Name: Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza modulujących terapię wirusem onkolitycznym. Ta technika umożliwia kompleksowe i bezstronne odkrywanie celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Ontario Institute for Cancer Research, Canada Foundation for Innovation, Ottawa Regional Cancer Foundation oraz Terry Fox Research Institute. K.J.A. był wspierany przez Vanier Canada Graduate Scholarship, Canadian Institute for Health Research-Master's Award oraz Ontario Graduate Scholarship.

<ol><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li>
<li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+genomic+screening%3A+elucidating+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li>
<li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li>
<li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li>
<li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li>
<li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li>
<li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+From+unbiased+genetic+screens+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li>
<li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li>
<li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li>
<li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431(2014).</li>
<li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li>
<li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine%2Farginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li>
<li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li>
<li>Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li>
<li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+arms%3A+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li>
<li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2017%3A+quality-controlled+protein-protein+association+networks%2C+made+broadly+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li>
<li>Luc, P. -V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINdb%3A+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li>
<li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+Score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+Score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
<li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li>
<li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis%3A+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li>
<li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li>
<li>Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li>
<li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li>
<li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li>
<li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li>
<li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li>
<li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania wysokoprzepustowych badań przesiewowych RNAi w celu identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym. Zostało to z powodzeniem przetestowane z onkolitycznym wirusem Maraba i onkolitycznym wirusem krowianki, ale, jak wspomniano, można je dostosować do stosowania z innymi wirusami onkolitycznym lub ogólnie innymi wirusami w celu identyfikacji genów gospodarza, które modulują replikację wirusa. Protokół badań przesiewow...

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNAi całego genomu okazały się nieocenionym narzędziem do ujawniania biologicznych spostrzeżeń w różnych dziedzinach badań, w tym w biologii wirusów. W ciągu ostatniej dekady wiele grup podjęło zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe RNAi oparte na komórkach w celu szczegółowej identyfikacji genów gospodarza, które modulują replikację wirusa (Sprawdzone w1,2,3,4,5,6,7). Co ciekawe, wiele z tych badań przesiewowych przeprowadzono na komórkach nowotworowych, a kilka z nich zawierało wirusy, które są obecnie kandydatami na wirusy onkolityczne, w tym wirus krowianki8,9,10, wirus Myxoma11, wirus opryszczki pospolitej12, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej13,14 i wirus Maraba15. Podczas gdy większość tych badań skupiała się na identyfikacji czynników gospodarza, które wpływają na jakiś aspekt replikacji wirusa, a nie na identyfikacji celów bioterapeutycznych dla wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym, cenne dane można było wydobyć z tych zestawów danych w tym zakresie. Oczywiste jest, że potężny potencjał identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, nie został w pełni wykorzystany.
Obecnie testowane jest mnóstwo platform wirusów onkolitycznych w badaniach przedklinicznych i klinicznych, w tym wirus opryszczki pospolitej, reowirus i wirus krowianki, które odniosły wyraźny sukces w późnych fazach badań klinicznych. W przypadku większości tych platform wysiłki zostały skierowane na zmianę genomów wirusa w celu ulepszenia terapii. Na przykład, aby zwiększyć swoistość nowotworu, określone geny wirusa zostały usunięte lub zmutowane, aby znacznie ograniczyć replikację wirusa w normalnych komórkach, ale nie w komórkach nowotworowych. W niektórych przypadkach dodano transgeny, takie jak GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów) w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej lub NIS (symporter jodku sodu), aby umożliwić obrazowanie in vivo i wychwyt radioaktywnego jodku w celach terapeutycznych. Jednak przeprowadzono bardzo niewiele prac skoncentrowanych na manipulowaniu genami gospodarza/guza i badaniu wpływu genów gospodarza/guza na replikację wirusa onkolitycznego. Wraz z pojawieniem się technologii wysokoprzepustowych badań przesiewowych, możliwe jest teraz sondowanie interakcji gospodarz-wirus w skali genomu i rozszyfrowywanie możliwości manipulowania genomem gospodarza w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznym (Recenzja w16,17,18).
Przedstawiliśmy pierwsze badanie, które demonstruje dowód słuszności koncepcji wykorzystania wysokoprzepustowych badań genetycznych do identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym. Aby odkryć geny gospodarza, które modulują onkolizę wirusa Maraba, onkolitycznego rabdowirusa będącego obecnie testowanym w badaniach fazy I i II, przeprowadziliśmy badania przesiewowe RNAi całego genomu na trzech różnych liniach komórek nowotworowych w dwóch egzemplarzach z biblioteką siRNA (krótkie interferujące RNA) ukierunkowaną na 18 120 genów15. Analiza szlaków trafień zidentyfikowanych na ekranach ujawniła wzbogacenie elementów szlaków odpowiedzi na stres ER (retikulum endoplazmatyczne). Wybraliśmy 10 trafień w ramach tych ścieżek do wtórnej walidacji przy użyciu siRNA z różnymi sekwencjami docelowymi niż te z pierwotnego ekranu. W ramach walidacji trzeciorzędowej przeprowadziliśmy eksperyment ratunkowy z IRE1α (enzymem alfa wymagającym inozytolu), aby potwierdzić, że trafienie było celne. Testy in vitro i in vivo z użyciem małocząsteczkowego inhibitora IRE1α wykazały radykalnie zwiększoną skuteczność onkolityczną.
Workenhe et al.12 przeprowadził również badanie przesiewowe RNAi całego genomu, korzystając z puli lentiwirusowej biblioteki shRNA (short hairpin) skierowanej do 16 056 genów, aby zidentyfikować czynniki gospodarza ograniczające onkolizę komórek raka piersi z mutacją ludzkiego wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) KM100. W pierwotnym badaniu przesiewowym zidentyfikowali 343 geny, których eliminacja prowadzi do zwiększonej cytotoksyczności komórek zakażonych KM100 w porównaniu z pozorowanymi komórkami; Wybrano 24 z tych genów do wtórnej walidacji. Spośród 24 genów, 8 genów zostało potwierdzonych w wtórnym badaniu przesiewowym, a jednym z nich był SRSF2 (czynnik splicingu bogaty w serynę/argininę 2), który został następnie potwierdzony za pomocą genetycznego eksperymentu ratunkowego podczas walidacji trzeciorzędowej. Grupa zidentyfikowała chemioterapeutyk inhibitora topoizomerazy DNA, który zmniejszył fosforylację SRSF2 i wykazał, że skojarzone leczenie HSV-1 KM100 z tym inhibitorem prowadzi do wydłużenia przeżycia myszy z guzem TUBO.
W wyżej wymienionych badaniach zastosowano podobny przebieg pracy. Każdy z nich rozpoczynał się od podstawowego badania przesiewowego RNAi obejmującego cały genom, po którym następowało wtórne badanie przesiewowe na wybranej liczbie trafień zidentyfikowanych w pierwotnym badaniu przesiewowym. Następnie przeprowadzono trzeciorzędowe badania walidacyjne, które obejmowały potwierdzenie, że trafienie było celowe, poprzez przeprowadzenie genetycznych eksperymentów ratunkowych in vitro, z ostateczną walidacją przeprowadzoną poprzez manipulowanie docelowym produktem genowym in vivo. W tym artykule najpierw przedstawiamy ogólny protokół opracowywania i walidacji wysokoprzepustowego testu przesiewowego siRNA, który obejmuje określenie optymalnych warunków transfekcji, ilości wirusa i czasu trwania infekcji. Oferujemy również szczegółowy protokół przeprowadzania pierwszorzędowego i wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA, a także ogólny opis metody przeprowadzania walidacji wtórnego badania przesiewowego i walidacji trzeciorzędowej.

<table><tbody><tr><td>Biblioteka Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384-dołkowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Kontrola negatywna siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Nieukierunkowana pula siRNA #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/WYSOKI poziom glukozy</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór HEPES (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 100X roztwór</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modyfikowany</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofektamina.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa rezazuryny</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37% wagowo)</td><td>Butelki Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>500 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430282</tr><tr><td>Samoprzylepna folia uszczelniająca do mikropłytek</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Zrywalna folia termozgrzewalna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Kaseta dozownika</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Katalog Numer</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (dozownik płynów)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT czytnik płytek</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Instrument do obrazowania i analizy</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Analiza i automatyzacja pików ramienia robotycznego</td><td>(dawniej Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny inkubator Cytomat serii 24C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Zautomatyzowana stacja robocza</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Karuzela</td> płytowa <td>Analiza i automatyzacja pików (dawniej Peak Robotics)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>zgrzewarki do płyt Alps 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe rnai całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Technologia wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi (interferencji RNA) w całym genomie jest szeroko stosowana do wykrywania czynników gospodarza, które wpływają na replikację wirusa. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie tej technologii do odkrywania celów gospodarza, które specyficznie modulują replikację wirusa Maraba, onkolitycznego rabdowirusa i wirusa krowianki, w celu wzmocnienia terapii. Chociaż protokół został przetestowany pod kątem stosowania z onkolitycznym wirusem Maraba i onkolitycznym wirusem krowianki, podejście to ma zastosowanie do innych wirusów onkolitycznych i może być również wykorzystane do identyfikacji celów gospodarza, które modulują replikację wirusa w komórkach ssaków w ogóle. Protokół ten opisuje opracowanie i walidację testu do wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w komórkach ssaków, kluczowe zagadnienia i etapy przygotowawcze ważne dla przeprowadzenia pierwotnego wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi oraz przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania pierwotnego wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi; Ponadto szeroko przedstawiono w nim metody przeprowadzania wtórnych i trzeciorzędnych badań walidacyjnych. Zaletą wysokoprzepustowych badań przesiewowych RNAi jest to, że pozwalają skatalogować, w obszerny i bezstronny sposób, czynniki gospodarza, które modulują dowolny aspekt replikacji wirusa, dla którego można opracować test in vitro, taki jak zakaźność, wielkość serii i cytotoksyczność. Ma ona moc odkrywania celów bioterapeutycznych, których nie można było przewidzieć w oparciu o obecną wiedzę.

Przegląd schematu postępowania w celu zidentyfikowania celów gospodarza w celu usprawnienia terapii wirusami onkolitycznymi przedstawiono na Rysunku 1.
Jak zilustrowano na Ryc. 1, krytycznym pierwszym krokiem w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego przesiewu RNAi jest opracowanie testu. Ryc. 2A przedstawia przykładowy układ płytki dla testu o...

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Ogólnym celem tego protokołu jest identyfikacja celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii wirusami onkolitycznymi, takie jak to, jakie specyficzne czynniki gospodarza i szlaki komórkowe modulują replikację wirusa onkolitycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala zidentyfikować cele gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym w sposób kompleksowy i bezstronny.Protokół ten może być również wykorzystany do identyfikacji czynników gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa. Po opracowaniu wysokoprzepustowego testu przesiewowego zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyjąć partię płytek do mikromiareczkowania z zamrażarki i pozostawić je do rozmrożenia przez 20 do 30 minut. W międzyczasie napełnij dwie butelki 70% etanolem, a następnie napełnij dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml PBS i jedną wodą destylowaną.Zanurz rurkę dozownika płynu w butelce z 70% etanolem, a następnie umieść kawałek taśmy maskującej wokół rurki, aby zaznaczyć punkt, poniżej którego rurkę można uznać za sterylną. Użyj

genome-wide-rnai-screening-to-identify-host-factors-that-modulate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.

Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).

Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Poznaj metodę przesiewowego badania RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza modulujących terapię wirusem onkolitycznym. Ta technika umożliwia kompleksowe i bezstronne odkrywanie celów terapeutycznych.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Przeglądaj więcej filmów