Name: Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj ratiometryczne obrazowanie wapnia neuronów HSN w zachowaniu Caenorhabditis elegans. Ta metoda pozwala rejestrować aktywność wewnątrzkomórkową z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, jednocześnie śledząc zachowanie i lokomocję robaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana z grantu NINDS dla KMC (R01 NS086932). LMN otrzymał wsparcie z grantu z programu NIGMS IMSD (R25 GM076419). Szczepy użyte w tym badaniu C. elegans Genetics Center, które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dziękujemy Jamesowi Bakerowi i Masonowi Kleinowi za pomocne dyskusje.

1. Szczepy, pożywki hodowlane i montowanie zwierząt
<ol>
	<li>Hoduj robaki C. elegans w temperaturze 20 °C na standardowych 60-milimetrowych płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsianych pokarmem bakteryjnym OP50 E. coli19.</li>
	<li>Przygotuj dwa plazmidy dla każdego interesującego promotora specyficznego dla komórki: jeden, napędzający ekspresję GCaMP5 do rejestrowania wewnątrzkomórkowego Ca2+, a drugi, napędzający ekspresję mCherry, aby umożliwić ratiometryczną kwantyfikację zmian fluorescencji GCaMP5 i uprościć znajdowanie i pomiar obiektów. 
	UWAGA: Obrazowanie ratiometryczne GCaMP5:mCherry koryguje fluktuacje fluorescencji GCaMP5, które wynikają ze zmian ostrości i ruchu zwierząt, a nie rzeczywistych zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+.</li>
	<li>Wstrzyknij plazmidy wyrażające GCaMP5 i mCherry wraz z widocznym plazmidem markera ratunkowego pL15EK do gonad zmutowanych zwierząt LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X i odzyskaj zwierzęta inne niż Muv lin-15 (+) z ekspresją GCaMP5 i mCherry z trans<genu o wysokiej kopii sup class="xref">20,21,22. Użyj zmutowanego tła lite-1, aby zmniejszyć unikanie niebieskiego światła23,24.</li>
	<li>Integracja transgenów z chromosomami w celu zmniejszenia mozaicyzmu i uproszczenia generowania złożonych zmutowanych szczepów25. 
	UWAGA: Opisany tutaj szczep LX2004 przenosi zintegrowany transgen o wysokiej kopii, który eksprymuje GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3 (patrz Tabela materiałów)26,27,28,29. Stwierdzono, że promotor nlp-3 napędza silną ekspresję w HSN późnego L4 i dorosłych zwierząt, nie powodując znaczących wad w rozwoju HSN lub zachowaniu związanym ze składaniem jaj w porównaniu z innymi testowanymi promotorami (np. TPH-1, EGL-6 i UNC-86). Ten szczep i inne, które wyrażają GCaMP5 i mCherry w neuronach ruchowych rdzenia brzusznego (VC), mięśniach sromu i komórkach neuroendokrynnych uv1 są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center, a szczegóły ich budowy zostały opisane27.</li>
	<li>Nałóż pokarm bakteryjny OP50 z płytki agarowej NGM z nasionami na dno kilofa z platynowymi robakami i użyj go do przeniesienia ~ 20 późnych zwierząt L4 LX2004, które wykazują ekspresję GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3. Upewnij się, że rozwijający się srom pojawia się w mikroskopie stereoskopowym jako wyraźna ciemna plama otoczona białym półksiężycem. Inkubować zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 24–40 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji nałóż OP50 na zbiór i przenieś ~ 3 robaki na niezasianą płytkę NGM, pozostawiając niewielką ilość pokarmu, aby robaki mogły się nimi żywić podczas obrazowania. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo pokarmu, ponieważ zbyt mało pokarmu bakteryjnego zachęci robaki do oddalania się od środka talerza, podczas gdy zbyt dużo pokarmu zwiększy fluorescencję tła i spowoduje niedotlenienie.</li>
	<li>Użyj płaskiej, zaokrąglonej szpatułki, aby wyciąć kawałek o wymiarach ~ 20 mm x 20 mm z płytki zawierającej robaki i przenieś kawałek zadrukowaną stroną do dołu na środek czystego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 60 mm #1.5 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Rozpocznij aplikację z jednej strony, aby pęcherzyki nie zostały uwięzione pod szkiełkiem nakrywkowym i nie zakłócały obrazowania. Nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm #1 na wierzch kawałka, aby zmniejszyć przywieranie i parowanie.</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu i oprzyrządowania
<ol>
	<li>Umieść inscenizowane, transgeniczne robaki na stoliku mikroskopu odwróconego z obiektywem planapochromatycznym o aperturze 20x ≥ 0,7 z aperturą numeryczną, zmotoryzowanym stolikiem XY sterowanym za pomocą joysticka, rozdzielaczem obrazu i filtrami fluorescencyjnymi do jednoczesnego wzbudzenia i emisji GCaMP5 i mCherry, kamerami do obrazowania fluorescencyjnego i obrazowania w podczerwieni w jasnym polu oraz systemem oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
UWAGA: Rozdzielacz wiązki 80/20 wysyła 80% sygnału obrazu do kamery fluorescencyjnej i 20% do kamery jasnego pola. Można również użyć mikroskopu pionowego, ale w tym przypadku fragment NGM powinien być umieszczony między szkiełkiem podstawowym a dużym szkiełkiem nakrywkowym.
	<ol>
		<li>Użyj okularów lornetkowych, aby wybrać robaka do obrazowania. Po wybraniu zwierzęcia wsuń filtr podczerwieni na miejsce nad skraplaczem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyzwalacze logiki tranzystor-tranzystor (TTL)
	<ol>
		<li>Podłącz koncentryczne z każdej z trzech linii wyjściowych wyzwalacza TTL w kamerze fluorescencyjnej. Podłącz pierwsze wyjście do wejścia BNC #3 systemu oświetlenia LED.</li>
		<li>Podłącz drugie wyjście do adaptera BNC "bananowego" za pomocą zielonych i brązowych przewodów z 8-pinowego złącza GPIO biegnącego odpowiednio do wejścia GPIO #3 (pin 4) i masy (pin 5) kamery na podczerwień.</li>
		<li>Podłącz trzecie wyjście do adaptera BNC "bananowego" z przewodami połączeniowymi biegnącymi do wejścia cyfrowego #8 i masy w cyfrowym urządzeniu akwizycyjnym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cyfrowe urządzenie akwizycyjne (DAQ)
	<ol>
		<li>Podłącz płytkę mikrokontrolera DAQ (patrz tabela materiałów) do komputera za pomocą USB. Zaktualizuj oprogramowanie układowe za pomocą standardowego protokołu Firmata (patrz tabela materiałów) i skonfiguruj port USB do komunikacji z prędkością 57600 bodów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diody led
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie sterownika LED (patrz tabela materiałów). Przełącz tryb wyzwalania z "Ciągły" na "Bramkowany" i wybierz kanał wyzwalania "3" dla diod LED 470 i 590 nm.</li>
		<li>Włącz i wprowadź moc LED dla każdej diody LED (np. ustaw diodę LED 470 nm na 20%, a diodę LED 590 nm na 40%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom skrypt komunikacji etapu szeregowego "XY-stage-final" w Bonsai (zobacz tabelę materiałów)30. Kliknij szary węzeł 'CsvWriter' i wybierz folder, w którym chcesz zapisać nagrane informacje o etapie X i Y (Rysunek 3). Naciśnij zielony grot strzałki na pasku narzędzi, aby zainicjować DAQ. 
	UWAGA: Skrypt rozpocznie rejestrowanie pozycji X i Y stage, gdy kamera fluorescencyjna wyśle sygnał TTL. Ten skrypt wyprowadza cztery kolumny danych: numer ramki, pozycję X (μm), pozycję Y (μm) i interwał między ramkami (s).</li>
	<li>W oprogramowaniu do nagrywania kamery na podczerwień (patrz Spis materiałów) w sekcji "Niestandardowe tryby wideo" wybierz "Tryb 1" (binning 2 x 2; 1,024 x 1,024 pikseli) i "Format pikseli Raw 8". W sekcji "Trigger / Strobe" ustaw linię wejściową wyzwalacza (GPIO) na "3", polaryzację na "High", "Mode" na "14". Przełącz opcję "Włącz", aby zatrzymać akwizycję klatek do momentu odebrania sygnału wyzwalającego TTL.
	<ol>
		<li>Pozostawiając to okno otwarte, kliknij czerwony przycisk "Nagraj" na głównym pasku narzędzi widoku kamery. Wybierz folder, w którym mają zostać zapisane sekwencje obrazów. Wybierz tryb nagrywania "Buforowany" i zapisz "Obrazy" w formacie JPEG. Kliknij "Rozpocznij nagrywanie", aby zainicjować przejęcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kamera fluorescencyjna i rozdzielacz obrazu 
	UWAGA: Kanały fluorescencyjne GCaMP5 i mCherry muszą być pobierane jednocześnie, aby zapewnić prawidłową rejestrację obrazu do ilościowego pomiaru ratiometrycznego. Rozdzielacz obrazu umożliwia dwukanałową akwizycję fluorescencji GCaMP5 i mCherry na jednym czujniku.
	<ol>
		<li>W zakładce "Przechwytywanie" w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów) ustaw czas ekspozycji na 10 ms, binning na 4x i głębię obrazu na 16 bitów. Wybierz wyśrodkowaną podtablicę kamery o szerokości 512 pikseli i wysokości 256 pikseli. Kliknij "Pokaż opcje wyzwalacza wyjściowego" i ustaw wszystkie wyzwalacze na "Pozytywne". 
		UWAGA: DAQ może czasami przegapić wyzwalacze TTL, jeśli są one wygaszone 10 ms lub mniej.</li>
		<li>Upewnij się, że "Wyzwalacz 1" i "Wyzwalacz 2" są ustawione na "Ekspozycja", podczas gdy "Wyzwalacz 3" jest ustawiony na "Programowalny" z "Okresem" 25 ms. Na karcie "Sekwencja" wybierz "Upływ czasu" z "Opóźnieniem pola1" wynoszącym 50 ms, aby zbierać obrazy z częstotliwością 20 Hz. Wybierz opcję "Zapisz w tymczasowym buforze".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmocnienie PMT i intensywność lasera podczas trójkanałowego obrazowania konfokalnego
	<ol>
		<li>Ustaw wzmocnienie PMT tak, aby fluorescencja tła znajdowała się na poziomie nieco powyżej minimum (poziom czerni). Zwiększaj moc lasera 561 nm (zielonego) do momentu, gdy na końcu presynaptycznym w kanale mCherry zostanie zaobserwowany pojedynczy nasycony piksel 12-bitowy lub 16-bitowy.</li>
		<li>Dostosuj intensywność lasera 488 nm (niebieskiego) tak, aby fluorescencja GCaMP5 była widoczna tylko na końcu presynaptycznym nad tłem. To niskie ustawienie zapobiega nasyceniu pikseli GCaMP5, gdy fluorescencja wzrasta w odpowiedzi na silne stany nieustalone Ca2+. Otwórz otwór konfokalny do końca, aby zmaksymalizować przechwytywanie światła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie ratiometryczne Ca2+ i rejestracja zachowania
<ol>
	<li>W zakładce "Sekwencja" w oprogramowaniu do akwizycji fluorescencji kliknij "Start", aby rozpocząć nagrywanie. Śledź robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość na interesujących komórkach i synapsach w centrum pola widzenia (FOV). Kliknij przycisk "Statystyki" w oknie histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli każdego kanału.</li>
	<li>Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalną jednopikselową fluorescencję mCherry na końcu presynaptycznym wynoszącą ≥ 8 000 zliczeń (~ 4 000 fotoelektronów), co daje ~ 12-bitowy zakres dynamiki powyżej tła (~ 100 fotoelektronów). Sygnały GCaMP5 na końcu presynaptycznym podczas spoczynku (niskiego) Ca2+ powinny mieć około ~ 2,500 zliczeń - tylko widoczne nad tłem.</li>
	<li>Nagrywaj do momentu osiągnięcia jednego stanu aktywnego składania jaj; zwykle dzieje się to co 20-30 minut u robaka typu dzikiego7. Zapisz 10-minutowy podzbiór (12 001 klatek), 6 000 klatek przed i po pierwszym zdarzeniu składania jaj (klatka 6 001). Upewnij się, że zachowałeś ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaków i punktów czasowych pozycji stolika XY, w przeciwnym razie precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona.</li>
	<li>Użyj ImageJ i wtyczki BioFormats (patrz Spis materiałów), aby przekonwertować sekwencje obrazów do formatu Image Cytometry Standard (.ics), aby można je było zaimportować do oprogramowania Ratiometric Quantitation.</li>
</ol>
4. Segmentacja obrazów i analiza ilościowa
<ol>
	<li>Zaimportuj sekwencje obrazów do oprogramowania Ratiometric Quantitation (patrz Tabela materiałów). Kliknij "Automatyczny kontrast" w menu "Narzędzia" i dostosuj kontrast każdego kanału, aby ustalić odpowiednie poziomy czerni (~ 1 800) i bieli (10 000). Wybierz opcję "Zmień kolory..." w menu Narzędzia, aby potwierdzić, że przypisania kolorów kanałów mCherry i GCaMP5 są poprawne (Rysunek 4A - C).
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy szereg czasowy w zakładce "Sekwencja" i ustaw go na 20 klatek/s i 1,25 μm/piksel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz "Proporcje" z menu "Narzędzia" i wybierz "GCaMP5" dla "Kanału A" i "mCherry" dla "Kanału B". Kliknij "Oblicz" obok "Próg", aby odjąć tło od każdej sekwencji obrazów. Zaznacz "Zastosuj tęczową tablicę LUT do kanału proporcji". 
	UWAGA: W przypadku nagrania ze średnim stosunkiem wyjściowym wynoszącym 0,3 (niskie Ca2+) i maksymalnym stosunkiem 2-3 (wysokie Ca2+) odpowiednia tabela przeglądowa będzie miała wartość od 0 (niebieski) do 1 (czerwony).</li>
	<li>Wygeneruj kanał współczynnika modulacji intensywności za pomocą kanału mCherry (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). Kanał Intensity Modulated Ratio to obraz składający się z milionów kolorów, w którym proporcje kolorów są odwzorowywane na jasność kanału mCherry.</li>
	<li>Na karcie "Pomiary" utwórz protokół wyszukiwania obiektów, przeciągając narzędzie "Znajdź obiekty przy użyciu intensywności" do panelu "Protokół". Kliknij "koło zębate", aby ustawić okno z wartościami intensywności mCherry i znaleźć obiekty.
	<ol>
		<li>Wybierz wartości intensywności ≥ 2 odchyleniami standardowymi (SD) powyżej tła (np. dolna granica ~ 2 500, górna granica 65 535). Upewnij się, że wykryto koniec presynaptyczny i że z menu Measurements (Pomiary) wybrano opcję "automatycznie aktualizuj informacje zwrotne". 
		UWAGA: Oprogramowanie może również identyfikować obiekty na podstawie ich odchylenia standardowego od tła przy użyciu powiązanego protokołu "Intensywność SD". Jeśli jednak szczególnie jasny obiekt wejdzie w pole widzenia, może radykalnie zmienić średnią intensywność w tych punktach czasowych, wpływając na odcięcia intensywności używane do znalezienia HSN. Ta zmienność nie wystąpi, jeśli do znajdowania obiektów używane są surowe wartości intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby dodaj dodatkowe filtry ukierunkowane tylko na kanał mCherry (rozmiar, maksymalna intensywność itp.), aby wykluczyć niepożądane obiekty, takie jak fluorescencja głowy, ogona i jelit. Wybierz opcję "Utwórz element pomiaru" z menu Pomiary i wybierz "Wszystkie punkty czasowe" 
	UWAGA: Spowoduje to wykonanie protokołu, zapisując wszystkie pomiary do pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (.csv), który należy wyeksportować za pomocą polecenia "export" w menu Plik.</li>
	<li>Otwórz plik exported.csv i skopiuj dane punktu czasu, obszaru (μm2), średniej (kanał stosunkowy), środka ciężkości X (μm) i środka ciężkości Y (μm) do nowego arkusza. Eksportuj plik a.csv bez nagłówków kolumn. Oprogramowanie do ilościowego określania wskaźnikowego może sklasyfikować komórkę zainteresowania jako jeden lub więcej obiektów na punkt czasowy.
	<ol>
		<li>Aby ponownie połączyć te obiekty, użyj niestandardowego skryptu "AnalzyeGCaMP_2017.m". 
		UWAGA: Skrypt identyfikuje również piki Ca2+ (stosunek) w danych i zapisuje a.csv plik z ich punktami czasowymi, amplitudami pików i szerokościami pików. Generuje również pliki postscript dla nieprzetworzonych i adnotowanych ścieżek proporcji. Na podstawie tych informacji należy określić amplitudę przejściową Ca2+ i interwał między stanami przejściowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj wyjściowe wartości środka ciężkości X i Y z każdego obiektu fluorescencji do wartości X i Y zarejestrowanych przez skrypt etapu XY z Bonsai. Użyj pozycji XY netto, aby wygenerować ślad lokomocji robaka i obliczyć przemieszczenie i prędkość komórki, które towarzyszą różnym stanom zachowania31.</li>
	<li>Zaimportuj zarejestrowane obrazy w jasnym polu do ImageJ jako wirtualny stos. Opisuj wydarzenia związane ze składaniem jaj i inne zachowania. Porównaj czas tych zdarzeń z pikami Ca2+ ze śladu ilorazowego.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Transgeny:
Ponieważ ekspresja mCherry została poprawiona poprzez optymalizację kodonów i insercję intronów (a większość dostępnych reporterów GCaMP tego nie zrobiła), wstrzyknij ~ 4 razy więcej plazmidu eksprymującego GCaMP5, aby zapewnić porównywalne poziomy fluorescencji GCaMP5 podczas silnych stanów przejściowych Ca2 +. Uratowanie mutacji lin-15 (n765ts) pozwala na łatwe odzyskanie transgenicznych zwierząt przy minimalnym wpływie na składanie jaj i inne zachowania35. Transgeny powinny być zintegrowane w celu zapewnienia jednolitych warunków ekspresji i obrazowania u różnych zwierząt25. Selektywne markery, w tym oporność na antybiotyki36,37 i ratowanie wrażliwych na temperaturę letalów38 również powinny działać, ale ponieważ zwierzęta nietransgeniczne są martwe, potwierdzenie integracji transgenu i homozygotyczności jest trudniejsze w porównaniu z markerami, które prezentują widoczny fenotyp25. Należy unikać dominujących markerów, które zakłócają normalną lokomocję i zmniejszają sprawność, takich jak rol-6(dm)39. Obrazowanie w zmutowanym tle lite-1 jest niezbędne do zmniejszenia reakcji ucieczki światła niebieskiego podczas obrazowania 23,40,41. Dodatkowa mutacja gur-3, która działa równolegle do lite-1, może dodatkowo zminimalizować zachowanie resztkowe i zmiany fizjologiczne spowodowane przez niebieskie światło42. Dogodnie, gur-3, lite-1 i lin-15 znajdują się w prawej połowie chromosomu X, co powinno uprościć budowę nowych szczepów do obrazowania Ca2+ i eksperymentów optogenetycznych.
Ponieważ czasy naświetlania są krótkie, a obrazy są zbierane z częstotliwością 20 Hz, sygnały GCaMP5 i mCherry muszą być jasne. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem hałaśliwych nagrań Ca2+ jest słaba fluorescencja spowodowana słabą ekspresją reporterową. Promotorzy powinni być również odpowiednio dokładni dla regionu, który jest fotografowany. Ponieważ ciało komórki HSN i synapsy na mięśniach sromu znajdują się w centrum ciała, dodatkowa ekspresja z promotora nlp-3 w głowie i ogonie jest zwykle poza polem widzenia i może być wykluczona za pomocą dodatkowych filtrów w oprogramowaniu Ratiometric Quantitation. Aby upewnić się, że obserwowane zmiany we fluorescencji GCaMP5 wynikają z rzeczywistych zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+, transgeny kontrolne eksprymujące GFP zamiast GCaMP5 powinny być niezależnie przygotowane i przeanalizowane26. Nowsze reportery Ca2+ o różnej czułości Ca2+, kinetyce i kolorach rozszerzyły wybór dostępnych narzędzi do obrazowania, ale każdy nowy reporter powinien być walidowany przy użyciu niewrażliwego na Ca2+ wariantu fluorescencyjnego14,16.
Media:
Płytki NGM do obrazowania powinny być przygotowane z wysokiej jakości agaru. Agar niższej jakości nie rozpuści się całkowicie po autoklawowaniu, pozostawiając małe cząstki, które rozpraszają światło podczas obrazowania i zwiększając fluorescencję tła. Zamiast tego można użyć agarozy klasy biologii molekularnej, ale dodana ilość powinna zostać zmniejszona, aby utrzymać równoważną twardość płytki.
Porównania z innymi metodami montażu:
Poprzednie podejścia do aktywności obrazu w obwodzie zachowania składania jaj wykorzystywały robaki unieruchomione klejem do podkładki agarozowej. W tych warunkach aktywność obwodu i zachowanie związane ze składaniem jaj nie są korzystne bez zmniejszenia osmolarności pożywekhodowlanych 8,10,44,45. Ostatnie dowody sugerują, że kilka zachowań robaków jest modulowanych przez stan lokomocji, co rodzi pytania o związek aktywności komórek obserwowanej u unieruchomionych zwierząt z tą obserwowaną u swobodnie zachowujących się zwierząt. Wykazaliśmy niedawno, że aktywność obwodu składania jaj jest nieoczekiwanie fazowana wraz z lokomocją26,27. Podobnie, podzielona na przedziały sygnalizacja Ca2 + w interneuronie RIA integruje aktywność neuronów czuciowych i neuronów ruchowych głowy podczas ruchów żerowania46. Zachowaniom defekacyjnym towarzyszy również precyzyjna i stereotypowa zmiana w lokomocji, która pozwala zwierzętom oddalić się od miejsca żerowania przed wydaleniem odpadów47. Łącznie wyniki te sugerują, że krótkie zapisy aktywności obwodów u unieruchomionych zwierząt mogą zasadniczo różnić się od tych uzyskanych u swobodnie zachowujących się zwierząt.
Pomimo tego, że robak znajduje się bezpośrednio pod szkiełkiem nakrywkowym, zachowanie przypomina to, co można zobaczyć na standardowych płytkach NGM. Złożone jaja wykluwają się, a niewielka ilość zdeponowanego pokarmu pozwala larwom L1 wyrosnąć na dorosłe osobniki (dane nie pokazane). Duży rozmiar kawałka agaru pozwala na rozsądną wymianę gazową i jest odporny na odwodnienie, chociaż zbyt duża ilość jedzenia zwiększy fluorescencję tła. Chociaż ta metoda działa najlepiej w przypadku dorosłych, technika ta może być również stosowana do obrazowania zwierząt L4. Jednak grubość warstwy wodnej między kawałkiem a szkiełkiem nakrywkowym jest taka, że mniejsze larwy mają trudności z czołganiem się i często mogą zostać uwięzione w śladzie poruszającego się dorosłego osobnika.
Ograniczeniem tej techniki montażu jest to, że bezpośrednia mechaniczna lub chemiczna stymulacja określonych obszarów ciała jest trudna. Ostatnie osiągnięcia w technikach oświetlenia wzorzystego pozwalają na oddzielne wzbudzenie opsyn mikrobiologicznych wyrażanych na głowie lub ogonie z oddzielnym oświetleniem i wykrywaniem fluorescencji GCaMP/mCherry w środkowej części ciała48,49. W rezultacie, być może uda się przezwyciężyć ten problem za pomocą podejść optogenetycznych.
Porównania z innymi metodami obrazowania Ca2+:
Metoda ta bardzo dobrze sprawdza się w rejestrowaniu zmian w cytoplazmatycznym Ca2+ z pojedynczych, rozdzielczych komórek i ich regionów synaptycznych. Obrazowanie wolumetryczne neuronów w głowie w czasie rzeczywistym zostało ostatnio osiągnięte przy użyciu położenia jąder komórkowych do identyfikacji komórek i ilościowego określenia zmian w wapniu nukleoplazmatycznym 50,51,52. Związek między jądrowym i synaptycznym Ca2+ pozostaje niejasny. Nasze dane sugerują, że najbardziej rzucające się w oczy zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 + HSN występują na końcach presynaptycznych z dala od somy komórki (ryc. 4D). Presynaptyczne końce neuronów HSN i VC są osadzone w postsynaptycznych mięśniach sromu26. Nie jest jasne, czy rozdzielczość w wymiarze Z byłaby wystarczająca nawet przy użyciu technik wirującego dysku lub arkusza świetlnego, aby przypisać presynaptyczne sygnały Ca2 + do określonych komórek bez polegania w jakiś sposób na somatycznym wapniu w celu identyfikacji komórek. Korzystając z opisanych tutaj technik, każde 10-minutowe, dwukanałowe nagranie z 12 001 16-bitowymi obrazami TIFF o rozdzielczości 256 x 256 pikseli wynosi ~4 GB. Kanały z modulacją współczynnika i intensywności podwajają rozmiar pliku do ~ 8 GB. Typowy eksperyment z udziałem 10 zwierząt z każdego z dwóch genotypów (dzikiego i eksperymentalnego) generuje prawie 150 GB danych pierwotnych, a ich zebranie i analiza wymaga 20 godzin. Analizy wolumetryczne z 10 warstwami Z na punkt czasowy wymagałyby o rząd wielkości więcej danych i czasu analitycznego, co wyjaśnia, dlaczego przeprowadzono tak niewiele takich badań.
Sprzęt:
Rejestrujemy i analizujemy sekwencje obrazów na dwuprocesorowych stacjach roboczych z wysokowydajnymi kartami graficznymi (np. do gier), 64 GB pamięci RAM i wysokowydajnymi dyskami półprzewodnikowymi (patrz tabela materiałów). Dane powinny być przechowywane na nadmiarowej macierzy niezależnych dysków (RAID) w sieci i tworzone są kopie zapasowe w chmurze w zewnętrznym centrum danych.
Zalecamy stosowanie skolimowanych diod LED o dużej mocy do impulsowego wzbudzenia fluorescencji nad metalohalogenkowymi lub rtęciowymi źródłami światła. Dostępnych na rynku jest kilka dostępnych na rynku wielokolorowych systemów LED. Podczas gdy niektóre z tych systemów LED mają wyższy koszt początkowy, mają długą żywotność (> 20 000 godzin), mogą jednocześnie wzbudzać cztery lub więcej różnych fluoroforów i oferują precyzyjną kontrolę czasową za pomocą interfejsu szeregowego i/lub TTL o niskim opóźnieniu (czas przełączania 10-300 μs). Wyzwalanie zapewnia, że próbka jest podświetlana tylko wtedy, gdy dane są faktycznie zbierane. Zazwyczaj stosujemy ekspozycję 10 ms co 50 ms (20% stawki pracy). Zmniejsza to fototoksyczność i rozmycie ruchu podczas przechwytywania obrazu, jak wcześniej informowano43.
Używamy kamer sCMOS ze względu na ich szybkość i dużą gamę małych, czułych pikseli. Kamera EM-CCD jest droższą alternatywą, ale efekty "rozkwitu" mogą spowodować, że przechwycone fotoelektrony rozleją się na sąsiednie piksele. Nowe kamery sCMOS w technologii BSI mają podobną czułość na światło jak EM-CCD przy znacznie niższych kosztach. Niezależnie od tego, który czujnik jest używany, kanały GCaMP5 i mCherry muszą być uzyskane jednocześnie. Sekwencyjne przechwytywanie w poruszających się robakach doprowadzi do źle zarejestrowanych obrazów, które nie nadają się do ilościowego pomiaru ratiometrycznego. Obrazowanie dwukanałowe można wykonać w jednej kamerze po podziale kanałów za pomocą rozdzielacza obrazu (ilustracja 2) lub przy użyciu dwóch identycznych kamer. Zakres dynamiczny obrazów 16-bitowych jest zalecany w stosunku do obrazów 8-bitowych w celu dokładnego ilościowego określenia proporcji. W przypadku obrazów zachowania robaków w jasnym polu rejestrujemy je za pomocą 1 cala. Kamera USB3 o rozdzielczości 4,1 MP w bliskiej podczerwieni do przechwytywania dużych 8-bitowych sekwencji obrazów 2 x 2 binned 1 024 x 1 024 po kompresji JPEG. Większe pole widzenia dostępne w nowszych modelach mikroskopów pozwala na wizualizację dorosłego robaka z 20-krotnym powiększeniem po 0,63-krotnym powiększeniu przy niewielkim winietowaniu (Rysunek 4E).
Zalecamy używanie standardowych sygnałów napięciowych TTL do synchronizacji oświetlenia i przechwytywania klatek. Ze względu na potencjalne opóźnienia w różnych programach, zalecamy użytkownikom skonfigurowanie kamery fluorescencyjnej z wyjściami wyzwalającymi jako głównej z wyjściami TTL sterującymi wszystkimi innymi urządzeniami. W ten sposób informacje o jasnym polu i położeniu sceny będą zbierane dla każdego pomiaru Ca2+ .
Szczelinowe lub rezonansowe mikroskopy konfokalne ze skaningiem punktowym, zwykle spotykane we wspólnych obiektach konfokalnych, zapewniają również doskonałą wydajność podczas ratiometrycznego obrazowania Ca2+ . Takie instrumenty mogą być używane do przechwytywania dwóch lub więcej kanałów fluorescencyjnych wraz z jasnym polem24. W takim przypadku otwór konfokalny powinien być otwarty do maksymalnej średnicy, a detektor spektralny powinien być użyty do oddzielenia sygnałów GCaMP5, mCherry i podczerwonego jasnego pola. Maksymalizuje to zbieranie światła z grubego (~ 20 μm) warstwy, jednocześnie umożliwiając odrzucenie nieostrej fluorescencji. Jednym minusem jest mniejsze pole widzenia i więcej ograniczeń dotyczących dostosowywania sprzętu i oprogramowania.
Oprogramowanie:
Większość producentów dostarcza i instaluje swoje kamery i mikroskopy z zastrzeżonym oprogramowaniem, w tym konfiguracją wejść i wyjść wyzwalających. Funkcje i wydajność tego oprogramowania podczas nagrywania mogą się różnić. Ponieważ szybko poruszające się robaki mogą być trudne do śledzenia, wyświetlanie obrazu podczas nagrywania musi być płynne i stabilne przy 20 Hz. Aby poprawić wydajność, sekwencje obrazów mogą być tymczasowo zapisywane w pamięci RAM z podzbiorami istotnymi dla zachowania zapisanymi na końcu eksperymentu. Te dwukanałowe pliki sekwencji obrazów można przekonwertować do otwartego formatu Image Cytometry Standard (.ics) w celu zaimportowania do oprogramowania Ratiometric Quantitation. OME-TIFF to nowszy format obrazu typu open source, chociaż różne instalacje mogą nie być w stanie zapisać sekwencji obrazów TIFF większych niż 4 GB.
Kluczową cechą procesu kwantyfikacji jest wygenerowanie kanału proporcji, a następnie bezstronna procedura segmentacji obrazu przy użyciu fluorescencji mCherry w celu znalezienia interesujących komórek. Z każdego znalezionego obiektu obliczany jest rozmiar obiektu, położenie środka ciężkości XY oraz minimalne, średnie i maksymalne wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału (w tym kanału stosunkowego). Razem wartości te są wykorzystywane do ilościowego określania zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+ w każdym punkcie czasowym nagrania. Pomiary obiektów dla każdego punktu czasowego są następnie eksportowane jako plik a.csv celu przeprowadzenia kolejnych analiz.
Głównym ograniczeniem opisanego tutaj protokołu jest zależność od przenoszenia danych w różnych formach przez mozaikę produktów programowych. Dodatkową irytacją jest to, że niektóre programy są otwarte i bezpłatne, podczas gdy inne są zamknięte, drogie i nierównomiernie aktualizowane. Dużym ulepszeniem byłoby użycie lub opracowanie jednego oprogramowania (najlepiej open source), które zapewnia podobny poziom wydajności i łatwości obsługi od momentu pozyskania do analizy. Jak wspomniano powyżej, analiza ratiometryczna podwaja zarówno rozmiar pliku, jak i czas wymagany do ukończenia eksperymentu. Generowanie sterowników kamery, które można zintegrować z konfigurowalnymi przez użytkownika strukturami, takimi jak Bonsai, umożliwiłoby zbieranie i analizowanie obrazów i innych strumieni danych w czasie rzeczywistym, znacznie poprawiając przepustowość.
Perspektywy na przyszłość:
Podczas gdy zazwyczaj śledzimy ruchy robaków ręcznie, śledzenie środka ciężkości robaka wykrytego w nagraniach w podczerwieni w jasnym lub ciemnym polu powinno pozwolić na dodatkowe węzły przetwarzania obrazu, które zapewniają regulację pozycji stolika w pętli zamkniętej i automatyczne śledzenie (Rysunek 3 i dane nie pokazane). Większość zapisów fluorescencyjnych uzyskanych tą metodą jest ciemna i pozbawiona interesujących biologicznie danych. Techniki przetwarzania obrazów po akwizycji na podstawie czujnika lub w czasie rzeczywistym, które przycinają sekwencje obrazów do odpowiednich obiektów, pozwoliłyby na zwiększenie rozdzielczości przestrzennej i przyspieszyłyby proces analizy danych, szczególnie jeśli dla każdego punktu czasowego zbierane są dodatkowe wycinki Z w celu wizualizacji aktywności we wszystkich komórkach pre- i postsynaptycznych w obwodzie.

Głównym celem neuronauki jest zrozumienie, w jaki sposób neurony komunikują się w obwodach, aby kierować zachowaniem zwierząt. Obwody neuronalne integrują szereg różnych sygnałów sensorycznych w celu zmiany aktywności obwodu, napędzając w ten sposób zmiany behawioralne niezbędne zwierzętom do reagowania na ich środowisko. Nicień, C. elegans, ma prosty układ nerwowy z 302 neuronami, których połączenia synaptyczne zostały całkowicie zmapowane1. Dodatkowo, geny kodujące białka zaangażowane w neuroprzekaźnictwo są wysoce konserwatywne między C. elegans a ssakami2. Pomimo anatomicznej prostoty układu nerwowego, wykazuje złożony repertuar zachowanych zachowań, zapewniając żyzną platformę do zrozumienia, w jaki sposób neurony regulują zachowanie3.
C. elegans jest podatny na zastosowanie szerokiej gamy podejść, takich jak manipulacja genetyczna, laserowa ablacja komórek, techniki elektrofizjologiczne, a także obrazowanie optyczne in vivo4,5. Ostatnie badania stworzyły szczegółowe mapy głównych systemów sygnalizacji neuroprzekaźników u C. elegans, w tym cholinergicznych i GABA-ergicznych sieci neuronalnych. Badania te, wraz z trwającymi badaniami mającymi na celu mapowanie ekspresji wszystkich neuronalnych receptorów sprzężonych z białkiem G, stawiają ten model w wyjątkowej pozycji do wykorzystania bardzo szczegółowych map strukturalnych i funkcjonalnych połączeń neuronalnych, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób te różne neuroprzekaźniki sygnalizują przez różne receptory i skale czasowe, aby sterować różnymi aspektami zachowania zwierząt.
Aby badać dynamiczne wzorce aktywności neuronalnej w dowolnym systemie, niezbędnym warunkiem wstępnym jest opracowanie solidnych metodologii rejestrowania aktywności w pojedynczych neuronach lub całych obwodach podczas zachowań. Szczególnie ważna jest możliwość stosowania takich podejść optycznych do wizualizacji aktywności presynaptycznej, która napędza fuzję pęcherzyków synaptycznych. Szybkie i bardzo czułe reportery fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego Ca2+, wraz z rosnącą dostępnością czułych fotodetektorów, zrewolucjonizowały rejestrację aktywności komórek i synaps u obudzonych, żywych zwierząt podczas zachowania. Ponieważ głównym wynikiem synaptycznej aktywności elektrycznej jest regulacja kanałów Ca2 +, uważa się, że zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 + wiernie oddają behawioralnie istotne zmiany w aktywności komórki.
W tym badaniu prezentujemy podejście do wykonywania ratiometrycznego obrazowania Ca2+ w serotoninergicznym neuronach ruchowych HSN, które promują zachowania związane ze składaniem jaj u C. elegans6,7. Podejście to opiera się na wcześniejszych wysiłkach mających na celu wizualizację aktywności Ca2+ u C. elegans i obwodu składania jaj podczas zachowania5,8,9,10,11. Metoda pozwala na jednoczesne skorelowanie obserwowanych zmian w aktywności komórek/obwodów ze zdarzeniami związanymi ze składaniem jaj, a także zmianami w stanie lokomotorycznym zwierząt. Chociaż używamy tego podejścia do badania aktywności u dorosłych robaków, niepublikowane prace z naszego laboratorium pokazują, że podejście to można rozszerzyć również na młode zwierzęta w czwartym stadium larwalnym (L4). Jest prawdopodobne, że aktywność innych neuronów C. elegans, które funkcjonują w odrębnych obwodach i zachowaniach, powinna być podobnie dostępna za pomocą tej techniki. Inne niedawno opracowane szybkie wskaźniki Ca2+ z nienakładającymi się widmami emisji12,13,14,15,16, narzędzia optogenetyczne17, oraz genetycznie kodowane wskaźniki optyczne napięcia membrany18, powinny pozwolić nam na przeprowadzenie wnikliwych "całkowicie optycznych" badań nad tym, w jaki sposób zmiany w aktywności obwodów nerwowych napędzają różne stany zachowania.

<table><tbody><tr><td>C. elegans wzrost, uprawa i montaż</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli szczep bakterii, OP50</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>OP50</td><td>Pokarm dla C. elegans. Uracyl auksotrof. E. coli B. Poziom bezpieczeństwa biologicznego 1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5 + mSzczep robaka wiśniowego</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>LX2004</td><td>Zintegrowany transgen wykorzystujący promotor nlp-3 do napędzania ekspresji GCaMP5 i mCherry w HSN.&nbsp; Pełny genotyp:&nbsp; vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X</td></tr><tr><td>lite-1(ce314), lin-15(n765ts) do przygotowania transgenu</td><td>autor</td><td>LX1832</td><td>Szczep do odzyskiwania transgenów o wysokiej kopii po mikroiniekcji plazmidem ratunkowym pL15EK lin-15(n765ts). Posiada również mutację linked lite-1(ce314), która zmniejsza wrażliwość na światło niebieskie. Dostępne od autora na żądanie</td></tr><tr><td>pL15EK lin-15a/b genomiczny plazmid ratunkowy</td><td>autor</td><td>pL15EK</td><td>Plazmid ratunkowy do odzyskiwania zwierząt transgenicznych po wstrzyknięciu do szczepu LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X. Dostępne od autora na życzenie</td></tr><tr><td>pKMC299 autor plazmidu</td><td></td><td>pKMC299</td><td>Plazmid do ekspresji mCherry w HSN z promotora nlp-3. Posiada nlp-3 3' nietranslowany region</td></tr><tr><td>plazmidu pKMC300 autor plazmidu</td><td></td><td>pKMC300</td><td>Plazmid do ekspresji GCaMP5 w HSN z promotora nlp-3. Ma nlp-3 3' nietranslowany region</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Dibasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11470</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Agar, Bakteriologiczny typu A, Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>Do przygotowania płytek NGM</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-164&nbsp;</td><td>Do przygotowania płyt NGM</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe 24 x 60 mm, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>Szkło nakrywkowe, przez które obrazowane są robaki</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe 22 x 22 mm, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Szkło nakrywkowe, które zakrywa górną część kawałka agaru</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z podstawą światła przechodzącego</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Mikroskop preparacyjny do konserwacji, etapowania i montażu szczepu robaka</td></tr><tr><td>Drut platynowo-irydowy, (80:20), 0,2 mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>Do przenoszenia ślimaków</td></tr><tr><td>Mikroskop do obrazowania wapnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antywibracyjny stół powietrzny</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>Micro-g' Stół laboratoryjny 30" x 48" z 4" CleanTop M6 na górze 25mm</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop złożony</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 odwrócony mikroskop</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3-pozycyjny)</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>Aby przekierować 20% mocy wyjściowej do kamery w jasnym polu (CMOS), 80% do kamery fluorescencyjnej (sCMOS)</td></tr><tr><td>Oświetlenie odchylane do tyłu Carrier</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu</td></tr><tr><td>Obudowa lampy 12V/100W z/ Kolektor</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu</td></tr><tr><td>Lampa halogenowa 12V/ 100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu. Diody LED ze światłem białym nie emitują znacznego światła podczerwonego, więc nie pozwolą na obrazowanie w jasnym polu po filtrze pasmowo-przepustowym podczerwieni</td></tr><tr><td>32 mm Filtr pasmowoprzepustowy podczerwieni (750-790 nm) do lampy halogenowej</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790; DMR 32mm, do oświetlenia w podczerwieni dla jasnego pola i zachowania</td></tr><tr><td>6-filtrowa głowica rewolwerowa skraplacza (LD 0.55 H/DIC/Ph), zmotoryzowana</td><td>Zeiss</td><td>424244-0000-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej</td></tr><tr><td>Kondensator i Migawka</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni / zachowaniu</td></tr><tr><td>Okular lornetkowy z fototubusem do kamery CMOS na podczerwień</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>Do obrazowania w podczerwieni / behawioralnej</td></tr><tr><td>Okular 10x, 23mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>Do lokalizacji robaka na kawałku agaru</td></tr><tr><td>Adapter C-Mount 2/3" 0,63x demagnifier</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>Mocowanie do Kamera CMOS</td></tr> na <tr><td>podczerwień Kamera CMOS do jasnego pola podczerwieni i zachowania (czujnik 1")</td> <td>FLIR (dawniej Point Grey Research)</td> <td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Kamera do obrazowania w jasnym polu</td></tr><tr><td>Karta kontrolera hosta USB 3.0</td><td>FLIR (dawniej Point Grey Research)</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4</td></tr><tr><td>porty 8 pinów, GPIO 1 m, okrągłe złącze Hirose HR25&nbsp;</td><td>FLIR (dawniej Point Grey Research)</td><td>ACC-01-3000</td><td>do wyzwalania TTL. Zielony przewód łączy się z GPIO3 / Pin 4, a brązowy przewód łączy się z uziemieniem / Pin 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>Najlepsza kombinacja powiększenia, apertury numerycznej i odległości roboczej</td></tr><tr><td>6-sześcienna wieżyczka reflektorowa, zmotoryzowana</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny pociąg świetlny, zmotoryzowany</td><td>Zeiss</td><td>423607-0000-000</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Migawka fluorescencyjna</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Kostka filtra z podwójnym wzbudzeniem i emisją GFP i mCherry (do mikroskopu)</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>Zestaw filtrów FL 62 HE BFP+GFP+HcRed do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>System oświetlenia LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Wyzwalany system LED Colibri.2 do oświetlenia fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Moduł LED GFP (470 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji GFP</td></tr><tr><td>Moduł mCherry LED (590 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji mCherry</td></tr><tr><td>Suwak zatrzymania przysłony do urządzeń ze światłem padającym</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>Przysłona polowa ograniczająca oświetlenie LED do pola widzenia kamery</td></tr><tr><td>Adapter C-Mount 1" 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>Adapter do rozdzielacza obrazu i kamery fluorescencyjnej sCMOS</td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, można używać innych rozdzielaczy obrazu, ale mogą one nie być zoptymalizowane pod kątem dużego rozmiaru matrycy kamer sCMOS</td></tr><tr><td>GFP / mCherry zwierciadło dichroiczne (rozdzielacz obrazu)</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>Rozdzielanie GCaMP5 z mCherry i podczerwieni sygnały</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny GFP (rozdzielacz obrazu)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>Przechwytywanie fluorescencji GCaMP5</td></tr><tr><td>mCherry/ filtr emisyjny (rozdzielacz obrazu)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>Ten filtr jest niezbędny, aby wykluczyć światło podczerwone używane do obrazowania w jasnym polu</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS do fluorescencji (czujnik 1")</td> <td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>Orca FLASH 4.0 V2. Nowsze modele pozwalają na osobne ustawienia akwizycji obrazu na osobnych połówkach matrycy, umożliwiając akwizycję obrazów dwukanałowych w połączeniu z rozdzielaczem obrazu</td></tr><tr><td>Motorized XY Stage</td><td>M&auml; RZH&AUML; użytkownik</td><td>SCAN IM 130 x 100</td><td>Ruch stolika; rozdzielczość XY tego stolika wynosi 0,2&mikro; m na krok&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontroler XY Stage z joystickiem</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, joystick XY</td><td>Ręczne śledzenie robaków. MAC6000 kontroler należy podłączyć do komputera PC poprzez port szeregowy (RS-232) skonfigurowany do 115200 bodów</td></tr><tr><td>Digital Acquisition Board (DAQ)</td> <td>Arduino</td><td>Uno</td><td>Odbieranie wyzwalaczy TTL z kamery sCMOS. Uno powinien być załadowany standardowym pakietem Firmata, a port USB komputera skonfigurowany do 57600 bodów</td></tr><tr><td>BNC męski na męski BNC - 6 stóp</td><td>Złącza Hosa Technology</td><td>HOBB6</td><td>BNC do wyzwalania TTL</td></tr><tr><td>Pozłacany koncentryczny BNC męski na męski SMA (8,8")</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>Do podłączenia wyjść wyzwalających kamerę fluorescencyjną</td></tr><tr><td>adapter głowicy obrotowej BNC</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>Przejściówka BNC na wtyk bananowy (4mm)</td></tr><tr><td>Złącze BNC żeńskie na żeńskie</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>Adapter BNC żeński na żeński do podłączenia wyjścia BNC z kamery do wtyku bananowego</td></tr><tr><td>Bezlutowane elastyczne przewody połączeniowe do płytki stykowej</td><td>Z& T</td><td>GK1212827</td><td>Aby podłączyć wyjścia wyzwalające BNC do Arduiono DAQ.&nbsp; Mężczyzna do mężczyzny.</td></tr><tr><td>Wysokowydajna stacja robocza</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64 GB pamięci RAM, procesor Dual Xeon, dysk półprzewodnikowy C: dysk, port szeregowy (RS-232), wiele gniazd PCIe3 do łączności Ethernet, karty USB 3.0 i dodatkowe dyski półprzewodnikowe</td></tr><tr><td>Dysk SSD M.2</td><td>Samsung</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>Szybkie przesyłanie strumieniowe i analiza danych obrazu</td></tr><tr><td>Adapter dysku SSD M.2&nbsp; dla stacji roboczych</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>Adapter M.2 do PCIe 3.0 4-pasmowy</td></tr><tr><td>Sieciowa pamięć masowa</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td> <td>Przechowywanie i analiza danych obrazowania</td></tr><tr><td>Dyski twarde</td><td>Western Digital</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB, klasa 5400 obr./min SATA 6 Gb/s 128 MB pamięci podręcznej 3,5 cala. Przechowywanie danych obrazowania (10 dysków + redundancja 2 dysków)</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Acquisition</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>Nagrywanie dwukanałowych (GCaMP5 i mCherry) sekwencji obrazów fluorescencyjnych z prędkością 20 kl./s</td></tr><tr><td>Akwizycja jasnego pola</td><td>FLIR (dawniej Point Grey Research)</td><td>Flycapture</td><td>Nagrywanie sekwencji</td></tr> <tr><td>obrazów JPEG w jasnym poluStage Serial Port Reader</td><td>Bonsai</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>Ułatwia śledzenie robaków podczas zachowania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kontrolera LED</td><td>Test Zeiss</td><td>Micro Toolbox 2011</td><td>Aby ustawić intensywność i wejścia wyzwalające dla różnych diod LED w jednostce Colibri.2</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>Prosty przegląd sekwencji obrazów i zmian formatowania w celu importu do oprogramowania Ratiometric Quantitation</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>&nbsp; 2002984-001-000001</td><td>Do generowania podzbiorów danych o wartościach oddzielonych przecinkami z Volocity do analizy MATLAB</td></tr><tr><td>Znajdowanie pików</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>Skrypt używany do obliczeń cech piku współczynnika</td></tr><tr><td>Kwantymetryczne Atut kwantymetrycznej</td><td>Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Ułatwia obliczanie ratiometrycznych kanałów obrazu, segmentację obrazu w celu znalezienia obiektów i pomiar proporcji znalezionych obiektów</td></tr><tr><td>Scripts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsai</td><td>Bonsai</td><td>Czytnik DAQ i portu szeregowego wyzwalany przez TTL</td><td>Rejestruje pozycję stopnia X i Y (w mikronach), gdy dołączone Arduino odbiera dodatni sygnał TTL z kamery sCMOS podczas ekspozycji klatki. Skrypt zapisuje plik .csv z czterema kolumnami: numerem klatki, pozycją X (mikrony), pozycją Y (mikronami) i czasem, jaki upłynął między klatkami (zwykle ~50 ms przy nagrywaniu z prędkością 20 kl./s).&nbsp; Pozycje stolika X i Y z tego wyjścia (odpowiednio kolumny 2 i 3) są dodawane do pozycji środka ciężkości X i Y ze skryptu AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB (odpowiednio kolumny 4 i 5), aby uzyskać końcową pozycję X i Y obiektu fluorescencyjnego dla nagrania.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu caenorhabditis elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Staje się coraz bardziej jasne, że aktywność obwodów nerwowych u zachowujących się zwierząt znacznie różni się od tej obserwowanej u zwierząt znieczulonych lub unieruchomionych. Wysoce czułe, genetycznie kodowane fluorescencyjne reportery Ca2+ zrewolucjonizowały rejestrację aktywności komórek i synaps przy użyciu nieinwazyjnych podejść optycznych u zachowujących się zwierząt. W połączeniu z technikami genetycznymi i optogenetycznymi można zidentyfikować mechanizmy molekularne, które modulują aktywność komórek i obwodów podczas różnych stanów zachowania.
Tutaj opisujemy metody ratiometrycznego obrazowania Ca2+ pojedynczych neuronów u swobodnie zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans. Demonstrujemy prostą technikę montażu, która delikatnie nakłada robaki rosnące na standardowym bloku agarowym z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) szklanym szkiełkiem nakrywkowym, umożliwiając rejestrowanie zwierząt w wysokiej rozdzielczości podczas nieograniczonego ruchu i zachowania. Dzięki tej technice używamy czułego reportera Ca2 + GCaMP5 do rejestrowania zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2 + w serotoninergicznych neuronach hermafrodytycznych (HSN), gdy kierują one zachowaniem związanym ze składaniem jaj. Poprzez koekspresję mCherry, niewrażliwego na Ca2+ białka fluorescencyjnego, możemy śledzić położenie HSN w zakresie ~ 1 μm i korygować wahania fluorescencji spowodowane zmianami ostrości lub ruchu. Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu w podczerwieni pozwala na rejestrowanie zachowań i śledzenie zwierząt za pomocą zmotoryzowanego stolika. Integrując te mikroskopijne techniki i strumienie danych, możemy rejestrować aktywność Ca2+ w obwodzie składania jaj C. elegans w miarę jego przechodzenia między stanami nieaktywnego i aktywnego zachowania w ciągu kilkudziesięciu minut.

Opisana tutaj prosta technika montażu (Rysunek 1) powoduje minimalne zmiany w środowisku hodowlanym stadiów L4 oraz dorosłych C. elegans, umożliwiając jednocześnie rejestrację o wysokiej rozdzielczości u aktywnych zwierząt przez szkiełko podstawowe (Rysunek 4). Synchronizacja źródeł światła LED, sterowników stolika i czasów ekspozycji kamery pozwala na akwizycję danych z wielu strumieni z częstotliwością 20 frames/s przez maksymalnie 1 h. Średnie powiększenie (20x) z obiektywami o wysokiej aperturze numerycznej (0,7-0,8) zapewnia dobrą rozdzielczość przestrzenną regionu synaptycznego w obwodzie zachowania składania jaj, nawet przy binningu 4 x 4 piksele (1,25 µm/pixel). Symultaniczna akwizycja sygnałów fluorescencyjnych GCaMP5 i mCherry (Rysunek 4A, B) jest wykorzystywana do wygenerowania kanału stosunku piksel po pikselu, który kompensuje zmiany w ruchu i ostrości obrazu zwierzęcia (Rysunek 4D). Presynaptyczne zakończenie neuronów HSN jest tak duże, jak wiele ciał komórek neuronalnych u C. elegans, dzięki czemu zmiany stężenia presynaptycznego Ca2+ w HSN mogą być wyraźnie wizualizowane. Duże pole widzenia (FOV) kamery w jasnym polu podczerwieni pozwala na ręczne śledzenie nicienia podczas rejestracji (Rysunek 4E). Dla każdego osobnika zmiany wewnątrzkomórkowego Ca2+ mogą być skorelowane z zachowaniami widocznymi w obrazowaniu w jasnym polu, w tym z uwalnianiem jaj oraz zmianami w lokomocji (Rysunek 4E).
Ilościowe oznaczenie Ca2+ w neuronach HSN oraz prędkości potwierdza, że nicienie zmieniają sposób poruszania się podczas przechodzenia do zachowania składania jaj. Występują istotne różnice w prędkości nicieni przed, w trakcie i po aktywnym stanie składania jaj (Rycina 5A). Nie jest to spowodowane szumem właściwym dla systemu obrazowania lub śledzenia. Przybliżając pojedyncze zdarzenie składania jaj, obserwujemy silną zmianę fluorescencji GCaMP5 (ΔF/F) przed samym zdarzeniem, podczas gdy fluorescencja mCherry pozostaje relatywnie niezmieniona (Rycina 5B). Pomiar zmian stosunku GCaMP5:mCherry (ΔR/R) wyraźnie wykazuje przejściowy wzrost poziomu Ca2+ w HSN na około 4 s przed uwolnieniem jaja (Rycina 5B). Jednocześnie ze skurczem mięśni sromowych następuje wyraźne spowolnienie lokomocji nicienia, które kończy się w momencie uwolnienia jaja. Wcześniejsze wyniki wykazały, że cholinergiczne neurony ruchowe VC, unerwione przez neurony HSN, wykazują szczytową aktywność podczas silnych skurczów mięśni sromowych oraz podczas uwalniania jaj 8,10,27. Wykazaliśmy również, że optogenetyczna aktywacja neuronów VC powoduje natychmiastowe spowolnienie lokomocji, co sugeruje, że neurony VC mogą być aktywowane przez skurcz mięśni sromowych, spowalniając tym samym lokomocję aż do otrzymania sygnału zwrotnego o uwolnieniu jaja27.
Opisany system obrazowania i śledzenia umożliwia wizualizację organizacji przestrzennej zachowań związanych ze składaniem jaj (Rycina 5C). Jak wykazano wcześniej, nicienie wchodzą w fazę przedłużonego ruchu postępowego tuż przed wystąpieniem stanu aktywnego32. Nicienie spędzają większość czasu na żerowaniu na bakteriach w centrum fragmentu agaru. Przed wejściem w stan aktywny nicienie oddalają się od pożywienia, co zbiega się w czasie z pojawieniem się rzadkich przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w neuronach HSN. Aktywność HSN przechodzi następnie w fazę gwałtownych wyładowań, z kilkoma gęsto rozmieszczonymi impulsami Ca2+ w HSN, które podtrzymują proces składania jaj. Następnie nicienie często zawracają, wznawiają ruch postępowy i składają jaja w drodze powrotnej do pozycji startowej w pobliżu bakterii OP50. Przypuszczamy, że zmiany lokalnego stężenia O2 i/lub CO2 mogą wpływać na miejsce, w którym nicienie decydują się złożyć jaja33,34.
<img alt="Schemat równowagi statycznej z układem nicieni OP50 na płytce NGM do eksperymentu biologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. C. elegans technika montażu do obrazowania wysokiej rozdzielczości aktywności obwodu odpowiedzialnego za składanie jaj oraz powiązanego z nim zachowania. Góra, końcowy preparat widoczany z boku. Dół, końcowy preparat widziany przez spód dużego szkiełka nakrywki. Strzałki wskazują bakteryjny pokarm OP50, C. elegans robaki i jaja, uwięzione pomiędzy fragmentem agaru NGM a dużym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mikroskopu fluorescencyjnego; obrazowanie GFP, mCherry; pomiar Ca²⁺ i pozycji komórki; zachowanie nicieni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ratiometryczne obrazowanie Ca2+ w szerokim polu oraz rejestracja zachowania na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym. (A) Pozycja i zachowanie nicieni są rejestrowane w polu jasnym za pomocą obiektywu Plan-Apochromat 20x (0.8 NA) przy użyciu światła podczerwonego (750-790 nm) (fioletowe strzałki) emitowanego z lampy halogenowej przez fragment podłoża NGM. Do utrzymania nicienia w polu widzenia podczas rejestracji służy joystick i sterownik zmotoryzowanego stolika. Pozycja stolika (Δx, Δy) jest przesyłana do komputera przez port szeregowy. Białka GCaMP5 i mCherry ekspresowane w nicieniu są wzbudzane za pomocą diod elektroluminescencyjnych (LED) o długości fali 470 nm (niebieskie strzałki) i 590 nm (żółte strzałki). Emitowana fluorescencja GCaMP5 (zielone strzałki) i mCherry (pomarańczowe strzałki) wraz ze światłem podczerwonym przechodzi przez wielopasmowe lustro dichroiczne (patrz Tabela materiałów). Dzielnik wiązki 80/20 kieruje 20% światła przez reduktor 0.63x do rejestracji na kamerze CMOS czułej na podczerwień (fioletowa strzałka). Pozostałe 80% światła jest kierowane przez port boczny mikroskopu do rozdzielacza obrazu, który rozdziela fluorescencję GCaMP5 i mCherry na oddzielne połowy kamery sCMOS, jednocześnie usuwając podczerwone światło pola jasnego. Dane z obu kamer są przesyłane do komputera za pomocą kabli USB3. Porty wyzwalające z fluorescencyjnej kamery sCMOS (niebieskie) służą do wysyłania wyzwalaczy TTL +5V do systemu oświetlenia LED, podczerwonej kamery pola jasnego oraz cyfrowego urządzenia akwizycji danych (DAQ). (B) Sygnały wyjściowe TTL z wyzwalacza 3 są wykrywane przez DAQ na cyfrowym pinie nr 8 i przesyłane do komputera przez połączenie USB. Te wejścia cyfrowe wyzwalają komendę szeregową „where XY” ze skryptu oprogramowania Bonsai (XY-stage-final), która odczytuje pozycję X i Y stolika dla każdego zarejestrowanego obrazu fluorescencji GCaMP5/mCherry oraz obrazu podczerwonego. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat blokowy przetwarzania danych; szeregowe wejście/wyjście danych, parsowanie w języku Python, kompresja, wyjście do pliku CSV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Układ skryptu komunikacji szeregowej stołu XY-stage-final w programie Bonsai. Górny węzeł DigitalInput (różowy) odczytuje triggery TTL wchodzące do pinu nr 8 modułu DAQ. Dla każdego dodatniego napięcia TTL (zielony), DAQ tworzy znacznik czasu (niebieski) i wysyła ciąg znaków „Where XY?” (różowy) do sterownika stołu za pośrednictwem portu szeregowego (szary). Węzeł SerialStringRead (różowy) odczytuje odpowiedź z współrzędnymi X i Y ze sterownika stołu. Ciąg ten jest następnie przeliczany na mikrony i rozdzielany na współrzędne stołu X i Y. Na koniec cztery te strumienie są łączone za pomocą węzła zip (niebieski) i zapisywane w czterokolumnowym pliku .csv: licznik klatek odebranych sygnałów TTL (węzeł Range, różowy), współrzędne X i Y oraz odstęp między kolejnymi punktami czasowymi (zazwyczaj ~ 50 ms przy rejestracji z częstotliwością 20 Hz). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna środkowej części ciała, GCaMP5 i mCherry, dwukanałowa, pole jasne C. elegans." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne mikrografie fluorescencji HSN oraz obraz całego zwierzęcia w polu jasnym podczas zachowania składania jaj. (A-D) Jednoczesne obrazowanie ratiometryczne fluorescencji GCaMP5 i mCherry w neuronach HSN tuż przed wydaleniem jaja. Zakończenia presynaptyczne HSN zaznaczono grotami strzałek. (C) Nałożenie fluorescencji GCaMP5 i mCherry. (D) Stosunek GCaMP5:mCherry modulowany intensywnością; wysoki stosunek (kolor czerwony) wskazuje na wysoką wewnątrzkomórkową zawartość Ca2+ w zakończeniu presynaptycznym. (E) Obraz całego nicienia w polu jasnym tuż po złożeniu jaj. Groty strzałek wskazują przednią i tylną połowę wulwy, przez którą składane są jaja. Pasek skali dla wszystkich obrazów wynosi 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza obrazowania Ca²⁺ z wykorzystaniem stosunku GCaMP5:mCherry; wykres śledzi prędkość nicienia i zdarzenie uwalniania jaj." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Rejestracja Ca2+ w neuronach HSN i prędkości lokomocji podczas zachowania składania jaj. (A) Przebiegi zmian stosunku GCaMP5:mCherry w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe przejściowe wzrosty Ca2+ (ΔR/R; czerwone) wraz z chwilową prędkością nicienia (µm/s; niebieskie). Zdarzenia składania jaj są oznaczone grotami strzałek. (B) Przebiegi fluorescencji GCaMP5 w HSN (zielone; ΔF/F), fluorescencji mCherry (czerwone; ΔF/F), stosunku fluorescencji GCaMP5:mCherry (czarne; ΔR/R) oraz prędkości nicienia (niebieskie) w okolicach momentu uwalniania jaja. (C) Organizacja przestrzenna zachowań składania jaj i lokomocji podczas całego 10-minutowego zapisu. Tor ruchu nicienia uzyskano z informacji o stole XY, które dodano do pozycji centroidu HSN wyznaczonej na podstawie rejestracji fluorescencji mCherry. Oznaczono czas wystąpienia przejść HSN (czerwone koła), zdarzeń składania jaj (czarne groty strzałek) oraz początek i koniec rejestracji (zielone i niebieskie romby). Pasek skali odpowiada 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie ratiometrycznego obrazowania wapnia wpływu aktywności neuronu specyficznego dla hermafrodyty lub HSN na zachowanie Caenorhabditis elegans. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej dotyczące tego, w jaki sposób aktywność obwodów neurologicznych powoduje zmiany w zachowaniu zwierząt, gdy zwierzęta zmieniają stany behawioralne. Technika ta pozwala na rejestrowanie zmian w wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia przy wysokim stosunku sygnału do szumu, przy jednoczesnym śledzeniu zachowania i lokomocji zwierząt.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat aktywności neuronalnej u C. elegans, można ją również zastosować do innych przezroczystych systemów modelowych, w tym larw Drosophila i ryb zebry. Procedurę zademonstrują ze mną studenci Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal i Layla Nassar. Aby dosiąść zwierząt, najpierw nałóż pokarm bakteryjny OP50 z płytki agarowej z nasionami pożywki do wzrostu nicieni na dno kilofa z platynowymi robakami i użyj kilofa do przeniesienia około 20 późnych L czterech L-X 2 000 dla zwierząt wykazujących ekspresję wrażliwego reportera wapnia GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora N-L 3 P na płytkę pożywki wzrostowej z nasionami nicieni.Potwierdź obecność rozwijającego się sromu pod mikroskopem stereoskopowym jako wyraźnej ciemnej plamy otoczonej białym półksiężycem i inkubuj robaki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24-40 godzin. Pod koniec inkubacji nałóż OP50 na nowy zbiór i przenieś trzy robaki na niewysiewaną pożywkę wzrostową nicieni, pozostawiając niewielką porcję pokarmu na nowej szalce, aby robaki mogły się nimi żywić podczas obrazowania. Następnie użyj płaskiej, zaokrąglonej szpatułki, aby wyciąć kawałek o wymiarach 20 na 20 milimetrów z nieobsianej płytki i umieść go robakiem do dołu na jednej krawędzi czystego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 60 milimetrów i średnicy 1,5.Następnie ostrożnie wsuń kawałek agaru na środek szkiełka nakrywkowego i umieść szkiełko nakrywkowe numer jeden o wymiarach 22 na 22 milimetry na wierzchu kawałka agaru, aby zmniejszyć przywieranie i parowanie. Aby skonfigurować imager, umieść robaki na stoliku odwróconego mikroskopu i wybierz 20x subiektywny. Użyj okularów lornetki, aby wybrać robaka do obrazowania i przesuń filtr podczerwieni i umieść go nad kondensatorem.Otwórz odpowiedni program do analizy wideo i uruchom końcowy skrypt komunikacyjny etapu szeregowego XY. Kliknij CsvWriter i wybierz folder, w którym chcesz zapisać nagrane informacje o etapie X i Y. Następnie kliknij zielony grot strzałki, aby zainicjować urządzenie do akwizycji cyfrowej.W oprogramowaniu do nagrywania kamery na podczerwień w ustawieniach wybierz opcję Toggle Camera Control Dialog (Przełącz okno dialogowe sterowania kamerą). Następnie wybierz menu Niestandardowe tryby wideo i wybierz Tryb 1 i Format piksela Raw ósemka. W obszarze Trigger Stroke (Skok spustu) ustaw linię wejściową wyzwalacza na trzy, polaryzację na wysoką, a tryb na 14.Przełącz opcję Włącz, aby zatrzymać akwizycję klatek do momentu odebrania sygnału wyzwalania napięcia z kamery fluoryzacyjnej. Po otwarciu okna podglądu obrazu kliknij przycisk Nagraj i wybierz folder, w którym chcesz zapisać sekwencje obrazów. Wybierz tryb nagrywania buforowanego i zapisz obrazy w formacie JPEG.Następnie kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie, aby zainicjować przejęcie. Następnie otwórz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu do akwizycji kwiatów i ustaw czas ekspozycji na 10 milisekund, Binning na cztery X i Głębię obrazu na 16 bitów. Wybierz wyśrodkowaną podmatrycę kamery o szerokości 512 pikseli i wysokości 256 pikseli.Program automatycznie podzieli szeroki obraz na pół, aby wygenerować oddzielne kanały kwiatowe. Kliknij opcję Pokaż opcje wyzwalacza wyjściowego i ustaw wszystkie wyzwalacze na dodatnie. Upewnij się, że wyzwalacz pierwszy i wyzwalacz drugi są ustawione na Ekspozycja, a wyzwalacz trzeci jest ustawiony na Programowalny z okresem 25 milisekund.Następnie na karcie sekwencji wybierz opcję Upływ czasu W obszarze Ustawienia skanowania ustaw opóźnienie pola od jednej do 50 milisekund, aby zbierać obrazy z częstotliwością 20 herców. Wybierz opcję Zapisz w buforze tymczasowym. W przypadku ratiometrycznego obrazowania wapniowego na karcie Sekwencja kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie i śledzić robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość komórek i synaps będących przedmiotem zainteresowania w środku pola widzenia.W momencie rozpoczęcia nagrywania fluorescencji, wyzwalacze są wysyłane do oczekującej kamery jasnego pola i kontrolera sceny, które rozpoczynają zbieranie zsynchronizowanych obrazów i pozycji sceny. Kliknij przycisk Statystyki w oknie Histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli dla każdego kanału. Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalny pojedynczy piksel kwiatowości mCherry na końcu presynaptycznym większy lub równy 8 000 zliczeń w kanale czerwonym, co daje około 12-bitowy zakres dynamiki nad tłem.Sygnały reporterowe wapnia na końcu presynaptycznym podczas spoczynku lub niskiego poziomu wapnia powinny wynosić około 2 500 zliczeń w zielonym kanale. Rejestruj zachowanie, aż do osiągnięcia jednego stanu aktywnego składania jaj. Następnie zapisz 10-minutowy podzbiór zawierający 6 000 klatek przed i 6 001 klatek po pierwszym wydarzeniu składania jaj.Należy zadbać o to, aby zachować ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaka i punktów czasowych pozycji stopnia X-Y, w przeciwnym razie precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona. W przypadku segmentacji obrazu zaimportuj sekwencje obrazów do odpowiedniego oprogramowania do kwantyzacji ratiometrycznej i kliknij prawym przyciskiem myszy szereg czasowy na karcie sekwencji, aby ustawić szereg czasowy na 20 klatek na sekundę i 1,25 mikrometra na piksel. W menu Narzędzia wybierz opcję Proporcje, a następnie wybierz mCherry dla kanału A i GCaMP5 dla kanału B i kliknij przycisk Oblicz, aby odjąć tło od każdej sekwencji obrazów.Wybierz opcję Zastosuj tęczową tabelę przeglądową do kanału proporcji i użyj kanału mCherry, aby wygenerować kanał współczynnika z modulacją intensywności, aby odwzorować kolor proporcji na jasność kanału mCherry. Kliknij opcję Proporcja, aby wygenerować dwa kanały. Aby utworzyć w protokole znajdowania obiektów, przeciągnij narzędzie Znajdź obiekty za pomocą intensywności na karcie pomiarów do panelu protokołu i kliknij koło zębate, aby ustawić okno wartości intensywności mCherry i znaleźć obiekty.Wybierz wartości intensywności większe lub równe dwóm odchyleniom standardowym powyżej tła, zwracając uwagę na wykrycie ciała komórki i końca presynaptycznego. Dodaj wszelkie dodatkowe filtry kierujące na kanał mCherry tylko wtedy, gdy jest to konieczne, aby wykluczyć niepożądane obiekty, takie jak: kwitnienie głowy, ogona lub jelit. Następnie otwórz menu Measurements (Pomiary) i wybierz opcję Make Measurement Item (Wykonaj element pomiaru) i wybierz wszystkie punkty czasowe, aby wykonać protokół analizy kwantyzacji obrazu.Jednoczesna akwizycja sygnałów kwiatowych GCaMP5 i mCherry służy do generowania kanału proporcji piksel po pikselu, który kompensuje zmiany w ruchu i ostrości zwierząt. Dla każdego zwierzęcia zmiany w presynaptycznym wewnątrzkomórkowym wapniu HSN mogą być skorelowane z zachowaniami widocznymi w obrazowaniu w jasnym polu, w tym uwalnianiem jaj i zmianami w lokomocji. Rzeczywiście, można zaobserwować znaczne różnice w prędkości robaków przed, w trakcie i po stanie aktywnym składania jaj.Zbliżenie na jedno zdarzenie składania jaj ujawnia solidną zmianę w kwiatostanie GCaMP5 przed złożeniem jaj. Podczas gdy kwiatostan mCherry pozostaje stosunkowo niezmieniony. Ponadto zmierzone zmiany w stosunku GCaMP5:mCherry wyraźnie wskazują na stan przejściowy wapnia HSN na około 4 sekundy przed uwolnieniem jaj.Postępuje skurcz mięśni sromu widoczny jako wyraźne spowolnienie lokomocji robaków, które kończy się uwolnieniem jaja. Co więcej, obrazowanie i śledzenie robaków, jak właśnie pokazano, pozwala na wizualizację przestrzennej organizacji zachowania składania jaj od żerowania, przejściowych zmian wapnia HSM i aktywności HSN, która przechodzi w strzelanie impulsowe przed lokomocją, do miejsca składania jaj. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w godzinę lub dwie, jeśli jest wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby skupić się na interesujących komórkach i ich zakończeniach presynaptycznych podczas etapów obrazowania. Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne metody, takie jak aktywacja optogenetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak HSN reaguje na stymulację presynaptyczną. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania funkcji obwodu składania jaj u C. elegans.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ratiometryczne obrazowanie wapnia HSN u aktywnych Caenorhabditis elegans.

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Zgłoszono tutaj system do obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami. System ten pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy przemieszczeniu w skali nano oraz na ilościowe określenie prądów wapniowych podczas reakcji C. elegans na wibracje.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Poznaj ratiometryczne obrazowanie wapnia neuronów HSN w zachowaniu Caenorhabditis elegans. Ta metoda pozwala rejestrować aktywność wewnątrzkomórkową z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, jednocześnie śledząc zachowanie i lokomocję robaków.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów