Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opisanie produkcji i potencjalnych zastosowań zoptymalizowanych, pozbawionych integraz wektorów lentiwirusowych, zdolnych do dostarczania transgenów CRISPR/Cas9 do komórek in vivo i in vitro w celu szybkiej i wydajnej edycji genów. System CRISPR/Cas stanowi wysoce wydajną platformę do edycji i manipulacji genami. Poniżej przedstawiono zarys protokołu produkcji wysokostężonych, zoptymalizowanych wektorów lentiwirusowych pozbawionych integraz, służących do wydajnego dostarczania narzędzi do edycji genów CRISPR/Cas.

Technika ta okazała się bardzo wydajna w hodowlach komórkowych oraz w neuronach postmitotycznych. Wysiej komórki HEK-293T dzień przed transfekcją, tak aby następnego dnia stopień zrastania (confluency) osiągnął od 70 do 80%. Przed transfekcją odessij stare podłoże z płytek hodowlanych i dodaj świeżo przygotowane podłoże bez serum.

Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml dodać wszystkie cztery plazmidy, aby przygotować mieszaninę plazmidów do transfekcji płytki o średnicy 15 cm. Następnie do mieszaniny plazmidów dodać 312,5 µL 1 M chlorku wapnia i uzupełnić objętość do 1,25 ml sterylną wodą dwukrotnie destylowaną. Stopniowo dodawać krople 2X roztworu buforowego BES podczas mieszania w wirówce typu vortex.

Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdej z płytek 15-centymetrowych dodaj po kroplach 2,5 ml mieszaniny plazmidowej. Następnie delikatnie zakręć płytkami i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez dwie do trzech godzin.

Po trzech godzinach do każdej płytki należy dodać 2,5 mililitra 10% serum i kontynuować inkubację przez noc. Za pomocą pipety 10-mililitrowej do hodowli tkankowej należy ostrożnie odessać supernatant z transfektowanych komórek wysianych na każdej płytce hodowlanej. Następnie cały supernatant należy zebrać do 50-mililitrowych probówek do wirowania.

Umieść probówkę w wirówce stołowej i rozpocznij wirowanie. Następnie przefiltruj nadsącz przez jednostkę filtracyjną próżniową o rozmiarze porów 0,45 µm. Napełnij stożkowe probówki do ultrawirówki roztworami sacharozy o różnych stężeniach, aby utworzyć warstwy gradientu sacharozy.

Ostrożnie dodaj supernatant zawierający wirusy do gradientu sacharozy. Aby przetworzyć całą objętość 100 ml supernatantu wirusowego, użyj sześciu probówek do ultrawirówek podczas każdego wirowania. Następnie zrównoważ probówki buforem 1X PBS i wiruj próbki przy 70 000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 °C.

Do czystych probówek zebrać frakcje z 30% i 60% sacharozy, a następnie dodać zimny bufor 1X PBS, aby dostosować objętość do 100 mililitrów. Przeciągnąć próbki kilka razy pipetą w górę i w dół w celu wymieszania. Następnie, w celu przygotowania poduszki sacharozowej, dodać 20 do 25 mililitrów roztworu wirusowego na cztery mililitry 20% sacharozy w roztworze 1X PBS.

Jeśli probówki są wypełnione w mniej niż 3/4 objętości, uzupełnić objętość sterylnym buforem 1X PBS i zrównoważyć próbki. Następnie wirować próbki przez dwie godziny w temperaturze 17 °C. Po zakończeniu odlać nadsącz i usunąć pozostałą ciecz, odwracając probówki na ręcznikach papierowych.

Po odessaniu ostatnich pozostałych kropel, pellet zawierający wirusa jest ledwo widoczny jako półprzezroczysta plamka. Następnie resuspenduj pellet w 70 µL 1X PBS, dokładnie pipetując zawiesinę. Ponownie przenieś zawiesinę do innej probówki i dokładnie wymieszaj, aby całkowicie rozpuścić pellet.

Następnie opłucz probówkę dodatkowymi 50 µL zimnego buforu 1X PBS i wymieszaj. Umieść próbki w mikrocentryfużce stołowej i wiruj przy 10 000 g przez 30 sekund. Po odwirowaniu przenieś 10 µL aliquoty supernatantu do każdej nowej probówki do mikrocentryfugi i przechowuj je w temperaturze -80 °C.

Płytkę 96-dołkową o wysokim powinowactwie (high-binding) pokryć 100 µL przeciwciał monoklonalnych anty-p24 w rozcieńczeniu 1:1 500, zgodnie z instrukcją zestawu do analizy wychwytywania antygenu p24 HIV-1 z programu szczepionkowego NIH AIDS. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia trzykrotnie przemyć płytkę 200 µL 0,05% TWEEN-20 w zimnym PBS.

Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu, zablokuj płytkę 200 µL 1% albuminy surowicy bydlęcej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj płytkę 200 µL 0,05% TWEEN-20 w zimnym PBS trzykrotnie. Po tym przygotuj skoncentrowane i nieskoncentrowane próbki wektora do stężenia końcowego 10%, rozcieńczając wektor wodą dwukrotnie destylowaną i Triton X-100.

Następnie należy przygotować standardy HIV-1, stosując dwukrotne rozcieńczenia seryjne, zaczynając od stężenia 5 ng/mL. Po rozcieńczeniu skoncentrowanych i nieskoncentrowanych próbek wektora, nanieść je pipetą na płytkę w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia płytkę należy przemyć, a następnie dodać 100 µL poliklonalnego przeciwciała króliczego przeciwko p24 na każdą płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.

Po sześciokrotnym przemyciu inkubuj płytkę z kozim przeciwciałem antykróliczym z peroksydazą chrzanową w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po wielokrotnym przemyciu inkubuj płytkę z podłożem peroksydazowym TMB w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj kwas solny w celu zatrzymania reakcji. Następnie zmierz absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika płytek mikrotytracyjnych.

Wysiać komórki na płytkę sześcio-dołkową. Następnego dnia, gdy komórki osiągną 90% konfluencji, przeprowadzić transdukcję za pomocą oczyszczonego wirusa przy określonej wielokrotności infekcji (MOI) w zakresie od 1 do 10.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Monitoruj płytki w regularnych odstępach czasu od jednego do siedmiu dni, aby zarejestrować różnice w sygnałach GFP. Poszukuj komórek GFP-dodatnich pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w zestaw filtrów GFP z długościami fali wzbudzenia i emisji wynoszącymi odpowiednio 470 i 525 nm.

Aby odróżnić populację komórek GFP pozytywnych od negatywnych, należy użyć komórek nietransdukowanych. Reprezentatywny żel agarozowy przedstawiający pozytywny klon zmutowanej integrazą. Klon poddany podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRV i SPH1, zaznaczony czerwoną przerywaną ramką, reprezentuje klon zmutowanej integrazą.

Klon poddano dalszemu sekwencjonowaniu w celu sprawdzenia mutacji kwasu asparaginowego w pozycji 64 na kwas glutaminowy. Przedstawiono reprezentacyjny wykres słupkowy dla testu ELISA p24, ukazujący miana wirusowe dla wektora lentiwirusowego CRISPR/Cas9 z deficytem integrazu SP1 (czarny słupek) oraz wektorów lentiwirusowych CRISPR/Cas9 zdolnych do integracji SP1 (biały słupek). Wykres słupkowy pokazuje miana wirusów z deficytem integrazu oraz zdolnych do integracji w zakresie 1 × 10. Słupki reprezentują liczbę kopii cząstek wirusowych na mililitr.

Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne pokazujące średnią intensywność fluorescencji komórek GFP-dodatnich poddanych działaniu wirusów. Komórki zostały transdukowane komponentami wiralnymi CRISPR za pomocą wektorów lentiwirusowych zdolnych do integracji lub lentiwirusowego wektora CRISPR pozbawionego integrazą.

Po transdukcji komponentów lentiwirusowych zdolnych do integracji lub z defektem integrazą zaobserwowano znaczny spadek sygnału GFP odpowiednio przy wielokrotności infekcji jeden i pięć w stosunku do nietransdukowanych komórek kontrolnych. Główna zaleta tej techniki wynika ze zdolności wektorów lentiwirusowych z defektem integrazą do przejściowego dostarczania narzędzi do edycji genomu, co znacząco zwiększa ich specyficzność i bezpieczeństwo. Jeśli protokoły zostaną przeprowadzone prawidłowo, ich wykonanie powinno zająć jeden tydzień.

Podczas realizacji tego protokołu należy spodziewać się uzyskania wysokostężonych wektorów lentiwirusowych w zakresie od 10⁹ do 10¹⁰ kopii genomu wirusa na mL.