Testy agregacji komórek w celu oceny wiązania Drosophila Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy

Ogólnym celem tego testu agregacyjnego jest ocena wiązania receptora Notch z trans-ligandami i jego hamowania przez cis-ligandy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie, w jaki sposób czynnik genetyczny lub farmakologiczny wpłynie na wiązanie receptora Notch z jego ligandem i zmieni sygnalizację? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę wiązania receptora Notch z jego ligandem.

Co ciekawe, bez uwzględniania nakładającego się efektu endogennego ligandu. Rozpocznij ocenę od wyłączenia komórek odbierających sygnał i ponownego zawieszenia ich w pożywce Schneidera. Policz komórki ręcznie za pomocą hemacytometru.

Płytka pięć razy po 10 do piątej S2 i stabilne komórki S2-Notch w każdym dołku sześciodołkowej płytki, po jednym mililitrze na dołek pożywki Schneidera. Następnie dodaj 7,5 mikrograma dwuniciowego RNA do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Dodaj 0,7 milimola siarczanu miedzi, aby wywołać ekspresję Notch i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Po inkubacji policz komórki wysyłające sygnał ręcznie za pomocą hemacytometru. I płytkę pięć razy po 10 do szóstej stabilnej komórki w każdym dołku sześciodołkowej płytki, w jednym mililitrze na studzienkę uzupełnionej pożywki Schneidera. Następnie dodaj 0,7 milimola siarczanu miedzi, aby indukować ekspresję ligandów i inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Zbierz dwuniciowe komórki kontrolne S2-control i S2-Notch poddane działaniu RNA przez delikatne pipetowanie. I płytka 2,5 razy 10 do piątej komórki na dołek w 24-dołkowej płytce. Dodaj pięć razy 10 do piątych stabilnych komórek pomidora S2-Delta lub S2-ząbkowanych do całkowitej objętości 200 mikrolitrów uzupełnionego podłoża Schneidera.

Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min. Po minucie wymieszaj zawartość każdej studzienki i wyjmij 20 mikrolitrów, aby policzyć liczbę kruszyw. Jednocześnie wykonaj reprezentatywny obraz pod odwróconym mikroskopem złożonym przy użyciu 10-krotnego powiększenia.

Aby zobrazować komórki, ustaw kamerę na mikroskopie i połącz się z oprogramowaniem, aby uzyskać obraz. Ręcznie policz agregaty za pomocą hemacytometru. Umieść talerz na shakerze.

Powtórz akwizycję i liczenie obrazu po pięciu minutach i 15 minutach agregacji. Przeprowadź kwantyfikację wiązania trans-bindingu, obliczając liczbę agregatów na mililitr między komórkami S2 a komórkami S2-Delta lub S2-ząbkowanymi pomidorami jako kontrolę tła oraz liczbę agregatów na mililitr między komórkami pomidora S2-Notch i S2-Delta lub S2-ząbkowanymi. Przygotuj komórki odbierające sygnał, posiewając pięć razy od 10 do piątej komórki S2 w każdym dołku sześciodołkowej płytki, po jednym mililitrze na studzienkę uzupełnionej pożywki Schneidera.

Dodaj 7,5 mikrograma dwuniciowego RNA do każdego dołka i inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji należy przeprowadzić kotransfekcję dwuniciowych komórek poddanych działaniu RNA, uzyskując całkowite stężenie DNA wynoszące dwa mikrogramy na studzienkę, używając komercyjnego odczynnika do transfekcji. Inkubuj przejściowo transfekowane komórki S2 w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia dodaj 0,7 milimolowego siarczanu miedzi, aby wywołać ekspresję Notch i ligandów, a następnie inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni. Przygotuj komórki wysyłające sygnały zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. I na koniec wykonaj agregację między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały, jak opisano wcześniej.

Zaobserwowano gwałtowny wzrost liczby agregatów w okresie od jednej do pięciu minut. Następnie liczba agregatów rosła do 30 minut, w wolniejszym tempie. Obrazy pokazujące agregację w trzech punktach czasowych pokazują, że dwuniciowe komórki S2-Notch traktowane RNA EGFP tworzyły agregaty z komórkami S2-Delta, których liczba rośnie z czasem.

W przeciwieństwie do tego, pozory i dwuniciowe komórki S2-Notch traktowane RNA tworzyły agregaty szybciej, a agregaty były większe i liczniejsze. Wskazuje to, że zmniejszające się poziomy pozorów wzmacniały trans-wiązanie Notch z Delta. Transfekcja równych ilości konstruktów ekspresji Notch i Delta do komórek S2 radykalnie zmniejsza liczbę agregatów powstałych między tymi komórkami a komórkami S2-Delta.

Co więcej, zmniejszenie ilości cis-Delta powoduje wzrost liczby agregatów. Wskazuje to, że w zakresie stosunków Notch/cis-Delta stosowanych w tych testach, cis-Delta może hamować wiązanie między Notch i trans-Delta w sposób zależny od dawki. Kwantyfikacja względnej agregacji wykazała porównywalne hamowanie agregacji po leczeniu EGFP i pozorowanym dwuniciowym RNA.

Po przygotowaniu wszystkich odczynników test ten jest prosty i można go wykonać w ciągu kilku godzin.