Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych
26 marca 2018
Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech komórek. Opisujemy metodę wykluczenia fluorescencyjnego pozwalającą na pomiar objętości neuronów in vitro w pełnym polu z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów i dynamicznych struktur implikowanych we wzroście neuronów.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie pełnego pomiaru objętości neuronów in vitro z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów w dynamicznych strukturach implikowanych we wzroście neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii komórkowej dotyczące dynamiki zmian objętości w skali subsydidalnej podczas niewzrostu lub zwyrodnienia aksonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia submikrometryczną rozdzielczość osiową w połączeniu z obserwacją w pełnym dopasowaniu i skalą czasu do godzin lub dni.
Aby rozpocząć procedurę, wyjmij blok PDMS pod kapturem chemicznym, wylewając na niego izopropanol. Następnie umieść go na ławce ze stali nierdzewnej okapu. Przetnij wokół silikonowego wafla i wyjmij replikę PDMS z formy.
Następnie przetnij wokół wióra i pozostaw dwumilimetrowy margines za pomocą skalpela lub żyletki. Przebij wlot, mocno naciskając dziurkacz o średnicy 1.5 milimetra i uruchom go, aby wyciąć i wyrzeźbić otwór wlotu. Zrób to samo w czterech dedykowanych strefach chipa, w których zostanie wstrzyknięta ciecz
.Następnie wyczyść chip, przyklejając i odklejając taśmę klejącą po stronie mikrostrukturalnej. Posyp izopropanolem z obu stron. Następnie wysusz wiór azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.
W tej procedurze umieść każde szkiełko nakrywkowe na wirówce znajdującej się w pomieszczeniu czystym. Nałóż kroplę dodatniego fotorezystu, aby pokryć około 75% szkiełka nakrywkowego i wirować z prędkością 4000 obr./min przez 30 sekund, aby osiągnąć ostateczną grubość 0,45 mikrometra. Umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej o temperaturze powierzchni 115 stopni Celsjusza na jedną minutę.
Za pomocą wyrównywacza maski naświetl każde szkiełko nakrywkowe na długości fali 435 nanometrów przez dedykowaną maskę zgodnie z parametrami producenta. Następnie przygotuj dwie szklane naczynia krystalizujące, jedno zawierające wywoływacz bez rozcieńczenia, drugie zawierające wodę dejonizowaną. Zanurzaj szkiełka nakrywkowe jeden po drugim w wywoływaczu na jedną minutę, ciągle i delikatnie mieszając naczynie krystalizujące.
Następnie zanurz wafel w wodzie dejonizowanej na około pięć sekund. Przenieś wafel na chłonny papier i wysusz go azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem. Umieść zarówno chip PDMS, jak i szklane naczynie, na którym zostanie on połączony, w komorze plazmowej w celu aktywacji powierzchniowej.
Następnie nanieś kroplę wody na prostokątne szkiełko mikroskopowe o dużej grubości i przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka kapilarnego. Pod mikroskopem zaznacz położenie pasków fotorezystu z tyłu szkiełka. Umieść wzorzyste szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie maski nakładki do maski.
Polegaj na znaku wykonanym w celu wyśrodkowania obiektów odniesienia fotorezystu. Aby zwiększyć kontrast optyczny, umieść płytkę krzemową pod chipem PDMS. Płytka silikonowa powinna pozostać mocno przymocowana do uchwytu podczas procesu wyrównywania.
Następnie umieść chip PDMS na ruchomym uchwycie podłoża nakładki maski. Następnie podnieś uchwyt na tyle, aby uwidocznić zarówno wiór, jak i układ pasków fotorezystu znajdujących się na szkiełku nakrywkowym, pozostając za stykiem mechanicznym. Wykonaj wyrównanie i uzyskaj kontakt mechaniczny między chipem a szkiełkiem nakrywkowym, podnosząc uchwyt, aż powierzchnia słupków PDMS dotknie szklanego szkiełka nakrywkowego.
Następnie opuść uchwyt. Usuń szkiełko nakrywkowe przyklejone do chipa z uchwytu maski. Następnie umieść urządzenie na 35-milimetrowej szalce Petriego i przenieś wszystko do piekarnika na pięć do dziesięciu minut, aby zwiększyć siłę wiązania.
Trzydzieści minut po klejeniu umieść na wlocie dziesięciolitrową końcówkę pipety wypełnioną roztworem PLO. Następnie załaduj płyn, aż utworzy się kropla na wierzchu. Powtórz tę samą operację na wylocie i zbiornikach.
Następnie dodaj PBS na szalce Petriego dookoła chipa. Uszczelnić szalkę Petriego folią parafinową i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć godzin. Następnie lekko wciśnij stożek końcówki o pojemności dziesięciu mikrolitrów w każdy otwór iniekcyjny i zassaj nadmiar płynu.
Następnie zastąp PLO, a także PBS otaczający chip pożywką hodowlaną. Następnie umieść chip w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż neurony wysieją się z co najmniej pięciogodzinnym czasem inkubacji. W tej procedurze należy pobrać pożywkę hodowlaną z chipa.
Zebrać dwa do trzech mikrolitrów świeżo zawieszonego roztworu komórkowego i wstrzyknąć go na wlocie. Natychmiast powtórz tę samą operację na wylocie. Wstrzyknąć mniej więcej taką samą objętość pożywki hodowlanej do każdego zbiornika.
Szybko obserwuj chip pod mikroskopem, aby sprawdzić gęstość komórek. Rząd wielkości optymalnej gęstości komórek odpowiada około pięciu do dziesięciu komórek na kwadratowej powierzchni ograniczonej czterema filarami. Powtórz procedurę wstrzykiwania 0,5 do 1 mikrolitra zawiesiny komórek, aby osiągnąć docelową gęstość komórek.
W przypadku obrazowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką obrazową. Następnie umieść chip pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Pozyskiwanie obrazów komórek z jednego lub wielu kolejnych obrazów w przypadku eksperymentów poklatkowych.
Pokazano tutaj reprezentatywne obserwacje kalibracyjnego paska fotorezystu i neuronów. Obrazy i przekroje tych obiektów w większym powiększeniu są wyświetlane po prawej stronie. Pokazano tu reprezentatywne neuryty i centralną komorę o wysokości trzech mikrometrów.
Objętość wycinka neurytu można obliczyć w funkcji szerokości neurytu. A oto reprezentatywne stożki wzrostu i centralna komora o wysokości trzech mikrometrów. Ich podstruktury wyłaniają się wyraźnie z optycznego szumu tła o długości około 20 nanometrów.
Obserwacje poklatkowe życia działają neurony umieszczone w komorze o wysokości 12 mikrometrów, aby śledzić cykl kurczenia się i reaktywacji stożka wzrostu w skali czasowej kilkudziesięciu minut. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby mieć dostęp do sprzętu do głębokiego trawienia jonowego w celu wytworzenia błota krzemowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrównać szkiełko nakrywkowe ze szkła strukturalnego z chipem PDMS.
Po opanowaniu technika ta może być odtwarzalnie stosowana do kwantyfikacji neurologii w 3D. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie farmakologii do zbadania wpływu różnych leków o rzeczywistym kalibrze, a wszystko to w kształcie zamkniętego stożka. Nie zapominaj, że praca z neuronami pierwotnymi wymaga dużej ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia i rozbicia.
Zawsze należy zachować delikatność i szybkość przy wymianie pożywki, aby ograniczyć czas spędzany na zewnątrz inkubatora.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską metodę wykluczania fluorescencyjnego do pomiaru pełnopowierzchniowego objętości neuronów in vitro z submikrometryczną rozdzielczością osiową. Technika ta jest niezbędna do analizy neurytów i dynamicznych struktur związanych ze wzrostem neuronów, co pozwala na głębokie zrozumienie fizjologii i patologii komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Badania neurologiczne
Wstęp
- Objętość neuronów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia charakterystyki komórkowej.
- Zmiany objętości w skali subkomórkowej są istotne podczas procesów fizjologicznych.
- Metoda ta ma na celu poprawę rozdzielczości w monitorowaniu dynamiki neurytów.
- Odpowiada ona na potrzebę wykonywania wysokoprecyzyjnych pomiarów objętości w badaniach neuronów.
Cel badania
- Aby umożliwić obrazowanie pełnego pola objętości neuronów z wysoką rozdzielczością.
- Aby ułatwić analizę neurytów oraz ich dynamiki strukturalnej.
- Aby dostarczyć informacji na temat procesów wzrostu i degeneracji neuronów.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano mikroprzepływowy chip z PDMS do pomiarów objętości.
- Model biologiczny koncentruje się głównie na neuronach w kulturze w celu szczegółowej obserwacji.
- W niniejszym badaniu nie zastosowano przepływów multiomicznych.
- Metoda obejmuje staranną fabrykację i montaż urządzenia mikroprzepływowego, a następnie obrazowanie przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego.
- Kluczowe etapy obejmują procesy powlekania, wiązania oraz wysiewania komórek.
Główne wyniki
- Metoda ta zapewnia submikrometryczną rozdzielczość osiową, niezbędną do obserwacji struktur neuronalnych.
- Dynamiczne zmiany neurytów były skutecznie monitorowane w czasie.
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości ujawniło subtelne szczegóły stożków wzrostu neuronów oraz przesunięcia strukturalne.
- Podejście to umożliwia precyzyjne obliczenia objętości przekrojów neurytów.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną technikę wysokorozdzielczych pomiarów objętości neuronów.
- Podejście to ma kluczowe znaczenie dla poszerzenia wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych i plastyczności.
- Wykazuje ono istotne znaczenie dla przyszłych badań nad dynamiką komórkową i neurobiologią.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne ilościowe określenie dynamiki objętości neuronów ma kluczowe znaczenie dla oceny związków neuroaktywnych we wczesnych etapach odkrywania leków, szczególnie w kontekście analizy integralności neurytów oraz zachowania stożków wzrostu. Metoda wykluczania fluorescencyjnego (Fluorescence eXclusion method, FXm) w połączeniu z wzorcowaniem mikrofluidycznym zapewnia submikrometryczną rozdzielczość osiową oraz obrazowanie całego pola, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku związków ukierunkowanych na strukturalną plastyczność neuronów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną podczas identyfikacji wiodących cząsteczek poprzez powiązanie zmian objętości podkomórkowej z efektami funkcjonalnymi w istotnych dla danej choroby modelach in vitro.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar lokalnych zmian objętości neurytów i stożków wzrostu jako funkcjonalnych wskaźników stanu zdrowia neuronów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych morfologicznych w celu zmniejszenia ryzyka związanego z celami terapeutycznymi zaangażowanymi w szlaki degeneracji lub regeneracji neurytów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zstandaryzowanych, wysokorozdzielczych odczytów wolumetrycznych, odpowiednich do miniaturyzacji testów i przesiewania związków w formatach mikroprzepływowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera gotowość testową poprzez precyzyjne, bezznakowe pomiary objętości, co redukuje zmienność w ocenach odpowiedzi na związki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych dla przebiegu choroby parametrów strukturalnych, które łączą wyniki in vitro z przedklinicznymi modelami uszkodzeń neuronów lub neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie dynamiki neurytów, wspierając decyzje o dalszym rozwoju w potokach przedklinicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając ilościowych punktów końcowych struktury, które pomagają w optymalizacji związków wiodących oraz zapewniają ciągłość badań przedklinicznych, szczególnie w przypadku związków modulujących morfologię neuronów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących integralności neurytów i dynamiki stożków wzrostu poprzez bezpośredni pomiar wolumetryczny struktur podkomórkowych.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów dzięki powtarzalnemu obrazowaniu objętościowemu całego pola z rozdzielczością submikrometryczną w celu oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników wolumetrycznych, które pozwalają na porównanie zmian strukturalnych indukowanych przez związki w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy obserwacje z wczesnych etapów odkrywania z istotnością przedkliniczną poprzez ilościowe określanie strukturalnych biomarkerów wzrostu i degeneracji neuronów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania mikrofluidycznego, którą można zastosować w wielu modelach neuronowych i klasach związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach strukturalnych neuronów na zaburzenia farmakologiczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki produkcji urządzeń mikroprzepływowych oraz procesom obrazowania kompatybilnym z epifluorescencją.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych, opartych na morfologii biomarkerów skuteczności związków i neurotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zweryfikowane efekty wpływające na objętość neurytów i dynamikę stożka wzrostu.
Kwestiez związane z implementacją
- Wymaga doświadczenia w zakresie wytwarzania mikrofluidyki, fotolitografii oraz technik wiązania powierzchniowego w celu montażu urządzenia.
- Zależy od dostępu do urządzeń do wyrównywania masek, systemów obróbki plazmowej oraz precyzyjnego sprzętu do dozowania cieczy podczas przygotowania chipa.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu komórek oraz protokołów obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania geometrii mikrofluidycznej i wzorowania powierzchni do różnych podtypów neuronów lub modeli chorobowych.
- Ograniczone przez konieczność dostępu do specjalistycznego pomieszczenia czystego (cleanroom) oraz wymagania techniczne w zakresie pracy z PDMS i integracji mikrofluidycznej, co może wpływać na szerokie zastosowanie metody.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Fabrication of PDMS Chip
1:51
Fabrication of Patterned Coverslips
3:13
Chip Assembling and Final Implementation
6:03
Neuron Culture and Imaging
7:14
Results: Calibration of Fluorescence eXclusion Method Using a Photoresist Stripe as the Object of Interest and Neuronal Structures Volume Imaging
8:17
Conclusion
