają stany behawioralne. Technika ta pozwala na rejestrowanie zmian w wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia przy wysokim stosunku sygnału do szumu, przy jednoczesnym śledzeniu zachowania i lokomocji zwierząt.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat aktywności neuronalnej u C. elegans, można ją również zastosować do innych przezroczystych systemów modelowych, w tym larw Drosophila i ryb zebry. Procedurę zademonstrują ze mną studenci Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal i Layla Nassar. Aby dosiąść zwierząt, najpierw nałóż pokarm bakteryjny OP50 z płytki agarowej z nasionami pożywki do wzrostu nicieni na dno kilofa z platynowymi robakami i użyj kilofa do przeniesienia około 20 późnych L czterech L-X 2 000 dla zwierząt wykazujących ekspresję wrażliwego reportera wapnia GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora N-L 3 P na płytkę pożywki wzrostowej z nasionami nicieni.
Potwierdź obecność rozwijającego się sromu pod mikroskopem stereoskopowym jako wyraźnej ciemnej plamy otoczonej białym półksiężycem i inkubuj robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24-40 godzin. Pod koniec inkubacji nałóż OP50 na nowy zbiór i przenieś trzy robaki na niewysiewaną pożywkę wzrostową nicieni, pozostawiając niewielką porcję pokarmu na nowej szalce, aby robaki mogły się nimi żywić podczas obrazowania. Następnie użyj płaskiej, zaokrąglonej szpatułki, aby wyciąć kawałek o wymiarach 20 na 20 milimetrów z nieobsianej płytki i umieść go robakiem do dołu na jednej krawędzi czystego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 60 milimetrów i średnicy 1,5.
Następnie ostrożnie wsuń kawałek agaru na środek szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe numer jeden o wymiarach 22 na 22 milimetry na wierzchu kawałka agaru, aby zmniejszyć przywieranie i parowanie. Aby skonfigurować imager, umieść robaki na stoliku odwróconego mikroskopu i wybierz 20x subiektywny. Użyj okularów lornetki, aby wybrać robaka do obrazowania i przesuń filtr podczerwieni i umieść go nad kondensatorem.
Otwórz odpowiedni program do analizy wideo i uruchom końcowy skrypt komunikacyjny etapu szeregowego XY. Kliknij CsvWriter i wybierz folder, w którym chcesz zapisać nagrane informacje o etapie X i Y. Następnie kliknij zielony grot strzałki, aby zainicjować urządzenie do akwizycji cyfrowej.
W oprogramowaniu do nagrywania kamery na podczerwień w ustawieniach wybierz opcję Toggle Camera Control Dialog (Przełącz okno dialogowe sterowania kamerą). Następnie wybierz menu Niestandardowe tryby wideo i wybierz Tryb 1 i Format piksela Raw ósemka. W obszarze Trigger Stroke (Skok spustu) ustaw linię wejściową wyzwalacza na trzy, polaryzację na wysoką, a tryb na 14.
Przełącz opcję Włącz, aby zatrzymać akwizycję klatek do momentu odebrania sygnału wyzwalania napięcia z kamery fluoryzacyjnej. Po otwarciu okna podglądu obrazu kliknij przycisk Nagraj i wybierz folder, w którym chcesz zapisać sekwencje obrazów. Wybierz tryb nagrywania buforowanego i zapisz obrazy w formacie JPEG.
Następnie kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie, aby zainicjować przejęcie. Następnie otwórz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu do akwizycji kwiatów i ustaw czas ekspozycji na 10 milisekund, Binning na cztery X i Głębię obrazu na 16 bitów. Wybierz wyśrodkowaną podmatrycę kamery o szerokości 512 pikseli i wysokości 256 pikseli.
Program automatycznie podzieli szeroki obraz na pół, aby wygenerować oddzielne kanały kwiatowe. Kliknij opcję Pokaż opcje wyzwalacza wyjściowego i ustaw wszystkie wyzwalacze na dodatnie. Upewnij się, że wyzwalacz pierwszy i wyzwalacz drugi są ustawione na Ekspozycja, a wyzwalacz trzeci jest ustawiony na Programowalny z okresem 25 milisekund.
Następnie na karcie sekwencji wybierz opcję Upływ czasu W obszarze Ustawienia skanowania ustaw opóźnienie pola od jednej do 50 milisekund, aby zbierać obrazy z częstotliwością 20 herców. Wybierz opcję Zapisz w buforze tymczasowym. W przypadku ratiometrycznego obrazowania wapniowego na karcie Sekwencja kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie i śledzić robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość komórek i synaps będących przedmiotem zainteresowania w środku pola widzenia.
W momencie rozpoczęcia nagrywania fluorescencji, wyzwalacze są wysyłane do oczekującej kamery jasnego pola i kontrolera sceny, które rozpoczynają zbieranie zsynchronizowanych obrazów i pozycji sceny. Kliknij przycisk Statystyki w oknie Histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli dla każdego kanału. Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalny pojedynczy piksel kwiatowości mCherry na końcu presynaptycznym większy lub równy 8 000 zliczeń w kanale czerwonym, co daje około 12-bitowy zakres dynamiki nad tłem.
Sygnały reporterowe wapnia na końcu presynaptycznym podczas spoczynku lub niskiego poziomu wapnia powinny wynosić około 2 500 zliczeń w zielonym kanale. Rejestruj zachowanie, aż do osiągnięcia jednego stanu aktywnego składania jaj. Następnie zapisz 10-minutowy podzbiór zawierający 6 000 klatek przed i 6 001 klatek po pierwszym wydarzeniu składania jaj.
Należy zadbać o to, aby zachować ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaka i punktów czasowych pozycji stopnia X-Y, w przeciwnym razie precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona. W przypadku segmentacji obrazu zaimportuj sekwencje obrazów do odpowiedniego oprogramowania do kwantyzacji ratiometrycznej i kliknij prawym przyciskiem myszy szereg czasowy na karcie sekwencji, aby ustawić szereg czasowy na 20 klatek na sekundę i 1,25 mikrometra na piksel. W menu Narzędzia wybierz opcję Proporcje, a następnie wybierz mCherry dla kanału A i GCaMP5 dla kanału B i kliknij przycisk Oblicz, aby odjąć tło od każdej sekwencji obrazów.
Wybierz opcję Zastosuj tęczową tabelę przeglądową do kanału proporcji i użyj kanału mCherry, aby wygenerować kanał współczynnika z modulacją intensywności, aby odwzorować kolor proporcji na jasność kanału mCherry. Kliknij opcję Proporcja, aby wygenerować dwa kanały. Aby utworzyć w protokole znajdowania obiektów, przeciągnij narzędzie Znajdź obiekty za pomocą intensywności na karcie pomiarów do panelu protokołu i kliknij koło zębate, aby ustawić okno wartości intensywności mCherry i znaleźć obiekty.
Wybierz wartości intensywności większe lub równe dwóm odchyleniom standardowym powyżej tła, zwracając uwagę na wykrycie ciała komórki i końca presynaptycznego. Dodaj wszelkie dodatkowe filtry kierujące na kanał mCherry tylko wtedy, gdy jest to konieczne, aby wykluczyć niepożądane obiekty, takie jak: kwitnienie głowy, ogona lub jelit. Następnie otwórz menu Measurements (Pomiary) i wybierz opcję Make Measurement Item (Wykonaj element pomiaru) i wybierz wszystkie punkty czasowe, aby wykonać protokół analizy kwantyzacji obrazu.
Jednoczesna akwizycja sygnałów kwiatowych GCaMP5 i mCherry służy do generowania kanału proporcji piksel po pikselu, który kompensuje zmiany w ruchu i ostrości zwierząt. Dla każdego zwierzęcia zmiany w presynaptycznym wewnątrzkomórkowym wapniu HSN mogą być skorelowane z zachowaniami widocznymi w obrazowaniu w jasnym polu, w tym uwalnianiem jaj i zmianami w lokomocji. Rzeczywiście, można zaobserwować znaczne różnice w prędkości robaków przed, w trakcie i po stanie aktywnym składania jaj.
Zbliżenie na jedno zdarzenie składania jaj ujawnia solidną zmianę w kwiatostanie GCaMP5 przed złożeniem jaj. Podczas gdy kwiatostan mCherry pozostaje stosunkowo niezmieniony. Ponadto zmierzone zmiany w stosunku GCaMP5:mCherry wyraźnie wskazują na stan przejściowy wapnia HSN na około 4 sekundy przed uwolnieniem jaj
.Postępuje skurcz mięśni sromu widoczny jako wyraźne spowolnienie lokomocji robaków, które kończy się uwolnieniem jaja. Co więcej, obrazowanie i śledzenie robaków, jak właśnie pokazano, pozwala na wizualizację przestrzennej organizacji zachowania składania jaj od żerowania, przejściowych zmian wapnia HSM i aktywności HSN, która przechodzi w strzelanie impulsowe przed lokomocją, do miejsca składania jaj. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w godzinę lub dwie, jeśli jest wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby skupić się na interesujących komórkach i ich zakończeniach presynaptycznych podczas etapów obrazowania. Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne metody, takie jak aktywacja optogenetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak HSN reaguje na stymulację presynaptyczną. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania funkcji obwodu składania jaj u C. elegans.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ratiometryczne obrazowanie wapnia HSN u aktywnych Caenorhabditis elegans.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystujący genetycznie kodowane reportery Ca2+ do ratiometrycznego obrazowania wapnia w celu oceny aktywności neuronalnej u aktywnych behawioralnie nicieni Caenorhabditis elegans. Metoda ta pozwala zbadać, w jaki sposób aktywność neuronów specyficznych dla hermafrodytów (HSN) wpływa na zachowanie nicieni, odpowiadając na fundamentalne pytania z zakresu neuronauki behawioralnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka behawioralna
- Neuroobrazowanie
- Manipulacje genetyczne
Wstęp
- Obrazowanie wapnia jest kluczową metodą badania aktywności neuronalnej.
- Caenorhabditis elegans służy jako model do zrozumienia obwodów neuronalnych.
- Niniejszy protokół koncentruje się na neuronach HSN, które przyczyniają się do modulacji zachowania.
- Zrozumienie związku między aktywnością neuronalną a zachowaniem jest kluczowe dla uzyskania wglądu w neuronaukę.
Cel badania
- Wyjaśnienie wpływu aktywności neuronów HSN na zachowanie C. elegans.
- Zapewnienie wglądu w dynamikę obwodów neuronalnych i przejścia między stanami behawioralnymi.
- Walidacja zastosowania raportorów wapniowych w rejestrowaniu odpowiedzi neuronalnych podczas różnych stanów behawioralnych.
Zastosowane metody
- Ratiometryczne obrazowanie wapnia z wykorzystaniem genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GCaMP5 i mCherry).
- Obserwacje behawioralne u C. elegans w celu skorelowania aktywności neuronalnej ze stanami składania jaj.
- Zastosowanie technik obrazowania z użyciem specjalistycznego oprogramowania do akwizycji i analizy danych.
- Kroki obejmują przygotowanie nicieni, inkubację, konfigurację systemu obrazowania oraz rejestrację danych.
Główne wyniki
- Badanie pomyślnie wykazuje korelację między aktywnością neuronów HSN a zmianami behawioralnymi u C. elegans.
- Zarejestrowane sygnały wapniowe dostarczyły jasnych informacji na temat dynamiki neuronalnej podczas aktywności behawioralnych.
- Protokół opisuje skuteczne metody synchronizacji obrazowania z danymi behawioralnymi.
- Potwierdzono użyteczność genetycznie kodowanych reporterów w badaniu funkcji neuronalnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie pozwala na lepsze zrozumienie, w jaki sposób specyficzne obwody neuronalne wpływają na zachowanie C. elegans.
- Zastosowanie technik obrazowania wapnia może zostać rozszerzone na inne organizmy modelowe.
- Wnioski z tych badań przyczyniają się do szerszego zrozumienia mechanizmów neuronalnych i plastyczności behawioralnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ratiometryczna obrazowanie poziomu wapnia u aktywnych osobników C. elegans umożliwia bezpośrednią korelację aktywności pojedynczych neuronów ze stanami behawioralnymi, zapewniając skalowalną platformę do walidacji celów w procesie odkrywania neuroterapii. Poprzez kwantyfikację zależnych od HSN przejściowych zmian poziomu wapnia poprzedzających zdarzenia składania jaj, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku modulatorów szlaków serotonergicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie, łącząc cele molekularne z mierzalnymi efektami behawioralnymi w systemie podatnym na manipulacje genetyczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie sygnalizacji serotonergicznej w HSN jako celu terapeutycznego dla związków modulujących zachowanie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ratiometryczne odczyty korygujące artefakty ruchowe, co zwiększa niezawodność danych w preparatach swobodnie poruszających się.
- Wartość prognostyczna: Łączy presynaptyczną dynamikę wapnia z przejściami behawioralnymi, wspierając testowanie hipotez dotyczących związków neuroaktywnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ustanawia stosunek fluorescencji (GCaMP5:mCherry) jako ilościowy wskaźnik wewnątrzkomórkowego przepływu jonów wapnia w określonych neuronach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z częstotliwością 20 Hz z zsynchronizowanym śledzeniem behawioralnym, co pozwala na stosowanie powtarzalnych formatów testów.
- Skalowalność: Kompatybilność z zmotoryzowanym stolikiem oraz systemami jasnego pola w podczerwieni w celu długoterminowego monitorowania stanów behawioralnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Ułatwia przejście od pomiarów aktywności neuronalnej do fenotypów behawioralnych w systemie istotnym dla danej choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia obserwację przejściowych zmian poziomu wapnia w HSN na około 4 sekundy przed wydaleniem jaj, co pozwala na określenie czasu ukierunkowania interwencji.
- Klaryfikacja szlaków: Koreluje aktywność HSN ze skurczem mięśni sromkowych i zmianami w lokomocji, wyjaśniając efekty modulacji serotonergicznej na poziomie obwodów neuronalnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając odczyty poziomu wapnia w czasie rzeczywistym, specyficzne dla neuronów, co pozwala na identyfikację wiodących cząsteczek i priorytetyzację w badaniach przedklinicznych poprzez korelację behawioralną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów sygnalizacji serotonergicznej sterowanej przez HSN w modulowaniu zachowania składania jaj.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zsynchronizowanym strumieniom danych fluorescencyjnych i behawioralnych z rozdzielczością czasową 20 Hz.
- Analityka: Generuje ratiometryczne kanały fluorescencji oraz metryki śledzenia obiektów w celu ilościowego porównania aktywności neuronalnej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę wapnia w HSN z zachowaniem składania jaj, wspierając dopasowanie biomarkerów w walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do podłużnych badań neurobehawioralnych w liniach z genetycznie kodowanymi reporterami.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację przejściowych zmian poziomu wapnia w neuronach HSN z konkretnymi zdarzeniami behawioralnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie ratiometryczne w celu zminimalizowania zmienności wynikającej z dryftu ostrości oraz ruchów zwierzęcia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie oddziaływania na cel z mierzalnymi zmianami behawioralnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o zaawansowaniu badań z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zgodność neuronowo-behawioralną w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w genetycznym kodowaniu GCaMP5 i mCherry w konkretnych liniach neuronalnych.
- Zależne od zastosowania mikroskopii odwróconej z dwukanałową fluorescencją oraz możliwości obrazowania w jasnym polu w podczerwieni.
- Wymaga protokołów synchronizacji dla akwizycji fluorescencji, śledzenia preparatu i rejestracji zachowania.
- Obejmuje etapy postprocesingu w celu kwantyfikacji ratiometrycznej i detekcji obiektów z wykorzystaniem progów intensywności.
- Ograniczone do przezroczystych systemów modelowych oraz neuronów dostępnych dla sekcjonowania optycznego.
