Name: Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Ta metoda umożliwia bezpieczną i efektywną edycję genów in vivo i in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Wydziałowi Neurobiologii, Duke University School of Medicine oraz Dziekanatowi ds. Nauk Podstawowych, Duke University. Dziękujemy również członkom Duke Viral Vector Core za komentarze do manuskryptu. Plasmid pLenti CRISPRv2 został podarowany przez Feng Zhang (Broad Institute). System pakowania LV, w tym plazmidy psPAX2, VSV-G, pMD2.G i pRSV-Rev, był miłym prezentem od Didiera Trono (EPFL, Szwajcaria). Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione przez University Of South Carolina School Of Medicine, grant RDF18080-E202 (B.K).

<ol><li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas%2C+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference%3A+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li>
<li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR%2FCas+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li>
<li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146(2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987(2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+CRISPR%2FCas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968(2017).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li>
<li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).</li>
<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27(2006).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
<li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+of+live%2C+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li>
<li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals%3A+functional+roles+of+NF-kappaB%2FNF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+%28SIN%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li>
<li>Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017).</li>
<li>CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
</ol>

Patent USC-499-P (1175) został złożony przez Uniwersytet Południowej Karoliny w związku z pracą opisaną w tym rękopisie.

IDLV zaczęły pojawiać się jako narzędzie z wyboru do edycji genów in vivo, zwłaszcza w kontekście chorób genetycznych, głównie ze względu na niskie ryzyko mutagenezy związane z tymi wektorami w porównaniu z integrującymi platformami dostarczania22,28. W obecnym manuskrypcie staraliśmy się szczegółowo opisać protokół związany z produkcją ulepszonego systemu IDLV-CRISPR/Cas9 typu "wszystko w jednym", który został niedawno opracowany w naszym laboratorium<s...

Precyzyjna edycja genów stanowi fundament głównych postępów biomedycznych obejmujących opracowywanie nowych strategii walki z chorobami genetycznymi. Na czele technologii edycji genów znajduje się metoda oparta na wykorzystaniu systemu clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9, który został początkowo zidentyfikowany jako element odporności bakteryjnej przeciwko inwazji wirusowego materiału genetycznego (omówiono w referencjach1,2). Główną zaletą systemu CRISPR/Cas9 w porównaniu z innymi narzędziami do edycji genów, takimi jak nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) (omówiono w referencji3), jest względna prostota projektowania plazmidów i konstrukcji komponentów CRISPR — cecha ta przyczyniła się do rozprzestrzenienia edycji genów z kilku wyspecjalizowanych laboratoriów do znacznie szerszej społeczności badawczej. Dodatkowo prostota programowania CRISPR/Cas9 oraz zdolność do multipleksowego rozpoznawania celów dodatkowo zwiększyły popularność tej technologii jako efektywnej kosztowo i łatwej w użyciu. Wśród różnych metod dostarczania takich komponentów do edycji genów do komórek, wektory wirusowe pozostają zdecydowanie najpopularniejszym i najskuteczniejszym systemem.
Wektory lentiwirusowe (LV) stały się preferowanym nośnikiem do dostarczania komponentów systemu CRISPR/Cas9 in vivo w różnorodnych zastosowaniach4,5,6,7. Kilka kluczowych cech sprawia, że LV są popularnym wyborem w tym procesie, w tym ich zdolność do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się, niska immunogenność oraz minimalna toksyczność komórkowa (przegląd w referencji8). W rezultacie terapia genowa z wykorzystaniem LV była stosowana w leczeniu chorób zakaźnych, takich jak HIV-1, HBV i HSV-1, a także w korekcji defektów leżących u podstaw dziedzicznych chorób ludzkich, takich jak mukowiscydoza i neowaskularna zwyrodzenie plamki4,5,7,9,10,11. Ponadto wektory LV zostały skutecznie zmodyfikowane w celu przeprowadzania multipleksowej edycji genów w różnych locus genomowych przy użyciu pojedynczego systemu wektorowego12.
Jednakże immanentna właściwość LV polegająca na integracji z genomem gospodarza może mieć charakter mutagenny i często ogranicza ich użyteczność jako nośników transgenów, zwłaszcza w zastosowaniach klinicznych. Co więcej, ponieważ stabilnie zintegrowane LV wykazują trwałą, wysoką ekspresję transgenów, system ten nie nadaje się do dostarczania komponentów edycji genów, takich jak CRISPR/Cas9; nadekspresja Cas9-guide RNA (gRNA) oraz podobnych białek, takich jak ZFNs, wiąże się z podwyższonym poziomem efektów off-target, obejmujących niepożądane mutacje13,14,15,16,17 i może potencjalnie zwiększać cytotoksyczność18. Dlatego też, aby osiągnąć precyzyjną edycję genów przy minimalnych efektach off-target, niezbędne jest zaprojektowanie systemów umożliwiających przejściową ekspresję komponentów edycji genów.
W ostatnich latach opracowano wiele platform dostarczania w celu przejściowej ekspresji CRISPR/Cas9 w komórkach16,19,20,21 (przegląd w referencji22). Obejmują one metody opierające się na bezpośrednim wprowadzaniu oczyszczonego białka Cas9 wraz z odpowiednimi przewodnimi RNA do komórek, co okazało się bardziej skuteczne w ukierunkowanej edycji genów w porównaniu z transfekcją za pomocą plazmidów16. Badania wykazały, że kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) składające się z cząsteczek gRNA/Cas9 są szybko degradowane po przeprowadzeniu cięcia DNA w miejscach docelowych, co sugeruje, że krótkotrwała ekspresja tych komponentów jest wystarczająca do uzyskania skutecznej edycji genów16. Można przypuszczać, że nieintegrujące platformy wektorów wirusowych, takie jak wektory wirusów adeno-zależnych (AAV), mogą stanowić realną alternatywę dla dostarczania mechanizmów edycji genów do komórek. Niestety, kapsydy AAV posiadają znacznie niższą zdolność pakowania niż LV (&lt;5kb), co poważnie ogranicza możliwość zapakowania wieloskładnikowego zestawu CRISPR w ramach pojedynczego wektora (przegląd w referencji8). Warto zauważyć, że dodanie związków hamujących deacetylazy histonowe (np. maślan sodu23) lub blokujących cykl komórkowy (np. kofeinę24) może zwiększać miana lentiwirusów. Pomimo postępów, systemy ekspresji przejściowej opracowane do tej pory wciąż borykają się z kilkoma wadami, takimi jak niższa wydajność produkcji, co prowadzi do zredukowanych mian wirusów, oraz niska wydajność transdukcji wirusów generowanych za pomocą takich podejść25.
Lentiwirusowe wektory pozbawione integrazą (IDLVs) stanowią istotny postęp w opracowywaniu nośników dostarczania genów, ponieważ łączą zdolność pakowania charakterystyczną dla LV z dodatkową zaletą utrzymywania episomalnego w komórkach, podobnie jak w przypadku AAV. Cechy te pozwalają IDLVs w dużej mierze uniknąć głównych problemów związanych z wektorami integrującymi, takich jak ciągła nadekspresja potencjalnie genotoksycznych elementów oraz mutagenność indukowana przez integrację. Wcześniej wykazano, że IDLVs mogą być skutecznie modyfikowane w celu zwiększenia ekspresji genów episomalnych26,27. W odniesieniu do dostarczania CRISPR/Cas9 za pomocą IDLV, niskie miana produkcji oraz niższa ekspresja genomów przenoszonych episomalnie w porównaniu z systemami lentiwirusowymi posiadającymi integrazę ograniczają ich użyteczność jako bona fide narzędzi do dostarczania transgenicznych konstruktów do edycji genomu. Niedawno wykazaliśmy, że zarówno ekspresja transgenu, jak i miana wirusowe związane z produkcją IDLV są znacząco zwiększone dzięki włączeniu miejsc wiązania dla czynnika transkrypcyjnego Sp1 w obrębie wirusowej kasety ekspresyjnej28. Zmodyfikowane IDLVs skutecznie wspierały edycję genów za pośrednictwem CRISPR zarówno in vitro (w komórkach HEK-293T), jak i in vivo (w postmitotycznych neuronach mózgowych), wywołując przy tym minimalną liczbę mutacji poza docelowych w porównaniu z odpowiadającymi im systemami opartymi na ICLV28. Podsumowując, opracowaliśmy nowy, kompaktowy, zintegrowany zestaw narzędzi CRISPR przenoszony na platformie IDLV i opisaliśmy różnorodne zalety stosowania takiego nośnika w celu usprawnienia edycji genów.
W niniejszym dokumencie opisano protokół produkcji systemu IDLV-CRISPR/Cas9, obejmujący poszczególne etapy składania, oczyszczania, zagęszczania i miareczkowania IDLV, a także strategie walidacji skuteczności edycji genów za pomocą tych wektorów. Protokół ten można łatwo skalować w zależności od potrzeb badaczy i został on opracowany tak, aby skutecznie generować wektory LV o mianach w zakresie 1 x 1010 jednostek transdukcyjnych (TU)/mL. Wektory wytworzone zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane do wydajnego zakażania kilku różnych typów komórek, w tym trudnych do transdukcji embrionalnych komórek macierzystych, komórek krwiotwórczych (limfocytów T i makrofagów) oraz neuronów hodowlanych i wstrzykiwanych in vivo. Ponadto protokół ten jest równie odpowiedni do produkcji wektorów lentiwirusowych kompetentnych integrazowo w podobnych ilościach.
<img alt="Edycja genów; domeny wiążące cynk, katalityczne i wiążące DNA; elektroforeza w żelu, schemat plazmidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pakowanie IDLV. (a) Schemat białka integrazą typu dzikiego (b) Modyfikowany plazmid został wyprowadzony z psPAX2 (szczegóły patrz w sekcji Metody, konstrukcja plazmidu). Reprezentatywny obraz żelu agarozy klonów przesiewanych pod kątem zmutowanych klonów integrazą. Próbki DNA przygotowane za pomocą standardowego mini-zestawu do izolacji plazmidowego DNA analizowano poprzez trawienie EcoRV i SphI. Prawidłowo trawiony klon (numer 5, przerywana czerwona ramka) został następnie zweryfikowany za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania (Sanger) pod kątem substytucji D64E w INT. Kaseta pakująca pozbawiona integrazą została nazwana pBK43. (c) Schemat protokołu przejściowej transfekcji zastosowanego do generowania wektorów IDLV-CRISPR/Cas9, przedstawiający komórki 293T transfekowane kasetami VSV-G, pakującą oraz kasetą transgenu (plazmid all-in-one Sp1-CRISPR/Cas9). Cząstki wirusowe wypączkowujące z błony komórkowej zawierają pełnowymiarowe RNA wektora (wyrażane z kasety transgenu). Zastosowano drugą generację systemu pakowania IDLV, która obejmuje białka regulacyjne Tat i Rev. Ekspresja Rev jest dodatkowo uzupełniana z oddzielnej kasety (plazmid RSV-REV). Skróty: LTR – długa powtórka końcowa, VSV-G – białko G wirusa zapalenia jam ustnych pęcherzykowego, pCMV – promotor cytomegalowirusa; promotor wirusa białaczkowego ptaków (RSV); RRE – element odpowiedzi Rev (Rev Response Element). Inne elementy regulacyjne w kasecie ekspresyjnej obejmują miejsca wiązania Sp1, element odpowiedzi Rev (RRE), posttranskrypcyjny element regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE), promotor czynnika elongacyjnego 1α (EFS-NC), element pakowania wektora ψ (psi), ludzki promotor Cytomegalowirusa (hCMV) oraz ludzki promotor U6. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Allegra 25R</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>xMark Microplate Czytnik płytek absorbancyjnych</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu; m jednostka filtrująca, 500 ml</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe dolne probówki ultrawirówkowe</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe adaptery rur</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti wirnik wahliwo-kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe o wysokim poziomie wiązania</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Naczynia do hodowli komórkowych z TC z siatką 20 mm</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; Jednostka filtrująca M, 1L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do hodowli tkankowych, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do hodowli tkankowych, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do hodowli tkankowych, 25 ml</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr z szkiełkami nakrywkowymi</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK 293T)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Komórki</td> <td>293FTThermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, podłoże o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon kosmicznego surowicy cielęcej</td><td></td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwas endogenny (NEAA)</td><td>Hyklon</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>BES (Kwas N, N-bis (2-hydroksyetylo)-2-amino-etanosulfonowy)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>p24 odczynniki ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty-p24</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Standardy HIV-1</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało królika anty-p24</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>Kozia peroksydaza przeciw królikowi chrzanowi IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>Stężenie robocze 1:1500</td></tr><tr><td>Normalna surowica mysie, sterylna, 500mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia, sterylna, 10mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Stężenie robocze 1:1000</td></tr><tr><td>Substrat peroksydazy TMB</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>Stężenie robocze 1:10 000</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem crispr/cas9 w dzielących się komórkach

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Wektory lentiwirusowe są idealnym wyborem do dostarczania komponentom edycji genów do komórek, ze względu na ich zdolność do stabilnej transdukcji szerokiego zakresu komórek i pośredniczenia w wysokim poziomie ekspresji genów. Jednak ich zdolność do integracji z genomem komórki gospodarza zwiększa ryzyko mutagenności insercyjnej, a tym samym budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa i ogranicza ich stosowanie w warunkach klinicznych. Co więcej, trwała ekspresja składników edycji genów dostarczanych przez te kompetentne do integracji wektory lentiwirusowe (ICLV) zwiększa prawdopodobieństwo rozwiązłego celowania w geny. Alternatywnie opracowano nową generację wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV), które rozwiązują wiele z tych problemów. W tym miejscu opisano protokół produkcji nowej i ulepszonej platformy IDLV do edycji genów za pośrednictwem CRISPR oraz wymieniono etapy związane z oczyszczaniem i koncentracją takich wektorów oraz wykazano ich skuteczność transdukcji i edycji genów przy użyciu komórek HEK-293T. Protokół ten jest łatwo skalowalny i może być używany do generowania IDLV o wysokim mianie, które są zdolne do transdukcji komórek in vitro i in vivo. Co więcej, protokół ten można łatwo dostosować do produkcji ICLV.

Walidacja wydajności nokautu wektorów IDLV-CRISPR/Cas9 
W celu walidacji wydajności średniowanego przez CRISPR/Cas9 nokautu genów wykorzystaliśmy komórki 293T wykazujące ekspresję GFP jako model. Komórki GFP+ wygenerowano poprzez transdukcję komórek HEK-293T wektorem pLenti-GFP (vBK201a) przy MOI wynoszącym 0,5 (Rysunek 3b, panel „no-virus”). Kaseta wektora all-in-one sgRNA-do-GFP/Cas9 została zapakowana do cząstek IDLV lub ICLV, a wydajno...

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie produkcji i potencjalnych zastosowań zoptymalizowanych, pozbawionych integraz wektorów lentiwirusowych, zdolnych do dostarczania transgenów CRISPR/Cas9 do komórek in vivo i in vitro w celu szybkiej i wydajnej edycji genów. System CRISPR/Cas stanowi wysoce wydajną platformę do edycji i manipulacji genami. Poniżej przedstawiono zarys protokołu produkcji wysokostężonych, zoptymalizowanych wektorów lentiwirusowych pozbawionych integraz, służących do wydajnego dostarczania narzędzi do edycji genów CRISPR/Cas.Technika ta okazała się bardzo wydajna w hodowlach komórkowych oraz w neuronach postmitotycznych. Wysiej komórki HEK-293T dzień przed transfekcją, tak aby następnego dnia stopień zrastania (confluency) osiągnął od 70 do 80%. Przed transfekcją odessij stare podłoże z płytek hodowlanych i dodaj świeżo przygotowane podłoże bez serum.Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml dodać wszystkie cztery plazmidy, aby przygotować mieszaninę plazmidów do transfekcji płytki o średnicy 15 cm. Następnie do mieszaniny plazmidów dodać 312,5 µL 1 M chlorku wapnia i uzupełnić objętość do 1,25 ml sterylną wodą dwukrotnie destylowaną. Stopniowo dodawać krople 2X roztworu buforowego BES podczas mieszania w wirówce typu vortex.Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdej z płytek 15-centymetrowych dodaj po kroplach 2,5 ml mieszaniny plazmidowej. Następnie delikatnie zakręć płytkami i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez dwie do trzech godzin.Po trzech godzinach do każdej płytki należy dodać 2,5 mililitra 10% serum i kontynuować inkubację przez noc. Za pomocą pipety 10-mililitrowej do hodowli tkankowej należy ostrożnie odessać supernatant z transfektowanych komórek wysianych na każdej płytce hodowlanej. Następnie cały supernatant należy zebrać do 50-mililitrowych probówek do wirowania.Umieść probówkę w wirówce stołowej i rozpocznij wirowanie. Następnie przefiltruj nadsącz przez jednostkę filtracyjną próżniową o rozmiarze porów 0,45 µm. Napełnij stożkowe probówki do ultrawirówki roztworami sacharozy o różnych stężeniach, aby utworzyć warstwy gradientu sacharozy.Ostrożnie dodaj supernatant zawierający wirusy do gradientu sacharozy. Aby przetworzyć całą objętość 100 ml supernatantu wirusowego, użyj sześciu probówek do ultrawirówek podczas każdego wirowania. Następnie zrównoważ probówki buforem 1X PBS i wiruj próbki przy 70 000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 °C.Do czystych probówek zebrać frakcje z 30% i 60% sacharozy, a następnie dodać zimny bufor 1X PBS, aby dostosować objętość do 100 mililitrów. Przeciągnąć próbki kilka razy pipetą w górę i w dół w celu wymieszania. Następnie, w celu przygotowania poduszki sacharozowej, dodać 20 do 25 mililitrów roztworu wirusowego na cztery mililitry 20% sacharozy w roztworze 1X PBS.Jeśli probówki są wypełnione w mniej niż 3/4 objętości, uzupełnić objętość sterylnym buforem 1X PBS i zrównoważyć próbki. Następnie wirować próbki przez dwie godziny w temperaturze 17 °C. Po zakończeniu odlać nadsącz i usunąć pozostałą ciecz, odwracając probówki na ręcznikach papierowych.Po odessaniu ostatnich pozostałych kropel, pellet zawierający wirusa jest ledwo widoczny jako półprzezroczysta plamka. Następnie resuspenduj pellet w 70 µL 1X PBS, dokładnie pipetując zawiesinę. Ponownie przenieś zawiesinę do innej probówki i dokładnie wymieszaj, aby całkowicie rozpuścić pellet.Następnie opłucz probówkę dodatkowymi 50 µL zimnego buforu 1X PBS i wymieszaj. Umieść próbki w mikrocentryfużce stołowej i wiruj przy 10 000 g przez 30 sekund. Po odwirowaniu przenieś 10 µL aliquoty supernatantu do każdej nowej probówki do mikrocentryfugi i przechowuj je w temperaturze -80 °C.Płytkę 96-dołkową o wysokim powinowactwie (high-binding) pokryć 100 µL przeciwciał monoklonalnych anty-p24 w rozcieńczeniu 1:1 500, zgodnie z instrukcją zestawu do analizy wychwytywania antygenu p24 HIV-1 z programu szczepionkowego NIH AIDS. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia trzykrotnie przemyć płytkę 200 µL 0,05% TWEEN-20 w zimnym PBS.Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu, zablokuj płytkę 200 µL 1% albuminy surowicy bydlęcej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj płytkę 200 µL 0,05% TWEEN-20 w zimnym PBS trzykrotnie. Po tym przygotuj skoncentrowane i nieskoncentrowane próbki wektora do stężenia końcowego 10%, rozcieńczając wektor wodą dwukrotnie destylowaną i Triton X-100.Następnie należy przygotować standardy HIV-1, stosując dwukrotne rozcieńczenia seryjne, zaczynając od stężenia 5 ng/mL. Po rozcieńczeniu skoncentrowanych i nieskoncentrowanych próbek wektora, nanieść je pipetą na płytkę w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia płytkę należy przemyć, a następnie dodać 100 µL poliklonalnego przeciwciała króliczego przeciwko p24 na każdą płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.Po sześciokrotnym przemyciu inkubuj płytkę z kozim przeciwciałem antykróliczym z peroksydazą chrzanową w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po wielokrotnym przemyciu inkubuj płytkę z podłożem peroksydazowym TMB w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj kwas solny w celu zatrzymania reakcji. Następnie zmierz absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika płytek mikrotytracyjnych.Wysiać komórki na płytkę sześcio-dołkową. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 90% konfluencji, przeprowadzić transdukcję za pomocą oczyszczonego wirusa przy określonej wielokrotności infekcji (MOI) w zakresie od 1 do 10.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Monitoruj płytki w regularnych odstępach czasu od jednego do siedmiu dni, aby zarejestrować różnice w sygnałach GFP. Poszukuj komórek GFP-dodatnich pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w zestaw filtrów GFP z długościami fali wzbudzenia i emisji wynoszącymi odpowiednio 470 i 525 nm.Aby odróżnić populację komórek GFP pozytywnych od negatywnych, należy użyć komórek nietransdukowanych. Reprezentatywny żel agarozowy przedstawiający pozytywny klon zmutowanej integrazą. Klon poddany podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRV i SPH1, zaznaczony czerwoną przerywaną ramką, reprezentuje klon zmutowanej integrazą.Klon poddano dalszemu sekwencjonowaniu w celu sprawdzenia mutacji kwasu asparaginowego w pozycji 64 na kwas glutaminowy. Przedstawiono reprezentacyjny wykres słupkowy dla testu ELISA p24, ukazujący miana wirusowe dla wektora lentiwirusowego CRISPR/Cas9 z deficytem integrazu SP1 (czarny słupek) oraz wektorów lentiwirusowych CRISPR/Cas9 zdolnych do integracji SP1 (biały słupek). Wykres słupkowy pokazuje miana wirusów z deficytem integrazu oraz zdolnych do integracji w zakresie 1 × 10. Słupki reprezentują liczbę kopii cząstek wirusowych na mililitr.Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne pokazujące średnią intensywność fluorescencji komórek GFP-dodatnich poddanych działaniu wirusów. Komórki zostały transdukowane komponentami wiralnymi CRISPR za pomocą wektorów lentiwirusowych zdolnych do integracji lub lentiwirusowego wektora CRISPR pozbawionego integrazą.Po transdukcji komponentów lentiwirusowych zdolnych do integracji lub z defektem integrazą zaobserwowano znaczny spadek sygnału GFP odpowiednio przy wielokrotności infekcji jeden i pięć w stosunku do nietransdukowanych komórek kontrolnych. Główna zaleta tej techniki wynika ze zdolności wektorów lentiwirusowych z defektem integrazą do przejściowego dostarczania narzędzi do edycji genomu, co znacząco zwiększa ich specyficzność i bezpieczeństwo. Jeśli protokoły zostaną przeprowadzone prawidłowo, ich wykonanie powinno zająć jeden tydzień.Podczas realizacji tego protokołu należy spodziewać się uzyskania wysokostężonych wektorów lentiwirusowych w zakresie od 10⁹ do 10¹⁰ kopii genomu wirusa na mL.

a-protocol-for-production-integrase-deficient-lentiviral-vectors-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Protokół produkcji wektorów lentywirusowych z brakującą integrazą do wyłączania genów za pomocą CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Ta metoda umożliwia bezpieczną i efektywną edycję genów in vivo i in vitro.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Przeglądaj więcej filmów