Name: Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj testy agregacji komórek do oceny wiązania receptora Notch z trans-ligandami i hamowania przez cis-ligandy. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników genetycznych i farmakologicznych na sygnalizację Notch.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony NIH/NIGMS (R01GM084135 do HJN) oraz Mizutani Foundation for Glycoscience (grant #110071 dla HJN) i są wdzięczni Tomowi V. Lee za dyskusje i sugestie dotyczące testów, a także Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine i The Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) dla plazmidów i linii komórkowych.

1. Przygotowanie dwuniciowego RNA (dsRNA) do pozorowanego knockdownu
<ol>
	<li>Amplifikacja produktów metodą PCR
	<ol>
		<li>Użyj genomowego DNA typu dzikiego, żółtego, białego (y w) i pAc5.1-EGFP jako matrycy i następujących par starterów do amplifikacji fragmentów DNA stosowanych w syntezie dsRNA. Użyj następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 30 s), wyżarzanie (58 °C, 30 s) i rozciąganie (72 °C, 1 min). 
		Wzmocnione startery dsRNA białka zielonej fluorescencji (EGFP) (5'-3')- 
		Elementarz do przodu- GAAATTAATACGACTACTATAGGGGGGGGGGGAGCAAGGGCGAGGAG 
		Odwrócony starter- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams startery dsRNA (5'-3')- 
		Podkład do przodu- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 
		Odwrócony starter- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 
		UWAGA: EGFP dsRNA jest stosowany jako kontrola ujemna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żelowe oczyszczanie produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu produktu komercyjnego zdolnego do transkrypcji z promotora T7 zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Oczyść dsRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Oceń skuteczność pozorowanego knockdownu, wykonując następujące kroki (1.5.1-1.5.5).
	<ol>
		<li>Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Dodać 7,5 μg EGFP lub pozorowanego dsRNA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Zebrać komórkę kontrolną (poddaną działaniu EGFP dsRNA) i pozorować komórki S2 poddane działaniu dsRNA poprzez delikatne pipetowanie, a następnie granulowanie przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C i proces izolacji RNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru i przetworzyć 100 ng RNA do 1-etapowego qRT-PCR przy użyciu dostępnych w handlu odczynników qPCR i startera/sond oraz następującego profilu termicznego PCR: denaturacja (95 °C, 15 s) i wyżarzanie/wydłużanie (60 °C, 1 min). 
		UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat zestawów starter/sonda oraz instrumentu używanego do pozorowania i kontrolnych eksperymentów qRT-PCR w tych badaniach.</li>
		<li>Oblicz względne poziomy mRNA pozorów za pomocą metody 2-ΔΔCT 16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena wiązania między receptorem Notch a trans-ligandami 
<ol>
	<li>Przygotuj komórki odbierające sygnał (komórki S2 wyrażające receptor Notch).
	<ol>
		<li>Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki 5 x 105 S2 i stabilnych komórek S2-Notch w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna. 
		UWAGA: W przypadku komórek S2-Notch, które są dostępne w Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), dodaj 200 nM metotreksatu w pożywce. Aby przygotować roztwór podstawowy metotreksatu o stężeniu 0,5 mM, należy najpierw przygotować roztwór metotreksatu o stężeniu 20 mM w 250 μl 1 M NaOH. Następnie rozcieńczyć ten roztwór do 0,5 mM w 1 M roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym i przechowywać w temperaturze -20 °C. W komórkach S2-Notch ekspresja białka Notch jest pod kontrolą promotora metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.</li>
		<li>Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni. 
		UWAGA: CuSO4 służy do indukowania ekspresji białek kontrolowanych przez promotor metalotioneiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki wysyłające sygnały (komórka S2 eksprymująca ligandy Delta lub Serrate).
	<ol>
		<li>Policzyć komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i płytki ~ 5 x 106 stabilnych komórek S2-Delta lub S2-SerrateTom w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / dołek pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml Penicylina-Streptomycyna. 
		UWAGA: Dodaj 200 nM metotreksatu dla komórek S2-Delta i 100 μg/ml higromycyny dla komórek S2-ząbkowanych Tomów w pożywce. Wyrażenie Delta i SerrateTom - oznaczona pomidorem, funkcjonalna wersja Serrate12 - znajduje się pod promotorem metalotioneiny Drosophila w wektorze pMT.</li>
		<li>Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały.
	<ol>
		<li>Pobrać komórki S2 (kontrolne) i S2-Notch poddane działaniu dsRNA przez delikatne pipetowanie i płytkę 2,5 x 105 komórek/dołek na płytce 24-dołkowej po ręcznym zliczeniu za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Dodaj 5 x 105 stabilnych komórekToma S2-Delta lub S2-ząbkowanych w całkowitej objętości 200 μl pożywki Schneidera (uzupełnionej 10% FBS i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny). 
		UWAGA: Cała obsługa komórek S2 (w tym posiew, indukcja i obróbka dsRNA) odbywała się pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min (942.48 rad/min).</li>
		<li>Po 1 minucie wymieszać zawartość każdej studzienki i wyjąć 20 μl w celu policzenia liczby kruszyw.
		<ol>
			<li>Jednocześnie wykonaj reprezentatywny obraz pod odwróconym mikroskopem złożonym przy użyciu 10-krotnego powiększenia (obiektyw PLL 10/0,25).</li>
			<li>Ręcznie policz agregaty (>6 komórek) za pomocą hemocytometru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść talerz na shakerze.</li>
		<li>Powtórz akwizycję i zliczanie obrazu po 5 minutach i 15 minutach agregacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić kwantyfikację wiązania trans-bindingu.
	<ol>
		<li>Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-SerrateTom jako kontrolą tła.</li>
		<li>Obliczyć liczbę agregatów na ml między komórkami S2-Notch i S2-Delta lub S2-SerrateTom (wielkość wiązania trans).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena inhibicji wiązania między Notch i Trans-ligandami przez cis-ligandy 
<ol>
	<li>Przygotuj komórki odbierające sygnał.
	<ol>
		<li>Płytka: 5 x 105 komórek S2 w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 1 ml / studzience pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Dodać 7,5 μg dsRNA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Współtransfekować komórki poddane działaniu dsRNA za pomocą pBluescript i pMT-Notch11 (DGRC) samodzielnie lub z pMT-Notch i pMT-Delta11 (DGRC) lub pMT-Serrate17 dla całkowitego stężenia DNA 2 μg/studnię przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: pBluescript jest używany jako kontrolka. Współtransfekowane komórki będą dalej nazywaneprzejściowymi komórkami S2-Notch&Delta lub przejściowymi S2-Notch&Ząbkowanymi.</li>
		<li>Inkubować przejściowo transfekowane komórki S2 w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Dodać 0,7 mM CuSO4 w celu wywołania ekspresji Notch i ligandów i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować komórki wysyłające sygnał zgodnie z opisem w ppkt 2.2.</li>
	<li>Przeprowadzić agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały, jak opisano w sekcji 2.3.</li>
	<li>Określ ilościowo hamowanie wiązania trans przez cis-ligandy.
	<ol>
		<li>Oblicz liczbę agregatów na ml między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi jako kontrolka tła.</li>
		<li>Określ ilościowo wielkość inhibicji przez cis-ligandy w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Zdefiniuj A jako liczbę agregacji między komórkamiprzejściowymi S2-Notch i S2-Delta.</li>
			<li>Zdefiniuj B jako liczbę agregatów między komórkami S2 przejściowo współtransfekowanymi z komórkami Notch i Delta (przejściowe S2-Notch&Delta) oraz komórkami S2-Delta.</li>
			<li>Obliczać agregacja względna C = (B x 100)/A</li>
			<li>Obliczać wielkość inhibicji przez cis-ligand (Delta lub Serrate) jako 100 – C. 
			UWAGA: Na przykład, jeśli względna agregacja wynosi 45%, uważa się, że cis-ligandy hamują wiązanie trans o 55%.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li>
<li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li>
<li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li>
<li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li>
<li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Notch+signaling+pathway%3A+unfolding+the+activation+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li>
<li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li>
<li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).</li>
<li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).</li>
<li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li>
<li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta%2C+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li>
<li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li>
<li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li>
<li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li>
<li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li>
<li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate%2FJagged+and+Delta+family+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Sygnalizacja Canonical Notch zależy od interakcji między receptorem Notch a jego ligandami5. Chociaż większość badań nad szlakiem Notch bierze pod uwagę przede wszystkim wiązanie Notch i ligandów w sąsiednich komórkach (trans), ligandy Notch i te same komórki oddziałują ze sobą, a te tak zwane interakcje cis mogą odgrywać rolę hamującą w sygnalizacji Notch 3,4. W związku z tym, aby rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw...

Sygnalizacja Canonical Notch to mechanizm komunikacji między komórkami krótkiego zasięgu, który wymaga fizycznego kontaktu sąsiednich komórek, aby ułatwić interakcję między receptorami Notch i ich ligandami1. Interakcja receptora Notch (obecnego na powierzchni komórek odbierających sygnał) z ligandami (obecnymi na powierzchni komórek wysyłających sygnał) inicjuje sygnalizację Notch i jest znana jako transaktywacja2. Z drugiej strony, interakcja między Notch i jego ligandami w tej samej komórce prowadzi do zahamowania szlaku Notch i jest znana jako cis-inhibibition3. Równowaga między oddziaływaniami trans- i cis jest wymagana, aby zapewnić optymalną sygnalizację Notch zależną od ligandu4. Drosophila ma jeden receptor Notch i dwa ligandy (Delta i Serrate), w przeciwieństwie do ssaków, które mają cztery receptory Notch i pięć ligandów [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 i DLL4]5. Dzięki tej prostocie model Drosophila oferuje łatwość analizowania/badania wpływu modyfikatorów szlaku na interakcje Notch-ligand, a następnie na sygnalizację Notch. W pewnych kontekstach podczas rozwoju zwierząt (w tym rozwoju skrzydeł u Drosophila), zarówno interakcje cis, jak i trans są zaangażowane w osiągnięcie prawidłowej sygnalizacji Notch i losu komórki1,6. Ważne jest, aby rozróżnić wpływ modyfikatorów szlaku Notch w tych kontekstach na cis- i trans-interakcje Notch z jego ligandami.
Nasza grupa wcześniej informowała, że dodanie reszty węglowodanowej zwanej ksylozą do Drosophila Notch negatywnie reguluje sygnalizację Notch w pewnych kontekstach, w tym rozwoju skrzydeł7. Utrata shams (enzymu, który ksylozyluje Notch) prowadzi do fenotypu "utraty żyły skrzydła"7. Niedawno wykorzystano eksperymenty z dawkowaniem genów i analizę klonalną, aby wykazać, że utrata pozorów wzmacnia izolowanie Notch za pośrednictwem Delta. Aby rozróżnić, czy wzmocniona sygnalizacja Notch w mutantach pozornych jest wynikiem zmniejszonego hamowania cis, czy zwiększonej transaktywacji, przeprowadzono badania ektopowej nadekspresji ligandów Notch w dyskach wyobrażeniowych skrzydeł larwalnych przy użyciu sterownika dpp-GAL4. Eksperymenty te dostarczyły dowodów sugerujących, że Shams reguluje trans-aktywację Notch przez Delta, nie wpływając na inhibicję Cis Notch przez ligandy8. Jednak regulacje sprzężenia zwrotnego i efekty endogennych ligandów mogą komplikować interpretację badań nad nadekspresją ektopową1,6,9.
Aby rozwiązać ten problem, użyto komórek Drosophila S210, które zapewniają prosty system in vitro do badań interakcji Notch-ligand11,12. Komórki S2 nie wyrażają endogennego receptora Notch i liganda Delta11 i wyrażają niski poziom Serrate13, co nie wpływa na eksperymenty agregacji ligandu Notch8. Dlatego komórki S2 mogą być stabilnie lub przejściowo transfekowane przez Notch i / lub pojedyncze ligandy (Delta lub Serrate) w celu wytworzenia komórek, które wyrażają wyłącznie receptor Notch lub jeden z jego ligandów lub ich kombinację. Mieszanie komórek S2 eksprymujących Notch z komórkami S2 eksprymujących ligand powoduje powstawanie heterotypowych agregatów, w których pośredniczy wiązanie receptor-ligand11,12,14. Kwantyfikacja tworzenia agregatu dostarcza miary trans-wiązania między Notch a jego ligandami15 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Podobnie, komórki S2 mogą być współtransfekowane z ligandami Notch i Delta lub Serrate (tj. cis-ligandami). Ligandy cis-ligandy w tych komórkach S2 eksprymujących Notch znoszą wiązanie Notch z trans-ligandami i powodują zmniejszone tworzenie agregatów8,12,14. Względny spadek tworzenia agregatów spowodowany przez cis-ligandy stanowi miarę hamującego wpływu cis-ligandów na wiązanie między Notch i trans-ligandami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). W związku z tym wykorzystano testy agregacji komórek w celu zbadania wpływu utraty ksylozylacji na interakcje trans- i cis między Notch i jego ligandami.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół testów agregacji komórek, mający na celu ocenę wiązania Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy przy użyciu komórek Drosophila S2. Jako przykład podajemy dane, które pozwoliły nam określić wpływ ksylozylacji Notch na wiązanie między Notch a trans-Delta8. Te proste testy zapewniają półilościową ocenę interakcji Notch-ligand in vitro i pomagają określić mechanizmy molekularne leżące u podstaw działania in vivo modyfikatorów szlaku Notch.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider' s Pożywka Drosophila, zmodyfikowana</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicylina-Streptomycyna 100X roztwór</td><td>GE Healthcare nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td></td><td></td>SV30010</tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa CELLSTAR Mini</td> shaker <td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE HD Zestaw do transkrypcji</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (zestaw do oczyszczania RNA)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Mikroskop odwrócony</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Mikroskop cyfrowy + zaawansowane oprogramowanie</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>Akwizycja obrazu za pomocą oprogramowania ToupView</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Metotreksat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>Macron Chemikalia wysokowartościowe</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>Komórki S2</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-SerrateTom komórki</td><td></td><td></td><td>Prezent od R. Fleminga (Fleming i wsp., Rozwój, 2013)</td></tr><tr><td>Ogniwa S2-Delta</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa S2-Notch</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>wektor pMT-Delta</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>Prezent od S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pMT-Ząbkowany wektor</td><td></td><td></td><td>Prezent od Kena Irvine'a (Okajima i in., JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch wektor</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Prezent od S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Prezent od Hugo Bellena</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Zestaw</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>Test ekspresji genów TaqMan dla CG9996 (Shams)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>z barwnikiem FAM-MGB</td></tr><tr><td>Test ekspresji genów TaqMan dla CG7939 (RpL32)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td><td>z barwnikiem FAM-MGB</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>96-dołkowy moduł blokowy</td></tr></tbody></table>

testy agregacji komórek w celu oceny wiązania drosophila notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Sygnalizacja Notch to ewolucyjnie zachowany system komunikacji komórka-komórka, szeroko stosowany w rozwoju zwierząt i utrzymaniu dorosłych. Interakcja receptora Notch z ligandami z sąsiednich komórek indukuje aktywację szlaku sygnałowego (transaktywację), podczas gdy interakcja z ligandami z tej samej komórki hamuje sygnalizację (cis-inhibicję). Właściwa równowaga między transaktywacją a inhibicją, pomaga ustalić optymalne poziomy sygnalizacji Notch w niektórych kontekstach podczas rozwoju zwierząt. Ze względu na nakładające się na siebie domeny ekspresji Notch i jego ligandów w wielu typach komórek oraz istnienie mechanizmów sprzężenia zwrotnego, badanie wpływu danej modyfikacji potranslacyjnej na interakcje trans- i cis-interakcje Notch i jego ligandów in vivo jest trudne. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystania komórek Drosophila S2 w testach agregacji komórek w celu oceny wpływu strącenia modyfikatora szlaku Notch na wiązanie Notch z każdym ligandem w trans i cis. Komórki S2 stabilnie lub przejściowo transfekowane wektorem wyrażającym Notch są mieszane z komórkami wyrażającymi każdy ligand Notch (S2-Delta lub S2-Serrate). Transwiązanie między receptorem a ligandami powoduje tworzenie heterotypowych agregatów komórkowych i jest mierzone pod względem liczby agregatów na ml złożonych z >6 komórek. Aby zbadać hamujący wpływ cis-ligandów, komórki S2 koeksprymujące Notch i każdy ligand miesza się z komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi, a liczbę agregatów określa się ilościowo, jak opisano powyżej. Względny spadek liczby agregatów spowodowany obecnością cis-ligandów stanowi miarę hamowania wiązania trans za pośrednictwem cis-ligandów. Te proste testy mogą dostarczyć półilościowych danych na temat wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych na wiązanie Notch z jego ligandami i mogą pomóc w rozszyfrowaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wpływu takich manipulacji in vivo na sygnalizację Notch.

Nasze in vivo obserwacje sugerowały, że utrata genu ksylozylotransferazy pozory prowadzi do wzmocnienia sygnalizacji Notch w wyniku zwiększonego oddziaływania Delta Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.-aktywacja szlaku Notch bez wpływu na cis-hamowanie szlaku Notch przez ligandy8Aby sprawdzić tę hipotezę, in vitro przeprowadzono testy agregacji komórek. Najpierw, pozorowane zabiegi ekspresję w komórkach S...

Złożoność systemów in vivo utrudnia rozróżnienie między aktywacją a hamowaniem receptora Notch odpowiednio przez trans- i cis-ligandy. W tym miejscu przedstawiamy protokół oparty na testach agregacji komórek in vitro do jakościowej i półilościowej oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami w porównaniu z cis-ligandami.

Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Ogólnym celem tego testu agregacyjnego jest ocena wiązania receptora Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie, w jaki sposób czynnik genetyczny lub farmakologiczny wpłynie na wiązanie receptora Notch z jego ligandem i zmieni sygnalizację? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę wiązania receptora Notch z jego ligandem.Co ciekawe, bez uwzględniania nakładającego się efektu endogennego ligandu. Rozpocznij ocenę od wyłączenia komórek odbierających sygnał i ponownego zawieszenia ich w pożywce Schneidera. Policz komórki ręcznie za pomocą hemacytometru.Płytka pięć razy po 10 do piątej S2 i stabilne komórki S2-Notch w każdym dołku sześciodołkowej płytki, po jednym mililitrze na dołek pożywki Schneidera. Następnie dodaj 7,5 mikrograma dwuniciowego RNA do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Dodaj 0,7 milimola siarczanu miedzi, aby wywołać ekspresję Notch i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.Po inkubacji policz komórki wysyłające sygnał ręcznie za pomocą hemacytometru. I płytkę pięć razy po 10 do szóstej stabilnej komórki w każdym dołku sześciodołkowej płytki, w jednym mililitrze na studzienkę uzupełnionej pożywki Schneidera. Następnie dodaj 0,7 milimola siarczanu miedzi, aby indukować ekspresję ligandów i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Zbierz dwuniciowe komórki kontrolne S2-control i S2-Notch poddane działaniu RNA przez delikatne pipetowanie. I płytka 2,5 razy 10 do piątej komórki na dołek w 24-dołkowej płytce. Dodaj pięć razy 10 do piątych stabilnych komórek pomidora S2-Delta lub S2-ząbkowanych do całkowitej objętości 200 mikrolitrów uzupełnionego podłoża Schneidera.Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min. Po minucie wymieszaj zawartość każdej studzienki i wyjmij 20 mikrolitrów, aby policzyć liczbę kruszyw. Jednocześnie wykonaj reprezentatywny obraz pod odwróconym mikroskopem złożonym przy użyciu 10-krotnego powiększenia.Aby zobrazować komórki, ustaw kamerę na mikroskopie i połącz się z oprogramowaniem, aby uzyskać obraz. Ręcznie policz agregaty za pomocą hemacytometru. Umieść talerz na shakerze.Powtórz akwizycję i liczenie obrazu po pięciu minutach i 15 minutach agregacji. Przeprowadź kwantyfikację wiązania trans-bindingu, obliczając liczbę agregatów na mililitr między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi pomidorami jako kontrolę tła oraz liczbę agregatów na mililitr między komórkami pomidora S2-Notch i S2-Delta lub S2-ząbkowanymi. Przygotuj komórki odbierające sygnał, posiewając pięć razy od 10 do piątej komórki S2 w każdym dołku sześciodołkowej płytki, po jednym mililitrze na studzienkę uzupełnionej pożywki Schneidera.Dodaj 7,5 mikrograma dwuniciowego RNA do każdego dołka i inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji należy przeprowadzić kotransfekcję dwuniciowych komórek poddanych działaniu RNA, uzyskując całkowite stężenie DNA wynoszące dwa mikrogramy na studzienkę, używając komercyjnego odczynnika do transfekcji. Inkubuj przejściowo transfekowane komórki S2 w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnego dnia dodaj 0,7 milimolowego siarczanu miedzi, aby wywołać ekspresję Notch i ligandów, a następnie inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni. Przygotuj komórki wysyłające sygnały zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. I na koniec wykonaj agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały, jak opisano wcześniej.Zaobserwowano gwałtowny wzrost liczby agregatów w okresie od jednej do pięciu minut. Następnie liczba agregatów rosła do 30 minut, w wolniejszym tempie. Obrazy pokazujące agregację w trzech punktach czasowych pokazują, że dwuniciowe komórki S2-Notch traktowane RNA EGFP tworzyły agregaty z komórkami S2-Delta, których liczba rośnie z czasem.W przeciwieństwie do tego, pozory i dwuniciowe komórki S2-Notch traktowane RNA tworzyły agregaty szybciej, a agregaty były większe i liczniejsze. Wskazuje to, że zmniejszające się poziomy pozorów wzmacniały trans-wiązanie Notch z Delta. Transfekcja równych ilości konstruktów ekspresji Notch i Delta do komórek S2 radykalnie zmniejsza liczbę agregatów powstałych między tymi komórkami a komórkami S2-Delta.Co więcej, zmniejszenie ilości cis-Delta powoduje wzrost liczby agregatów. Wskazuje to, że w zakresie stosunków Notch/cis-Delta stosowanych w tych testach, cis-Delta może hamować wiązanie między Notch i trans-Delta w sposób zależny od dawki. Kwantyfikacja względnej agregacji wykazała porównywalne hamowanie agregacji po leczeniu EGFP i pozorowanym dwuniciowym RNA.Po przygotowaniu wszystkich odczynników test ten jest prosty i można go wykonać w ciągu kilku godzin.

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Drosophila słynie z potężnej manipulacji genetycznej, ale nie z przydatności do dogłębnej analizy biochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy procedurę opartą na TAP, która ma na celu identyfikację oddziałujących partnerów dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu muchy. Procedura ta może potencjalnie prowadzić do powstania nowych kierunków badań.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Tutaj opisujemy test kurczliwości z użyciem komórek Drosophila S2R+. Zastosowanie egzogennego liganda, gastrulacji fałdowej (Mgła), prowadzi do aktywacji szlaku sygnałowego Mgły i kurczliwości komórek. Test ten można wykorzystać do zbadania regulacji białek kurczliwości komórkowej w szlaku sygnałowym mgły.

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Poznaj testy agregacji komórek do oceny wiązania receptora Notch z trans-ligandami i hamowania przez cis-ligandy. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników genetycznych i farmakologicznych na sygnalizację Notch.

Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

Przeglądaj więcej filmów