Name: Kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne z aktywnością wzrostu neurytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki wzrostu neurytów. Technika wykorzystuje cAMP do indukcji proregeneracyjnego fenotypu makrofagów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół jest wspierany przez grant NRF-2015R1A2A1A01003410 z Ministerstwa Nauki, ICT i Planowania Przyszłości Republiki Korei.

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Ajou.
1. Przygotowanie kultury zdysocjowanego dorosłego neuronu DRG
<ol>
	<li>Przed założeniem kultury należy wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę poli-D-lizyną i lamininą. Inkubować 6-dołkową płytkę z 0,01% poli-D-lizyną w temperaturze 37°C przez 2 godziny lub w temperaturze 4°C przez noc. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną.</li>
	<li>Inkubować płytkę z roztworem lamininy o stężeniu 3 μg/ml przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyć płytkę wodą destylowaną. Suszyć płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Poddaj eutanazji mysz w przezroczystej komorze CO2 podłączonej do butli ze sprężonym gazem CO2. Naciąć skórę przylegającą do kręgosłupa za pomocą ostrza chirurgicznego i wypreparować mięśnie przykręgosłupowe obustronnie, aby odsłonić kości kręgowe. Usuń kości kręgowe skrupulatnie za pomocą wąskiego rongeura chirurgicznego, aż DRG zostaną całkowicie odsłonięte. 
	UWAGA: Dorosłe neurony DRG uzyskuje się od dorosłych samców myszy C57BL6 w wieku od 8 tygodni do 12 tygodni.</li>
	<li>Usuń DRG obustronnie od S1 aż do poziomu C1 za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczyków z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym. Staraj się całkowicie wyciąć korzenie z DRG, aby zminimalizować zanieczyszczenie komórek Schwanna lub fibroblastów.</li>
	<li>Przechowuj rozcięte DRG na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 5 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) na lodzie, aż wszystkie DRG zostaną zebrane. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby jak najszybciej przeanalizować DRG. Pobranie wszystkich DRG od jednej myszy nie powinno trwać dłużej niż 30 min. 30 min po eutanazji należy przerwać zbieranie DRG i przejść do następnego kroku, nawet jeśli pozostały jeszcze DRG.</li>
	<li>Przenieś DRG do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml za pomocą niebieskiej końcówki pipety (1000 μl) z końcem odcinającym. Usuń DMEM po szybkim wirowaniu przez kilka sekund za pomocą mini wirówki. Dodać 1 ml DMEM zawierającego 125 U/ml kolagenazy typu XI i inkubować probówkę przez 90 minut z delikatnym obrotem (35-40 obr./min) za pomocą wytrząsarki typu twister w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Unieruchom rurkę na podłodze wytrząsarki za pomocą taśmy.</li>
	<li>Wyrzuć DMEM zawierający kolagenazę i dodaj 1 ml świeżego DMEM. Poczekaj, aż pływające DRG całkowicie opadną na dno, a następnie usuń DMEM wraz z resztkami tkanki. Powtórz ten etap prania co najmniej sześć razy. 
	UWAGA: Nie próbuj całkowicie wyrzucić supernatantu. Należy uważać, aby nie usunąć żadnych DRG za pomocą supernatantu DMEM.</li>
	<li>Przenieś DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą niebieskiej końcówki pipety (1000 μl) z odciętym końcem. Następnie delikatnie pipetować w górę i w dół co najmniej 15 razy za pomocą niebieskiej końcówki (1000 μl), aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Unikaj robienia bąbelków i staraj się nie dotykać dna stożkowej rurki końcówką pipety.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 239 x g przez 3 minuty i ostrożnie wyrzucić supernatant wraz z pływającymi zanieczyszczeniami. Dodać 1 ml pożywki Neurobaseal z dodatkiem witaminy B27 (2,0% v/v) i ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół od 5 do 10 razy.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm nałożone na stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Odczekaj 2 minuty, a następnie wylej pożywkę Neurobasal/B-27 na sitko za pomocą kontrolera pipet.</li>
	<li>Umieść wszystkie zebrane neurony DRG (w sumie około 2 x 106 neuronów DRG z jednej myszy) na dwóch dołkach 6-dołkowej płytki. Neurony DRG od jednej dorosłej myszy pokrywają dwie studzienki w 6-dołkowej płytce. Następnie umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C, aż makrofagi ulegną kokulturom.</li>
</ol>
2. Jednoczesna hodowla makrofagów otrzewnowych P rimary na wstawce do hodowli komórkowej
UWAGA: Ustal kokultury 4 godziny po początkowym posiewie zdysocjowanych neuronów DRG
<ol>
	<li>Pierwotne makrofagi otrzewnowe przygotowuje się z dorosłych samców myszy C57BL6 w wieku od 8 tygodni do 12 tygodni. Poddaj zwierzę eutanazji w komorze CO2 . Delikatnie naciąć skórę brzucha, odsłonić otrzewną i unikać przecinania otrzewnej, aby zapobiec wyciekowi płynu z płukania.</li>
	<li>Nakłuć otrzewną za pomocą strzykawki z igłą 22G i wstrzyknąć 10 ml lodowatej soli buforowanej fosforanami (PBS) do jamy otrzewnej. Delikatnie masuj otrzewną przez 1-2 min. Następnie wyciągnąć igłę i wycisnąć PBS przez miejsce nakłucia igły i zebrać płyn z płukania do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Przed użyciem należy umieścić strzykawkę na lodzie, aby utrzymać chłód PBS.</li>
	<li>Odwirować płyn popłuczynowy o stężeniu 239 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia składników komórkowych. Zawiesić osad z 3 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować zawiesinę komórek przy 239 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad w 3 ml PBS i ponownie odwirować zawiesinę komórkową w celu usunięcia pozostałego buforu do lizy RBC. 
	UWAGA: Upewnij się, że bufor do lizy RBC został całkowicie usunięty. W przeciwnym razie pozostały bufor do lizy RBC może być toksyczny dla hodowanych makrofagów.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki Neurobaseal/B-27. Połowę wszystkich zebranych makrofagów (łącznie 3 × 106 do 6 x 106 komórek) umieścić na płytce do hodowli komórkowej o powierzchni efektywnej 4,2cm2, którą umieszcza się na wierzchu studzienki z dysocjacją DRG. 
	UWAGA: W okresie kohodowli makrofagi są hodowane w pożywce do hodowli neuronów Neurobasal/B-27. Potwierdzono odpowiednią przeżywalność makrofagów w tym stanie.</li>
</ol>
3. Leczenie Db-Camp i Kolekcja Makrofagów CM
UWAGA: Rozpocznij leczenie db-cAMP 4 godziny po kokulturach neuronów i makrofagów.
<ol>
	<li>Dodaj 2 μl 100 μM roztworu db-cAMP do kokultur neuronów i makrofagów. Dodaj tę samą objętość PBS dla eksperymentu kontrolnego.</li>
	<li>Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę 1 ml pożywki do hodowli makrofagów na tej samej 6-dołkowej płytce. Przenieść wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturach neuronów i makrofagów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów. Utrzymuj komórki w tym samym stanie przez 72 godziny bez zmiany podłoża. 
	UWAGA: Podczas pobierania CM dodajemy tylko 1 ml pożywki do hodowli makrofagów, aby uzyskać skoncentrowany CM. Podczas zbierania CM, jeśli zaszła taka potrzeba, dodaliśmy więcej, aby całkowicie pokryć makrofagi we wkładce.</li>
	<li>Po 72 godzinach odwirować makrofag CM przy 239 x g przez 5 minut w celu usunięcia składników komórkowych. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe. Zebrany CM należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Test na przerost neurytów z pobranym CM
<ol>
	<li>Przed założeniem oddzielnej hodowli neuronów dorosłego DRG, należy wstępnie pokryć szkiełko z 8-dołkową komorą, postępując zgodnie z tą samą procedurą opisaną w 1.1 i 1.2.</li>
	<li>Uzyskaj zdysocjowane dorosłe neurony DRG w pożywce neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 przy użyciu tych samych metod, które opisano od 1,3 do 1,10. Płytka 5 x 104 komórki na studzienkę na wstępnie powlekanym szkiełku 8-dołkowym.</li>
	<li>Umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny, pozwalając komórkom przymocować się do dna. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną rozmrożonym CM, który jest wstępnie podgrzany do 37 °C. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie dotknąć dna szkiełka z 8-dołkową komorą podczas wyjmowania pożywki hodowlanej i dodawania zebranego CM.</li>
	<li>15 godzin po wstępnym posiewie usunąć pożywkę i raz przemyć komórki PBS. Następnie dodać 200 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu do studzienek i inkubować komórki z roztworem paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze 4 °C 
	UWAGA: Hodowla neuronów DRG do testu wzrostu neurytów powinna być dokładnie ograniczona do 15 godzin. W tym stanie nie ma znaczącego wyrostu neurytów.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie lodowatym PBS, a następnie wykonać blokowanie 10% normalną surowicą kozią (NGS) z 0,1% Triton-X przez 30 minut. Inkubować utrwalone komórki roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (anty-Tuj-1) rozcieńczonym 10% NGS (w stężeniu 1 μg/ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie PBS, a następnie inkubować komórki z roztworem przeciwciał drugorzędowych (koza-anty mysz) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć dwukrotnie PBS i zamontować szkiełko hodowlane za pomocą szkiełka nakrywkowego (24 × 50 mm) za pomocą roztworu montażowego.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobrazować przerost neurytów.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka kluczowych etapów tworzenia tego systemu kokultur. Ważne jest, aby upewnić się, że neurony DRG myszy i makrofagi otrzewnej są przygotowane świeże i zdrowe. Doświadczyliśmy zmniejszonej aktywności wzrostu neurytów CM, gdy rozbiór wszystkich DRG trwał dłużej niż 30 minut. Ponadto zanieczyszczenie składników krwi w makrofagach otrzewnowych doprowadziło również do zmniejszenia aktywności wzrostu neurytów w CM. W celu wywołania silnej interakcji neuron-makrofag przez db-cAMP, dokładne mycie byłoby również kryty...

Różnorodne badania miały na celu poprawę regeneracji aksonów OUN po urazach rdzenia kręgowego lub mózgu. Tradycyjnie uważa się, że reakcje zapalne, nieuchronnie towarzyszące urazom układu nerwowego, uczestniczą w wtórnych procesach patologicznych prowadzących do szkodliwych skutków1,2. Rzeczywiście, metyloprednizolon, który może tłumić reakcje zapalne, jest jedyną zatwierdzoną terapią ostrego uszkodzenia rdzenia kręgowego3. Jednak nowsze badania dostarczyły dowodów na to, że makrofagi, reprezentatywny typ komórek zapalnych, mogą uczestniczyć w regeneracji lub naprawie uszkodzonego układu nerwowego4,5,6. Na przykład naciekające makrofagi po uszkodzeniu soczewki wytwarzają cząsteczki proregeneracyjne, które wspomagają regenerację neuronów zwojowych siatkówki7,8. Ponadto, przeszczepione neurony DRG zwiększały wzrost aksonów w górę, w regionie, w którym makrofagi były aktywowane przez zymosan9. Co więcej, makrofagi w miejscu zmiany chorobowej mogą tworzyć środowisko permisywne dla uszkodzonych nerwów obwodowych10.
Nasza praca dostarczyła również mocnych dowodów na to, że makrofagi mogą przyczyniać się do zdolności regeneracji aksonów w sąsiednich neuronach. Wykazaliśmy, że aktywacja makrofagów w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) była niezbędna do zwiększenia zdolności regeneracyjnych neuronów czuciowych DRG po wstępnym kondycjonowaniu uszkodzenia nerwów obwodowych11. Podobne badania zostały niezależnie zgłoszone z innego laboratorium12. Wykazaliśmy również, że dozwojowe wstrzyknięcie cyklicznego AMP dibutyrylu (db-cAMP), który jest dobrze znaną cząsteczką zwiększającą zdolność regeneracji aksonów13, indukowało aktywację makrofagów. Dezaktywacja makrofagów zniosła wpływ db-cAMP na aktywność wzrostu neurytów. Późniejsze prace zidentyfikowały wywołaną urazem ekspresję CCL2 w neuronach jako sygnał do stymulacji makrofagów o fenotypie proregeneracyjnym14,15.
Na podstawie powyższych wyników eksperymentalnych, stworzyliśmy model in vitro przypominający zdarzenia molekularne, które występują w DRG po modelu urazów kondycjonowania wstępnego11,14. W tym modelu db-cAMP stosuje się do kokultur neuronów i makrofagów, wywołując sygnalizację międzykomórkową, która prowadzi do aktywacji makrofagów o fenotypie proregeneracyjnym. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły, za pomocą których możemy generować makrofagi, które wydzielają czynniki molekularne sprzyjające wzrostowi neurytów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten eksperymentalny model ilustruje koncepcję, że makrofagi mogą być stymulowane lub indukowane w celu wspierania regeneracji aksonów po urazach układu nerwowego. Nasz model będzie również przydatny w badaniu mechanizmów w sygnalizacji międzykomórkowej, która prowadzi do aktywacji proregeneracyjnych makrofagów.

<table><tbody><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowej przezroczysta membrana PET 0,4 i mu; m rozmiar porów</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>Przezroczysta membrana PET z 0,4-&mu; m wielkość porów, dla płytki 6-dołkowej</td></tr><tr><td>70-&mu; m nylonowe sitko komórkowe</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szkiełko</td><td>hodowlane Biocoat</td><td></td><td>354632 z równomiernym zastosowaniem poli-D-lizyny</td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Thermo Fisher Naukowy, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Zawiera 1% glutamax i 1% suplementu penicyliny-streptomycyny</td></tr><tr><td>B-27, bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna Bromowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>3', 5'-cykliczny monofosforan adenozyny, N6,O2'-dibutyryl-, sól sodowa</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anty &beta; III tubulina (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)</td><td>wtórne Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa Inkubator CO2</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Preparacyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka skrętna</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Stal nierdzewna, 14cm, zakrzywiona, pojedyncze przegub</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - węglik wolframu i ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>ostre, ząbkowane</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, zakrzywione</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>proste, 3mm Krawędź tnąca, ostra</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 Mikrowirówka</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>Napięcie wejściowe: 115VAC</td></tr></tbody></table>

kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne z aktywnością wzrostu neurytów

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Istnieją mocne dowody na to, że makrofagi mogą uczestniczyć w regeneracji lub naprawie uszkodzonego układu nerwowego. Tutaj opisujemy protokół, w którym makrofagi są indukowane do produkcji kondycjonowanej pożywki (CM), która sprzyja wzrostowi neurytów. Dorosłe neurony zwoju korzenia grzbietowego (DRG) są ostro zdysocjowane i płytkowate. Po stabilnym przyczepieniu neuronów, makrofagi otrzewnowej są hodowane wspólnie na wkładce do hodowli komórkowej nałożonej na tę samą studzienkę. Dibutyryl cykliczny AMP (db-cAMP) nakłada się na kokultury przez 24 godziny, po czym wkładkę do hodowli komórkowej zawierającą makrofagi przenosi się do innego dołka w celu zebrania CM przez 72 godziny. CM z kokultur traktowanych db-cAMP, po zastosowaniu do oddzielnej dorosłej hodowli neuronów DRG, wykazuje silną aktywność wzrostu neurytów. CM uzyskany z kultur traktowanych db-cAMP składających się z samego pojedynczego typu komórek, neuronu DRG lub makrofagów otrzewnowych, nie wykazywał aktywności wzrostu neurytów. Wskazuje to, że interakcja między neuronami a makrofagami jest niezbędna do aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne o aktywności wyrostkowej neurytów do CM. W związku z tym nasz paradygmat kohodowli będzie również przydatny do badania sygnalizacji międzykomórkowej w interakcji neuron-makrofag, aby stymulować makrofagi do obdarowania fenotypem proregeneracyjnym.

Opisujemy protokół umożliwiający generowanie makrofagów zdolnych do wydzielania czynników molekularnych stymulujących wzrost neurytów. Pożywka warunkująca (CM) z makrofagów uzyskana z kokultur traktowanych db-cAMP wywoła intensywny wzrost neurytów po zastosowaniu do osobnej kultury neuronów zzwojów korzeniowych tylnych (DRG) (Ryc. 2A). Dla porównania, CM uzyskana z kokultur traktowanych PBS nie wywoła wzrostu neurytów w ciągu 15 h czasu trwania hodowli (<stro...

Obecny protokół przedstawia eksperymentalne procedury stymulujące hodowlane makrofagi do wyposażenia w zdolność do uwalniania czynników molekularnych, które sprzyjają wzrostowi neurytów. Traktowanie cAMP kokulturami neuronów i makrofagów indukuje makrofagi do wytwarzania kondycjonowanej pożywki, która ma silną aktywność wzrostu neurytów.

Kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne z aktywnością wzrostu neurytów

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie makrofagów, które mogą wydzielać czynniki molekularne sprzyjające wzrostowi neurytów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób neurony i makrofagi oddziałują ze sobą, aby aktywować proregeneracyjny makrofagikfenotyp w celu promowania doskonałej regeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że używamy Cyclic AMP, cząsteczki adenozyny w surowicy, która jest znacznie bardziej fizjologicznym enzymem używanym w poprzednich badaniach do stymulacji makrofagów o fenotypie proregeneracyjnym.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że aktywacja makrofagów jest niezbędna do zwiększenia zdolności wzrostu aksjonów, a te mogą wytwarzać doskonałe neurony po zachowaniu środków ostrożności w przypadku trwałego uszkodzenia płata. Przed założeniem hodowli należy wstępnie zakodować sześciodołkową płytkę z poli-D lycine i lamininą. Następnie inkubować sześciodołkową płytkę z 0,01 poli-D lycine w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc.Następnie dwukrotnie umyj talerz wodą destylowaną. Następnie inkubować płytkę z roztworem lamininy w stężeniu trzech mikrogramów na mililitr przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytkę dwukrotnie wodą destylowaną i wysusz ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.Teraz naciąć skórę pokrywającą kręgosłup myszy poddanej eutanazji za pomocą ostrza chirurgicznego i wypreparować parę mięśni kręgowych obustronnie, aby odsłonić kości kręgowe. Usuń kości kręgów skrupulatnie za pomocą rongeura chirurgicznego z wąską końcówką, aż DRG zostaną całkowicie odsłonięte. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń DRG obustronnie od S1 aż do poziomu C1 za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczyków z cienką końcówką.Przenieś DRG do 1,5-mililitrowej probówki eppendorfa za pomocą niebieskiej końcówki pipety z odciętym końcem. Następnie usuń DMEM po szybkim wirowaniu przez kilka sekund za pomocą miniwirówki. Dodaj jeden mililitr DMEM zawierającego 125 jednostek na mililitr kolagenu typu 11 i inkubuj probówkę przez 90 minut, delikatnie obracając za pomocą wytrząsarki twister w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć kolagenazę zawierającą DMEM i dodaj jeden mililitr świeżego DMEM. Przenieś DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów za pomocą niebieskiej końcówki pipety z odciętym końcem. Następnie delikatnie pipetować w górę i w dół co najmniej 15 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.Odwirować probówkę o stężeniu 239 G przez trzy minuty i ostrożnie wyrzucić supernatant wraz z pływającymi zanieczyszczeniami. Dodaj jeden mililitr pożywki neurobazyliowej uzupełnionej witaminą B27 i ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę iw dół pięć do dziesięciu razy. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów nałożone na 50-mililitrową stożkową rurkę.Następnie umieść wszystkie zebrane neurony DRG w dwóch dołkach z sześciodołkowej płytki. Aby przygotować pierwotne makrofagi otrzewnowe od dorosłej myszy, delikatnie naciąć skórę brzucha, aby odsłonić otrzewną i unikać przecinania otrzewnej, aby zapobiec wyciekowi płynu z płukania. Następnie nakłuj otrzewną za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22 i wstrzyknij 10 mililitrów lodowatego PBS do jamy otrzewnej.Delikatnie masuj otrzewną przez jedną do dwóch minut. Następnie wyciągnij igłę i wyciśnij PBS przez miejsce nakłucia igły i zbierz płyn z płukania w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwirować płyn płuczący o sile 239 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować składniki komórkowe.Następnie ponownie zawiesić osad z trzema mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie odwirować zawiesinę komórkową o masie 239 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze pożywki neurobazylii B27.Umieść połowę wszystkich zebranych makrofagów na wkładce do hodowli komórkowej o efektywnej powierzchni 4,2 centymetra kwadratowego, którą umieszcza się na górze studzienki zdysocjowanego DRG. Cztery godziny po wspólnej hodowli makrofagów neuronów dodaj dwa mikrolitry 100-mikromolowego roztworu cyklicznego wzmacniacza DB do kokultur makrofagów neuronów. Po 24 godzinach napełnij pustą studzienkę jednym mililitrem pożywki do hodowli makrofagów na tej samej sześciodołkowej płytce.Przenieś wkładkę do hodowli komórkowej w kokulturze makrofagów neuronów do pustej studzienki z pożywką do hodowli makrofagów. Po 72 godzinach odwirować pożywkę kondycjonowaną makrofagami pod ciśnieniem 239 razy g przez pięć minut, aby usunąć składniki komórkowe. Przepuść supernatant przez filtr 0,2 mikrometra, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe.W tej procedurze należy wstępnie pokryć szkiełko z ośmioma komorami lycyną poli-D i lamininą. Następnie uzyskaj zdysocjowane dorosłe neurony DRG i pożywkę neurobazyliową, uzupełnione witaminą B27 przy użyciu tych samych metod, jak opisano wcześniej. Płytkę pięć razy po 10 do czterech komórek na studzience na wstępnie powlekanym szkiełku z ośmioma dołkami.Następnie umieść szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny, pozwalając komórkom przymocować się do dna. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną rozmrożoną, kondycjonowaną pożywką, która jest podgrzewana w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 15 godzin po wstępnym posiewie usuń pożywkę i umyj komórki raz PBS, a następnie dodaj 200 mikrolitrów lodowatego, 4% roztworu paraformaldehydu do studzienek i inkubuj komórki z roztworem paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie inkubuj utrwalone komórki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonym 10% normalną surowicą kozią przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić przerost neurytów. Pożywka kondycjonowana makrofagami uzyskana z kokultur traktowanych cyklicznym AMP DB spowodowała silny wzrost neurytów po zastosowaniu do oddzielnej hodowli neuronów DRG.Dla porównania, kondycjonowane podłoże uzyskane z kokultur traktowanych PBS nie indukowało wzrostu neurytów. Gdy cykliczny AMP DB jest traktowany hodowlą z samymi makrofagami, kondycjonowane podłoże nie było skuteczne we wspieraniu wzrostu neurytów. Sugeruje to, że interakcja neuronów z makrofagami jest niezbędna do stymulowania makrofagów do obdarowania ich zdolnościami proregeneracyjnymi.Przetestowaliśmy również kondycjonowaną pożywkę uzyskaną z cyklicznej hodowli neuronów traktowanej DB AMP i nie znaleźliśmy żadnego wzrostu neurytów. Należy pamiętać, że neurony i mikropłytki powinny być przygotowywane świeże i zdrowe. Doświadczyliśmy zmniejszonej aktywności przerostu neurytów pożywki stałej, gdy rozwarstwienie trwało zbyt długo lub makrofagi otrzewnej były zanieczyszczone składnikami krwi.W tym protokole zdysocjowane neurony DRG zostały fiskalnie oddzielone od makrofagów na wkładce do hodowli komórkowej. Dlatego nasz system kohodowli pozwoli na identyfikację czynników komórkowych odpowiedzialnych za sygnalizację międzykomórkową, które pośredniczą w aktywacji w pełni regenerujących się makrofagów.

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film pokazuje współhodowlę neuronów zwojowych i makrofagów mysiego korzenia grzbietowego. Neurony wysiewa się na powlekanej płytce, podczas gdy makrofagi są pobierane od myszy poddanej eutanazji, poddawane obróbce i dodawane do wkładki hodowlanej. Leczenie db-cAMP aktywuje neurony i skłania makrofagi do przyjęcia fenotypu proregeneracyjnego w celu wsparcia wzrostu neuronów.

Opracowanie kokultury neuronów i makrofagów in vitro

Ten film demonstruje test wspomagający wzrost projekcji neuronów, znany jako wzrost neurytów przy użyciu pożywki kondycjonowanej makrofagami. Współhoduj neurony i makrofagi za pomocą cAMP i zbieraj kondycjonowaną pożywkę pochodzącą z makrofagów. Hodowla neuronów za pomocą kondycjonowanej pożywki sprzyja wyrostkom neurytów. Te wyrostki są znakowane fluorescencyjnie i wizualizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Używanie pożywki kondycjonowanej makrofagami w celu promowania rozszerzeń neuronów

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj metodę kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki wzrostu neurytów. Technika wykorzystuje cAMP do indukcji proregeneracyjnego fenotypu makrofagów.

Kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne z aktywnością wzrostu neurytów

Przeglądaj więcej filmów