Name: Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę fluorescencji eXclusion do wysokorozdzielczego obrazowania objętościowego neuronów z submikrometryczną rozdzielczością osiową. Technika ta umożliwia analizę dynamiki neuritów i wzrostu komórek nerwowych w mikroprzepływowych układach PDMS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować ChiLab, Laboratorium Materiałów i Mikrosystemów - Politecnico di Torino - DISAT, w osobie Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza i Dr. S L Marasso, za ich cenne wsparcie w rozwoju procesu i produkcji urządzeń. Dziękujemy Victorowi Racine'owi z firmy Quantacell za dyskusję i wsparcie w przetwarzaniu obrazu. Jesteśmy wdzięczni Isabelle Grandjean i Manon Chartier z Animal Facility Instytutu Curie za ich wsparcie dla myszy, a także Pablo Vargasowi i Ana-Marii Lennon (Institut Curie) za dostarczenie nam myszy GFP LifeAct. Jesteśmy wdzięczni Olivierowi Thouveninowi z Institut Langevin i Clotilde Cadart, Larisie Venkovej i Matthieu Pielowi z Instytutu Curie - UMR 144 za ich pomoc w zrozumieniu metody fluorescencji eXclusion. Na koniec dziękujemy platformie technologicznej Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) za wsparcie w zakresie mikrofabrykacji. Prace te były częściowo wspierane przez Europejski Komitet ds. Badań Naukowych w ramach grantu Advanced Grant nr 321107 "CellO", PSL Université (projekt SwithNeuroTrails), ANR Investissement d'Avenir oraz IPGG Labex i Equipex.

<ol><li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+maintenance%3A+universal+strategy+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li>
<li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li>
<li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li>
<li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li>
<li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li>
<li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li>
<li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li>
<li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li>
<li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/3/6/065001/pdf">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001(2016).</li>
<li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931706000670">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li>
<li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li>
<li>abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html ">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html </a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Obrazowanie objętościowe neuronów stanowi wyzwanie dla techniki FXm ze względu na długie i cienkie przedłużenia tych komórek. Protokół ten opisuje warianty tego samego typu urządzenia mikroprzepływowego dedykowanego do obrazowania neuronów.
Oprócz aspektów konstrukcji mikroprzepływowej, wybór obiektywu ma fundamentalne znaczenie dla obrazowania z wykluczeniem fluorescencji i implikuje kompromis między rozdzielczością poprzeczną a wyrazistością obrazu. W badaniu 13 wykazano, że wysoki NA prowadzący do głębokości ostrości mniejszej niż wysokość komory nie był szkodliwy dla precyzji pomiaru objętości, jeśli obrazowanie było wykonywane w ognisku i jeśli pozostawiono wystarczający margines między konturem obiektu zainteresowania a granicami powierzchni całkowania. Jednak zastosowanie komory znacznie wyższej niż głębia ostrości pogarsza klarowność obrazu ze względu na dyfuzję fotonów, która wygładza krawędzie interesujących obiektów. Wykonanie komory o wysokości 3 μm zmniejszyło to boczne rozmycie i zapewniło wyjątkowo dobrze zdefiniowane obrazy wykluczające fluorescencyjne, nawet przy użyciu obiektywów o wysokim NA (0,8) 40X do wizualizacji gałęzi neuronalnych z wysoką rozdzielczością boczną.
Montaż wiórów jest krytycznym etapem, w szczególności w przypadku komór o wysokości 3 μm, ale ostrożna manipulacja, jak opisano w 4.1.2, pozwala uniknąć zawalenia się dachu. Wysoki stosunek powierzchni do objętości związany z tymi cienkimi komorami zrodził również kwestię stabilności stężenia dekstranu w czasie. Sprawdziliśmy, że absorpcja powierzchniowa dekstranu po jednej nocy inkubacji była znikoma: po zastąpieniu dekstranu przez PBS różnica intensywności między filarem a tłem wynosiła około 1 na 1000 początkowego kontrastu intensywności między tymi dwoma regionami w obecności dekstranu. Należy zauważyć, że neurony mogą przylegać zarówno do dolnego szkiełka nakrywkowego, jak i do dachu PDMS. Efekt ten znika w przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych (tj. gdy nie inkubujemy cząsteczek kleju w komorze PDMS), ponieważ powłoka jest więc ściśle zlokalizowana na dnie komory.
Oprócz trudnej morfologii, neurony są raczej przystosowane do FXm ze względu na fakt, że jedno z głównych ograniczeń metody, tj. endocytoza dekstranu, jest w tych komórkach bardzo ograniczona. Wybieramy preparat o stężeniu 10 kDa, aby w długim zakresie (godzinach) stłumić wszelkie widoczne zjawiska endocytozy.
Podsumowując, koncepcyjna prostota FXm jest równoważona przez zestaw problemów eksperymentalnych, które zostały rozwiązane przez niniejszy protokół, takich jak nanometryczna chropowatość PDMS i mikrometryczna wysokość komory, czy korekta tła w celu skorygowania nierówności sufitu PDMS między filarami. Jednak zastosowanie zamkniętej komory mikroprzepływowej do ograniczenia ośrodka fluorescencyjnego powoduje kilka konkretnych ograniczeń, takich jak potrzeba filarów wsporczych, które obniżają efektywną powierzchnię dostępną do adhezji komórek, lub konieczność wykluczenia somy z komory centralnej, aby obserwować rozszerzenia neuronów z najwyższą przejrzystością, co ogranicza obszary komórki dostępne do obserwacji w wysokiej rozdzielczości. Jedną z możliwych ewolucji tej metody byłoby pozbycie się tego fizycznego ograniczenia i zastąpienie go optymalnym. Nowe osiągnięcie w dziedzinie mikroskopii arkuszowej może być w przyszłości korzystnie połączone z FXm.

Dokładna wiedza na temat objętości komórkowej przyciągnęła w ostatnich latach coraz większą uwagę, napędzaną przez kwestię homeostazy wielkości komórek w mikroorganizmach jednokomórkowych 1 i bardziej ogólnie w komórkach mitotycznych 2. Jednak kwestia objętości komórki jest istotna również w przypadku komórek postmitotycznych, dla których neurony stanowią paradygmatyczny przykład.
Objętość jest rzeczywiście ważną sygnaturą fizjologicznych i patologicznych zdarzeń w różnych skalach i punktach czasowych życia neuronów, od przejściowej deformacji aksonalnej związanej z aktywnością elektryczną (skala milisekundowa) 3 do nieodwracalnego obrzęku neuronów występującego podczas bezobjawowej fazy chorób neurodegeneracyjnych (przez lata u ludzi) 4. Jednak największa zmiana objętości zachodzi w pośredniej skali czasowej dni lub tygodni (w zależności od rozpatrywanego organizmu) podczas wzrostu neuronów. Rozszerzona i złożona morfologia neuronów rodzi wiele problemów, wśród których znajduje się regulacja wielkości komórek. Długość i średnica aksonów są rzeczywiście ściśle regulowane in vivo, z wartościami specyficznymi dla każdego typu neuronu 5,6.
Te problemy, skomplikowane do rozwiązania in vivo, mogą być również rozwiązane w uproszczony sposób in vitro. W tym celu potrzebna jest metoda dedykowana do pomiaru objętości wystarczająco szybka, aby śledzić dynamikę wzrostu (tj. w skali minut) i kompatybilna z obserwacją przez godziny lub dni. Na przestrzeni lat opracowano kilka metod zapewniających bezpośredni lub pośredni dostęp do objętości komórek in vitro. Rekonstrukcja komórek na podstawie obrazowania konfokalnego jest jedną z nich, ale ta metoda zakłada znakowanie i wielokrotne eksponowanie światła, wykazując ograniczoną rozdzielczość osiową około 500 nm 7. Zauważ, że te dwie ostatnie wady zostały częściowo przezwyciężone przez bardziej wyrafinowaną i niedawną metodę zwaną mikroskopią świetlną w kratach 8. Mikroskopia sił atomowych była używana 9, ale ta metoda skanowania jest z zasady powolna i żmudna. Co więcej, fizyczny kontakt, którego wymaga z komórką, może zakłócać pomiar, biorąc pod uwagę ekstremalną miękkość neuronów 10. Metoda pośrednia wykorzystująca impedancję lub rezonans została zastosowana dla różnych typów komórek 11, ale jest niewystarczająca dla rozszerzonych komórek adhezyjnych, takich jak neurony.
Jedna z najbardziej obiecujących metod opiera się na pomiarze wykluczonej objętości komórek w zamkniętej komorze wypełnionej barwnikiem fluorescencyjnym. Metoda eXclusion fluorescencji (FXm) jest prosta w swojej zasadzie, ponieważ nie wymaga znakowania i nadaje się do szybkiego, długoterminowego obrazowania optycznego populacji komórek z potencjalnie suboptyczną rozdzielczością osiową. Dokładniej rzecz ujmując, rozdzielczość w z zależy od maksymalnego natężenia fluorescencji w komorze hodowlanej (tj. w obszarze pozbawionym komórek) podzielonego przez zakres dynamiczny kamery, chociaż kilka źródeł szumów ogranicza tę ostateczną rozdzielczość. Ta metoda okazała się bardzo skuteczna w śledzeniu objętości migrujących komórek przylegających 12 lub w badaniu zmiany objętości podczas mitozy komórek ssaków, jak dokładnie opisano w 13. Jednak neurony stanowią wyzwanie metodologiczne dla FXm, biorąc pod uwagę ich rozległe rozgałęzienia na procesy submikrometryczne.
Prezentujemy tutaj metodę prowadzącą do produkcji gładkich komór FXm, aby z dużą precyzją uzyskać dostęp do objętości i wysokości gałęzi neuronalnych oraz dynamicznych struktur zaangażowanych we wzrost neuronów, takich jak stożki wzrostu.
Komory powinny mieć podobne wysokości niż mierzony obiekt, aby zoptymalizować rozdzielczość osiową. W związku z tym zaprojektowaliśmy różne urządzenia FXm charakteryzujące się centralnymi komorami pomiarowymi o trzech różnych wysokościach. Najcieńsza z nich (3 μm wysokości) jest przeznaczona do pomiaru neurytów: ta niewielka wysokość nie obejmuje somy, która pozostaje w komorze pośredniej o wysokości blisko 15 μm. Grubsze komory centralne (10 i 12 μm) są wystarczająco wysokie, aby śledzić wzrost całej komórki. Urządzenie zawiera również dwa zbiorniki umieszczone po obu stronach centralnej komory. W ten sposób realizowane są cztery otwory iniekcyjne (IH), które są oznaczone w następujący sposób: wlot i wylot służą do wprowadzania zawiesin komórkowych do chipa, podczas gdy dwa pozostałe zasilają zbiorniki.
Najpierw wyprodukowaliśmy szkiełka nakrywkowe do kalibracji do pomiarów wysokości przy użyciu struktur fotorezystu o znanej geometrii. Następnie zobrazowaliśmy swobodnie rosnące neurony, ale także morfologicznie ograniczone neurony do mikrowzorców adhezji.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Do wykonania nakładki maski DRIE</td></tr><tr><td>MJB4</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 fotolitografia</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Nakładka maski</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Fotolitografia związana z DRIE</td></tr><tr><td>Oczyszczacz plazmowy</td><td>Diener Electronic</td><td>Okap do hodowli komórkowych Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADS Wirówka Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 37 & deg; C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe Inkubator</td><td></td>CO2</tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Piekarnik Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS między 65 a 80 stopni; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometr mechaniczny</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Profilometr optyczny</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Średnica 200 mm</td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli ultradźwiękowej</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Objętość wanny: 0,8 litra</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr><tr><td>Su8 Maska 1</td><td></td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr><tr><td>Su8 Maska 2</td><td>Dane uzupełniające</td>Su8 Maska 3 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr><tr><td>Kalibracja S1805 Paski</td><td></td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr><tr><td><mocny>Mały sprzęt laboratoryjny</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (odniesienie amerykańskie)</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel lub żyletka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-calowa płaska szpatułka ze stali nierdzewnej z łyżką</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Do wyjmowania z formy PDMS</td></tr><tr><td>Obsługa wafli górnej wargi</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zakrzywiona</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Kleszcze - Standard / Dumoxel</td><td>Do manipulowania szkiełkami nakrywkowymi</td></tr> <tr><td><mocny>Podłoża</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krzemowy wafel</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24x24 mm</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Photoresists i wywoływacze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 positive photoresist</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Przed procesem DRIE grubości 1,8 i mikro; m</td></tr><tr><td>AZ 351B deweloper</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Aby opracować dodatni fotorezystor AZ 1518</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA deweloper</td><td>Technic</td><td></td><td>Aby opracować negatywny fotorezystor SU-8</td></tr><tr><td>Microposit S1805 odporny</td><td>Chimie Usługi</td><td></td> techniczne <td>Dodatni fotorezystor używany do uzyskania 0,5&mikro; m wysokie konstrukcje</td></tr><tr><td>MF 26A deweloper</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Aby opracować dodatni fotorezystor S1805</td></tr> <tr><td>Laboratoryjne materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa plastikowa pipeta 3 ml</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Szalki Petriego</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma</td><td></td><td></td><td></td>klejąca</tr><tr><td>Chusteczki kwadratowe</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Folia parafinowa z tworzywa sztucznego</td></tr><tr><td><mocny>Chemikalia</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-metakrylooksypropylo)trichlorosilan</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS i utwardzacz Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poliornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>3-metakryloksyloksypropylo-trimetoksysilan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML(</td><td>C4H5O2)-(CH2)3-Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>kwas</td> <td>octowySigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F Dekstran</td><td></td></tr><tr><td>10kW sprzężony z Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absorpcja przy 488 nm</td></tr><tr><td>Dekstran 10kW sprzężony z Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absorpcja przy 647 nm</td></tr><tr><td>Culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200</td><td>mM LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal bez czerwieni fenolowej</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine w Matlabie do normalizacji tła</td><td>Quantacell</td><td>Skontaktuj się z Victorem Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Aby wybrać konkretny zwrot z inwestycji dla analiza obrazu</td></tr><tr><td>Rutynowa</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr><tr><td>Rutynowa</td><td>Matlab</td><td></td><td>Dane uzupełniające</td></tr></tbody></table>

wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji exclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech neuronów w różnych skalach czasowych. Neurony są dość wyjątkowymi komórkami pod względem ich rozszerzonych, rozgałęzionych morfologii, co w konsekwencji stwarza kilka wyzwań metodologicznych związanych z pomiarem objętości. W szczególnym przypadku wzrostu neuronów in vitro wybrana metodologia powinna obejmować submikrometryczną rozdzielczość osiową połączoną z obserwacją całego pola w skalach czasowych od minut do godzin lub dni. W przeciwieństwie do innych metod, takich jak rekonstrukcja kształtu komórki za pomocą obrazowania konfokalnego, pomiarów elektrycznych lub mikroskopii sił atomowych, niedawno opracowana metoda fluorescencji eXclusion (FXm) ma potencjał, aby sprostać tym wyzwaniom. Jednak, mimo że jest to proste w swojej zasadzie, implementacja FXm o wysokiej rozdzielczości dla neuronów wymaga wielu dostosowań i dedykowanej metodologii. Przedstawiamy tutaj metodę opartą na połączeniu wykluczenia fluorescencji, wielokompartmentowych urządzeń mikroprzepływowych o niskiej chropowatości i wreszcie mikrowzorcowania w celu uzyskania pomiarów in vitro lokalnej objętości neuronalnej. Wysoka rozdzielczość, jaką zapewnia urządzenie, pozwoliła nam zmierzyć lokalną objętość procesów neuronalnych (neurytów) oraz objętość niektórych specyficznych struktur biorących udział we wzroście neuronów, takich jak stożki wzrostu (GC).

Wynik procesu wytwarzania opisanego w sekcjach 1 i 2 został przedstawiony na obrazach na Rysunku 1A-1B oraz na krzywej na Rysunku 1C. Tabela na Rysunku 1D przedstawia wartości chropowatości dwóch różnych reprezentatywnych obszarów chipa PDMS, t.j. w części centralnej oraz w sąsiadującej komorze pośredniej o wysokości 20 µm. Dzięki zastosowaniu trawionego wafla Si zamiast fotorezystu SU-8 uzyskano zmniejszenie chropowatości około 7-krotnie. Następnie FXm zastosowano po raz pierwszy na pasku fotorezystu o znanej geometrii (Rysunek 2A) wewnątrz komory o wysokości 10 µm. Po przetworzeniu obrazu i konwersji intensywności na wysokość (patrz wykres na Rysunku 2B), profile FXm wykonane na przekrojach wzdłuż tego paska (Rysunek 2C) dostarczyły pożądanych profili wysokości (Rysunek 2D). Rysunek 2D przedstawia porównanie profili uzyskanych za pomocą profilometrii mechanicznej oraz metod FXm. Profile te, w tym wartości krawędzi i plateau, są bardzo podobne, co potwierdza poprawność metody. Należy zauważyć, że rozrzut danych FXm nie jest reprezentatywny dla ostatecznej rozdzielczości metody, co zostało ocenione dalej na Rysunku 3 i Rysunku 4, lecz wynika z zastosowania niskiej intensywności w celu uniknięcia możliwego efektu bardzo słabej autofluorescencji fotorezystu w kanale GFP.
Następnie zaobserwowano neuryty w komorach o wysokości 3 µm i 10 µm (Rysunek 3). Odchylenie standardowe szumu tła wynosi około 18 nm po konwersji intensywności na wysokość i korekcji tła. Wartość ta jest nieco wyższa niż fizyczna chropowatość powierzchni PDMS odlewanych na powierzchniach krzemowych (12 nm, patrz tabela na Rysunku 1D), lecz znacznie niższa niż chropowatość mierzona dla PDMS otrzymywanego z form SU-8. Wyniki te podkreślają wartość dodaną wiercenia otworów w waflach krzemowych w porównaniu z wycinaniem otworów w fotorezyście SU-8 w celu odlewania filarów. Tak niska wartość pozwala na uzyskanie wysokiego stosunku sygnału do szumu i bardzo wyraźnych obrazów wolumetrycznych, takich jak ten przedstawiony na Rysunku 3A. Jako przykład danych, jakie można uzyskać z takich obrazów, obliczono objętość przekroju neurytu o szerokości 1,6 µm (tj. 10 pikseli) (patrz wykres na Rysunku 3B). Zastosowanie w pierwszym przybliżeniu dopasowania liniowego tych danych daje średnią wartość wysokości neurytu wynoszącą około 400 nm, co można porównać np. z 500-nm średnicą aksonu stwierdzoną w cielemowskim u 10-dniowych szczeniąt 5. Połączono również FXm z mikrowzorami adhezji składającymi się z szeregowo przylegających pasów o szerokości 2 µm i 6 µm i długości 30 µm. Celem było zbadanie wpływu szerokości neurytu na jego kształt 3D. Rysunek 3C przedstawia w fałszywych kolorach reprezentację 3D obrazu całego neuronu uzyskanego w komorze o wysokości 10 µm. Neuryty rozprzestrzeniają się na pasach o szerokości 2 µm i 6 µm, podczas gdy soma znajduje się na końcu najszerszego pasa. Profile wysokości wykreślono w trzech różnych przekrojach poprzecznych. Zgodnie z wykresem przedstawionym na Rysunku 3A, powierzchnia zintegrowana w przekrojach poprzecznych rośnie wraz z szerokością neurytu (Rysunek 3D).
Skupiliśmy się również na strukturach 3D stożków wzrostu (GC). Rysunek 4A-B przedstawia dwa różne profile GC uzyskane w komorze o wysokości 3 µm, które uwydatniają ich rozgałęzioną podstrukturę. Ponadto przeprowadziliśmy eksperymenty time-lapse, aby śledzić dynamikę objętości GC w komorze o wysokości 12 µm. Rysunek 4C przedstawia cykl kurczenia się i reaktywacji danego GC w skali czasowej kilku dziesiątek minut. Dzięki zastosowaniu myszy GFP-lifeact, stożki wzrostu zlokalizowano w długości fali emisji GFP (510 nm) ze względu na ich wysokie stężenie aktyny. Powierzchnia zidentyfikowana przy tej długości fali została wykorzystana do całkowania w długości fali emisji dekstranu 647 nm w celu obliczenia objętości GC. Rysunek 4D pokazuje końcowo rozkład objętości GC w różnych punktach czasowych i lokalizacjach na trzech różnych neuronach, z wartością centralną wynoszącą około 6 µm3.
<img alt="Wytwarzanie chipa mikrofluidycznego; litografia PDMS; wykres profilu wysokości; analiza powierzchni 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Komory FXm PDMS. (A) Schematy czterech różnych głównych etapów mikrowytwarzania prowadzących do końcowej formy. Oznaczono położenie wlotu, wylotu i zbiorników. Paski skali: 1 mm. (B) Obraz komory FXm PDMS uzyskany za pomocą profilometru optycznego. Obraz ten przedstawia komorę centralną zawierającą 3 rzędy filarów o wysokości 10 µm oraz komory pośrednie o wysokości 20, 50 i 90 µm. Pasek skali: 500 µm. (C) Przekrój poprzeczny chipa wzdłuż dwóch przerywanych linii narysowanych na (B). Żółty/złoty: przekrój wzdłuż filarów, niebieski: przekrój pomiędzy filarami. (D) Średnie wartości chropowatości PDMS mierzonej na obszarach 50 × 50 µm2 uformowanych na krzemie oraz na komorze pośredniej SU-8 o wysokości 20 µm (patrz strzałki wskazujące położenie tych obszarów). Wartości średnie uzyskano z pomiarów trzech różnych obszarów. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopii optycznej z wykresami intensywności i wysokości do profilowania powierzchni i dopasowania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kalibracja metody FXm z wykorzystaniem paska fotorezystu jako obiektu analizy. (A) Obraz fluorescencji GFP wykonany w komorze o wysokości 10 µm wypełnionej dekstranem 10 000 MW absorbującym przy 488 nm w stężeniu 1 mg/mL. (B: tło, P: filar). Obserwacja przy użyciu suchego obiektywu 40X NA 0,8. Pasek skali: 50 µm. (B) Liniowa zależność kalibracyjna uzyskana ze średniej intensywności dwóch kolorowych prostokątów pokazanych na (A). (C) Profil intensywności fluorescencji uzyskany na poziomie niebieskiej przerywanej linii przedstawionej w (A), przecinającej pasek fotorezystu (dodatni fotorezyst o wysokości 0,45 µm). (D) Porównanie profili uzyskanych za pomocą profilometru mechanicznego (czarne kropki) oraz FXm po konwersji intensywności na wysokość na podstawie danych z (B) (niebieskie kropki). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii z strukturami komórkowymi, wykresem analizy danych, wykresem 3D i korelacją objętości i szerokości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie objętości neurytów. (A) Neuryt wnikający do centralnej komory o wysokości 3 µm z somy znajdującej się w sąsiedniej komorze pośredniej o wysokości 15 µm. Obrazowanie wykonano przy użyciu dekstranu 10 000 MW absorbującego przy 488 nm oraz obiektywu suchego 40X, NA 0,8. Wstawka uzyskana po zastosowaniu procedury redukcji tła wyróżnia dwa neuryty i została wybrana do wykreślenia wykresu po prawej stronie. Paski skali: 30 µm. (B) Objętość przekroju neurytu jako funkcja szerokości neurytu uzyskana z 22 profilów (średnia z 10 pikseli, t.j. z „przekroju neurytu” o szerokości 1,6 µm) przedstawionych w (A). Linia ciągła reprezentuje dopasowanie liniowe o nachyleniu 0,4 µm przechodzące przez początek układu współrzędnych. (C) Obraz w fałszywych kolorach ustrukturyzowanego neuronu na pasku adhezyjnym składającym się z następujących po sobie wypustek o szerokości 2 µm i 6 µm (przedstawionych na biało). Pomiary wykonano w komorze o wysokości 10 µm wypełnionej dekstranem 10 000 MW absorbującym przy 647 nm, używając obiektywu suchego 40x NA 0,8. (D) Profile wysokości odpowiadające kolorowym liniom przerywanym pokazanym w (C), z zachowaniem tego samego kodu kolorystycznego. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza graficzna morfologii neurytów; obrazy mikroskopowe, wykresy wysokości w funkcji odległości, objętość stożka wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Statyczne i dynamiczne obrazowanie stożka wzrostu. (A-B) Profile wysokości stożka wzrostu uzyskane w komorze o wysokości 3 µm po konwersji intensywności na wysokość wzdłuż żółtych linii zaznaczonych na powiązanych obrazach. Obserwacje przeprowadzono z użyciem wypełnienia z dekstranem 10 000 MW absorbującym przy 488 nm oraz suchego obiektywu 40X, NA 0,8. (C) Obrazowanie całego neuronu w komorze o wysokości 12 µm wypełnionej dekstranem 10 000 MW absorbującym przy 647 nm. Obserwacje wykonano w dwóch kanałach fluorescencyjnych: GFP do lokalizacji stożka wzrostu (żółte linie przerywane) oraz CY5 do obliczenia objętości stożka wzrostu na podstawie wykluczenia fluorescencji. Powierzchnia ograniczona żółtymi liniami przerywanymi została wykorzystana do obliczenia objętości stożka wzrostu. Wykres przedstawia zmianę objętości stożka wzrostu w czasie oraz powiązane morfologie w kanałach GFP i CY5 w dwóch reprezentatywnych punktach czasowych. Wszystkie dane pozyskano za pomocą suchego obiektywu 40x NA 0,8 co 3 min. Paski skali: 10 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krok</td>
			<td >Maska 1: warstwa 8 µm</td>
			<td >Maska 2: warstwa 30 µm</td>
			<td >Maska 3: warstwa 40 µm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Typ SU-8</td>
			<td >2007</td>
			<td >2025</td>
			<td >2050</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Spincoating</td>
			<td >30 s @ 2000 rpm</td>
			<td >30 s @ 3050 rpm</td>
			<td >30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wstępne wygrzewanie (soft bake)</td>
			<td >3 min @ 95 °C</td>
			<td >2 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C</td>
			<td >3 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Energia naświetlania</td>
			<td >110 mJ/cm2</td>
			<td >155 mJ/cm2</td>
			<td >170 mJ/cm2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wygrzewanie po naświetlaniu (post-exposure bake)</td>
			<td >4 min @ 95 °C</td>
			<td >1 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C</td>
			<td >2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wywoływanie</td>
			<td >2 min 30 s</td>
			<td >5 min</td>
			<td >6 min</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Utwardzanie końcowe (hard bake, opcjonalnie)</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Kroki fotolitografii wykonane w celu zbudowania urządzenia zawierającego komorę centralną o wysokości 12 μm. Wysokości komór pośrednich: 20, 50 i 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Maska 1:10 µm warstwa</td>
			<td>Maska 2:30 µm warstwa</td>
			<td>Maska 3:40 µm warstwa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>typ SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naniesienie warstwy metodą spin-coatingu</td>
			<td>30 s przy 1500 obr./min</td>
			<td>30 s przy 3050 obr./min</td>
			<td>30 s przy 3250 obr./min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstępne wygrzewanie</td>
			<td>3 min @ 95 °C</td>
			<td>2 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C</td>
			<td>3 min w temp. 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Energia ekspozycji</td>
			<td>125 mJ/cm²2</td>
			<td>155 mJ/cm²2</td>
			<td>170 mJ/cm²2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wygrzewanie po naświetlaniu</td>
			<td>4 min @ 95 °C</td>
			<td>1 min @ 65 °C + 6 min @ 95 °C</td>
			<td>2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozwój</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wypiekanie utwardzające (opcjonalnie)</td>
			<td>3-5 min w temperaturze 200 °C</td>
			<td>3–5 min w temp. 200 °C</td>
			<td>3–5 min w temp. 200 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Kroki fotolitografii wykonane w celu zbudowania urządzenia zawierającego komorę centralną o wysokości 10 μm. Wysokości komór pośrednich: 20, 50 i 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krok</td>
			<td >Maska 1: warstwa 12 µm</td>
			<td >Maska 2: warstwa 32 µm</td>
			<td >Maska 3: warstwa 40 µm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Typ SU-8</td>
			<td >2015</td>
			<td >2025</td>
			<td >2050</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Spincoating</td>
			<td >30 s @ 3250 rpm</td>
			<td >30 s @ 2500 rpm</td>
			<td >30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wstępne wygrzewanie (soft bake)</td>
			<td >3 min @ 95 °C</td>
			<td >2 min @ 65 °C + 5 min @ 95 °C</td>
			<td >3 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas naświetlania</td>
			<td >140 mJ/cm2</td>
			<td >157 mJ/cm2</td>
			<td >170 mJ/cm2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wygrzewanie po naświetlaniu (PEB)</td>
			<td >4 min @ 95 °C</td>
			<td >1 min @ 65 °C + 5 min @ 95 °C</td>
			<td >2 min @ 65 °C + 7 min @ 95 °C</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wywoływanie</td>
			<td >3 min</td>
			<td >5 min</td>
			<td >6 min</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Utwardzanie (hard bake, opcjonalnie)</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
			<td >3-5 min @ 200 °C</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Etapy fotolitografii przeprowadzone w celu zbudowania urządzenia zawierającego komorę centralną o wysokości 3 μm. Wysokości komór pośrednich: 18, 50 i 90 µm.
Dane uzupełniające 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematyczny widok masek użytych do wykonania urządzenia z PDMS (maska DRIE oraz maski 1-3). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dane uzupełniające 2: plik „masks_neuron_volume_chips.dxf”. Pliki elektroniczne umożliwiające wykonanie maski DRIE oraz masek 1-3. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dane uzupełniające 3: „Mask_Photoresist-stripes.dxf”. Pliki elektroniczne umożliwiające wykonanie maski użytej do fotolitografii pasków fotorezystu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dane uzupełniające 4: plik conversion_mattotiff.m <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dane uzupełniające 5: plik importfilevol.m <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech komórek. Opisujemy metodę wykluczenia fluorescencyjnego pozwalającą na pomiar objętości neuronów in vitro w pełnym polu z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów i dynamicznych struktur implikowanych we wzroście neuronów.

Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie pełnego pomiaru objętości neuronów in vitro z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów w dynamicznych strukturach implikowanych we wzroście neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii komórkowej dotyczące dynamiki zmian objętości w skali subsydidalnej podczas niewzrostu lub zwyrodnienia aksonów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia submikrometryczną rozdzielczość osiową w połączeniu z obserwacją w pełnym dopasowaniu i skalą czasu do godzin lub dni.Aby rozpocząć procedurę, wyjmij blok PDMS pod kapturem chemicznym, wylewając na niego izopropanol. Następnie umieść go na ławce ze stali nierdzewnej okapu. Przetnij wokół silikonowego wafla i wyjmij replikę PDMS z formy.Następnie przetnij wokół wióra i pozostaw dwumilimetrowy margines za pomocą skalpela lub żyletki. Przebij wlot, mocno naciskając dziurkacz o średnicy 1.5 milimetra i uruchom go, aby wyciąć i wyrzeźbić otwór wlotu. Zrób to samo w czterech dedykowanych strefach chipa, w których zostanie wstrzyknięta ciecz.Następnie wyczyść chip, przyklejając i odklejając taśmę klejącą po stronie mikrostrukturalnej. Posyp izopropanolem z obu stron. Następnie wysusz wiór azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem.W tej procedurze umieść każde szkiełko nakrywkowe na wirówce znajdującej się w pomieszczeniu czystym. Nałóż kroplę dodatniego fotorezystu, aby pokryć około 75% szkiełka nakrywkowego i wirować z prędkością 4000 obr./min przez 30 sekund, aby osiągnąć ostateczną grubość 0,45 mikrometra. Umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzejnej o temperaturze powierzchni 115 stopni Celsjusza na jedną minutę.Za pomocą wyrównywacza maski naświetl każde szkiełko nakrywkowe na długości fali 435 nanometrów przez dedykowaną maskę zgodnie z parametrami producenta. Następnie przygotuj dwie szklane naczynia krystalizujące, jedno zawierające wywoływacz bez rozcieńczenia, drugie zawierające wodę dejonizowaną. Zanurzaj szkiełka nakrywkowe jeden po drugim w wywoływaczu na jedną minutę, ciągle i delikatnie mieszając naczynie krystalizujące.Następnie zanurz wafel w wodzie dejonizowanej na około pięć sekund. Przenieś wafel na chłonny papier i wysusz go azotem pod ciśnieniem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania powietrzem. Umieść zarówno chip PDMS, jak i szklane naczynie, na którym zostanie on połączony, w komorze plazmowej w celu aktywacji powierzchniowej.Następnie nanieś kroplę wody na prostokątne szkiełko mikroskopowe o dużej grubości i przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka kapilarnego. Pod mikroskopem zaznacz położenie pasków fotorezystu z tyłu szkiełka. Umieść wzorzyste szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie maski nakładki do maski.Polegaj na znaku wykonanym w celu wyśrodkowania obiektów odniesienia fotorezystu. Aby zwiększyć kontrast optyczny, umieść płytkę krzemową pod chipem PDMS. Płytka silikonowa powinna pozostać mocno przymocowana do uchwytu podczas procesu wyrównywania.Następnie umieść chip PDMS na ruchomym uchwycie podłoża nakładki maski. Następnie podnieś uchwyt na tyle, aby uwidocznić zarówno wiór, jak i układ pasków fotorezystu znajdujących się na szkiełku nakrywkowym, pozostając za stykiem mechanicznym. Wykonaj wyrównanie i uzyskaj kontakt mechaniczny między chipem a szkiełkiem nakrywkowym, podnosząc uchwyt, aż powierzchnia słupków PDMS dotknie szklanego szkiełka nakrywkowego.Następnie opuść uchwyt. Usuń szkiełko nakrywkowe przyklejone do chipa z uchwytu maski. Następnie umieść urządzenie na 35-milimetrowej szalce Petriego i przenieś wszystko do piekarnika na pięć do dziesięciu minut, aby zwiększyć siłę wiązania.Trzydzieści minut po klejeniu umieść na wlocie dziesięciolitrową końcówkę pipety wypełnioną roztworem PLO. Następnie załaduj płyn, aż utworzy się kropla na wierzchu. Powtórz tę samą operację na wylocie i zbiornikach.Następnie dodaj PBS na szalce Petriego dookoła chipa. Uszczelnić szalkę Petriego folią parafinową i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć godzin. Następnie lekko wciśnij stożek końcówki o pojemności dziesięciu mikrolitrów w każdy otwór iniekcyjny i zassaj nadmiar płynu.Następnie zastąp PLO, a także PBS otaczający chip pożywką hodowlaną. Następnie umieść chip w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż neurony wysieją się z co najmniej pięciogodzinnym czasem inkubacji. W tej procedurze należy pobrać pożywkę hodowlaną z chipa.Zebrać dwa do trzech mikrolitrów świeżo zawieszonego roztworu komórkowego i wstrzyknąć go na wlocie. Natychmiast powtórz tę samą operację na wylocie. Wstrzyknąć mniej więcej taką samą objętość pożywki hodowlanej do każdego zbiornika.Szybko obserwuj chip pod mikroskopem, aby sprawdzić gęstość komórek. Rząd wielkości optymalnej gęstości komórek odpowiada około pięciu do dziesięciu komórek na kwadratowej powierzchni ograniczonej czterema filarami. Powtórz procedurę wstrzykiwania 0,5 do 1 mikrolitra zawiesiny komórek, aby osiągnąć docelową gęstość komórek.W przypadku obrazowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką obrazową. Następnie umieść chip pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Pozyskiwanie obrazów komórek z jednego lub wielu kolejnych obrazów w przypadku eksperymentów poklatkowych.Pokazano tutaj reprezentatywne obserwacje kalibracyjnego paska fotorezystu i neuronów. Obrazy i przekroje tych obiektów w większym powiększeniu są wyświetlane po prawej stronie. Pokazano tu reprezentatywne neuryty i centralną komorę o wysokości trzech mikrometrów.Objętość wycinka neurytu można obliczyć w funkcji szerokości neurytu. A oto reprezentatywne stożki wzrostu i centralna komora o wysokości trzech mikrometrów. Ich podstruktury wyłaniają się wyraźnie z optycznego szumu tła o długości około 20 nanometrów.Obserwacje poklatkowe życia działają neurony umieszczone w komorze o wysokości 12 mikrometrów, aby śledzić cykl kurczenia się i reaktywacji stożka wzrostu w skali czasowej kilkudziesięciu minut. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby mieć dostęp do sprzętu do głębokiego trawienia jonowego w celu wytworzenia błota krzemowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrównać szkiełko nakrywkowe ze szkła strukturalnego z chipem PDMS.Po opanowaniu technika ta może być odtwarzalnie stosowana do kwantyfikacji neurologii w 3D. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie farmakologii do zbadania wpływu różnych leków o rzeczywistym kalibrze, a wszystko to w kształcie zamkniętego stożka. Nie zapominaj, że praca z neuronami pierwotnymi wymaga dużej ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia i rozbicia.Zawsze należy zachować delikatność i szybkość przy wymianie pożywki, aby ograniczyć czas spędzany na zewnątrz inkubatora.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mikroskopii do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz trójwymiarową rekonstrukcję mysiego układu nerwowo-naczyniowego i bariery krew-mózg za pomocą swobodnie pływających odcinków mózgu. Metoda ta pozwala na wizualizację, analizę i kwantyfikację organelli wewnątrzkomórkowych w BBB.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Poznaj metodę fluorescencji eXclusion do wysokorozdzielczego obrazowania objętościowego neuronów z submikrometryczną rozdzielczością osiową. Technika ta umożliwia analizę dynamiki neuritów i wzrostu komórek nerwowych w mikroprzepływowych układach PDMS.

Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal

Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów