Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Ogólnym celem tego protokołu jest identyfikacja celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii wirusami onkolitycznymi, takie jak to, jakie specyficzne czynniki gospodarza i szlaki komórkowe modulują replikację wirusa onkolitycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala zidentyfikować cele gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym w sposób kompleksowy i bezstronny.

Protokół ten może być również wykorzystany do identyfikacji czynników gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa. Po opracowaniu wysokoprzepustowego testu przesiewowego zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyjąć partię płytek do mikromiareczkowania z zamrażarki i pozostawić je do rozmrożenia przez 20 do 30 minut. W międzyczasie napełnij dwie butelki 70% etanolem, a następnie napełnij dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml PBS i jedną wodą destylowaną.

Zanurz rurkę dozownika płynu w butelce z 70% etanolem, a następnie umieść kawałek taśmy maskującej wokół rurki, aby zaznaczyć punkt, poniżej którego rurkę można uznać za sterylną. Użyj około 25 ml 70% etanolu do zalania rurki. Wlej dodatkowy etanol do butelki, aby zastąpić utraconą objętość, a następnie pozostaw rurkę w etanolu na co najmniej pięć minut.

Po przygotowaniu kaptura do hodowli komórkowych odwirować szczelnie zamknięte płytki i natężić 1026 razy G w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie usuń uszczelki z płyt. Następnie odpipetować wymaganą ilość odczynnika do transfekcji do stożkowych probówek zawierających wstępnie podgrzany rozcieńczalnik odczynnika do transfekcji.

Rozpocznij trypsynizację komórek, odsysając pożywkę z każdej płytki. Użyj dziewięciu ml PBS do przepłukania komórek, a następnie odpipetuj trzy ml trypsyny na płytkę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut.

Następnie użyj 22 ml pożywki, aby ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 10 razy. Połączyć zawiesinę komórkową z każdej płytki do hodowli tkankowej do sterylnej butelki i wymieszać zawiesinę komórkową, odwracając butelkę. Następnie pipetować jeden ml zawiesiny komórek do dwóch oddzielnych probówek do mikrofuge.

Wyjmij próbkę z każdej probówki do mikrofuge i policz komórki. Następnie obliczyć objętość zawiesiny komórek wymaganą dla wymaganej gęstości i przygotować wystarczającą ilość rozcieńczonej zawiesiny komórek, aby dozować ją na jedną partię płytek. Podczas przygotowywania komórek opróżnij rurkę dozownika płynu z etanolu.

Użyj około 25 ml PBS do zalania rurki, a następnie opróżnij rurkę. Upewnij się, że część rurki, która zostanie zanurzona w odczynniku do transfekcji, a później w zawiesinie komórek, jest utrzymywana w sterylności. Oddziel płytki, które można bezpiecznie wykonać za pomocą jednej stożkowej probówki z roztworem odczynnika do transfekcji.

Odpipetować roztwory odczynników do transfekcji w górę i w dół 10 razy. Następnie użyj roztworu do zalania rurki przed dozowaniem 5 mikrolitrów na studzienkę. Odwirować płytki w temperaturze 1026 razy G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez czas określony dla używanego odczynnika do transfekcji. Podczas inkubacji opróżnij rurkę z roztworem odczynnika do transfekcji i umieść ją w pełnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS. Następnie użyj około 25 ml PBS do przepłukania rurki, zalewając, a następnie opróżniając ją.

Wymieszaj butelkę zawierającą zawiesinę komórek, a następnie umieść rurkę w zawiesinie i zalej rurkę na tyle, aby zobaczyć, że każda końcówka dozuje się prawidłowo. Dozować 30 mikrolitrów zawiesiny komórek na dołek na wszystkie płytki. Opróżnij zawiesinę komórkową z rurki, a następnie przepłucz rurkę około 25 ml PBS, a następnie około 50 ml wody destylowanej.

Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 45 do 60 minut od momentu wysiewu komórek. Następnie inkubuj płytki w niezakłóconym inkubatorze, aby uzyskać pożądaną długość wyciszania genów. Aby zaoszczędzić czas, dzień przed zakażeniem komórek, należy odpipetować do sterylnych butelek dokładną ilość pożywki potrzebną do zakażenia każdej partii płytek, w tym pożywki dla niezakażonych studzienek.

Podgrzej podłoże w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie napełnij dwie butelki 70% etanolem, dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml PBS i jedną wodą destylowaną. Wysterylizuj rurkę 70% etanolem, jak pokazano wcześniej. Podczas gdy rurka znajduje się w etanolu, najpierw należy wprowadzić wirusa do środka wirowego, a następnie pipetować dokładną ilość wirusa wymaganą do umieszczenia w butelce z podłożem infekcyjnym.

Następnie przepłucz rurkę, używając 25 ml PBS do jej zalania, a następnie opróżnij. Po wyjęciu płytek z inkubatora należy umieścić je w kapturze do hodowli tkankowych. Użyj pożywki do zalania rurki, a następnie wlej 40 mikrolitrów pożywki do niezainfekowanych studzienek kontrolnych.

Opróżnij rurkę z pożywki i użyj 25 ml PBS do jej wypłukania. Po wymieszaniu wirusa umieścić rurkę w butelce zawierającej wirusa, rozprowadzić 40 mikrolitrów wirusa na płytkach. Odwirować płytki w temperaturze 400 razy G w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Inkubuj płytki przez wcześniej określony czas. Dzień przed utrwalaniem należy przygotować butelkę z roztworem utrwalającym i stojącym zawierającym cztery procent formaldehydu i PBS dla każdej partii płytek, ale pominąć barwienie Hoechsta. Roztwór należy przechowywać w łatwopalnej szafce z dala od światła.

Następnego dnia użyj 70% etanolu i PBS do przepłukania rurki, jak pokazano wcześniej. Dozować 30 mikrolitrów roztworu na wszystkie płytki, a następnie umieścić płytki w inkubatorze na 30 minut. Po inkubacji nałożyć uszczelki na płytki i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Przeprowadź obrazowanie i analizę zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazano tutaj 786 komórek O wybarwionych Hoechst 33342 po 72-godzinnej inkubacji z samym rozcieńczalnikiem odczynnika do transfekcji. Odczynnik do transfekcji i rozcieńczalnik, nieukierunkowany siRNA oraz z siRNA ukierunkowany na PLK1.

Wykres przeżycia pokazany tutaj wskazuje, że przeżyło 22% komórek transfekowanych siRNA PLK1, a 94% komórek transfekowanych siRNA nieukierunkowanym. Ten wykres przedstawia wyniki przebiegu w czasie życia 786 komórek O zakażonych onkolitycznym wirusem krowianki wykazującym ekspresję wzmocnionego GFP w różnych MOI. Reprezentatywne obrazy komórek zainfekowanych przy MOI 0,05 w czasie rzeczywistym są pokazane tutaj.

Okres inkubacji wynoszący 21 godzin pozwoliłby na wykrycie wzrostów i spadków rozprzestrzeniania się, ponieważ punkt czasowy mieści się w zakresie liniowym. Po przeprowadzeniu badań przesiewowych RNAi w całym genomie w trzech liniach komórek nowotworowych, metodą MAD zidentyfikowano 1008 trafień wspólnych dla co najmniej dwóch z trzech linii komórek rakowych. Wybrano 10 trafień w ramach szlaków UPR i ERAD do wtórnej walidacji za pomocą siRNA z różnymi sekwencjami docelowymi.

Podczas dozowania odczynników bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednią partię płytek, wybrać odpowiednią objętość do dozowania oraz aby rurka została wypełniona odpowiednim odczynnikiem i była zawsze całkowicie zanurzona w odczynniku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNAi w celu zidentyfikowania celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, lub w celu zidentyfikowania czynników gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.