Name: Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny. Ta metoda oferuje prostotę protokołu i wysokie wydajności, znajdując zastosowanie w syntezie organicznej oraz terapii farmaceutycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Véronique de Berardinis za owocną dyskusję oraz Alainowi Perretowi, Christine Pellé i Peggy Sirvain za wsparcie techniczne.

1. Przygotowanie enzymatyczne
<ol>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie białek zgodnie z wcześniejszym opisem26. 
	UWAGA: Otrzymano białka rekombinowane o następujących stężeniach końcowych: αKAO z Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; αKAO z C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/ml; PLP-DC z S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), bezkomórkowy ekstrakt z całkowitym enzymem w stężeniu 12,44 mg/ml; PLP-DC z C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Wszystkie poniższe roztwory są przygotowywane w wodzie dejonizowanej.
<ol>
	<li>Przygotować 1 M buforu HEPES o pH 7,5; wyregulować 5 M NaOH. 
	UWAGA: Na etapie regulacji pH należy nosić rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy (P280). W przypadku kontaktu z oczami (P305, P351, P338) ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Jeśli to możliwe, należy zdjąć soczewki kontaktowe. Kontynuować płukanie i natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem (P310). Kod P odnosi się do zwrotu wskazującego środki ostrożności (klasa i kategoria zagrożenia; zob. np. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Przygotuj 100 mM L-lizyny, 100 mM (5S)-hydroksy-L-lizyny, 150 mM kwasu α-ketoglutarowego, 100 mM askorbinianu sodu, 10 mM sześciowodnego siarczanu żelaza(II) amonu (sól Mohra), 100 mM 5-fosforanu pirydoksalu (PLP) i 100 mM ditiotreitolu (DTT).</li>
	<li>Przygotować 1 M, 2 M i 6 M kwasu solnego (HCl) z 37% roztworu HCl (około 12 M roztworu), postępując zgodnie z tymi samymi instrukcjami bezpieczeństwa, jak te opisane w 2.1. 
	UWAGA: Roztwory kwasu α-ketoglutarowego, askorbinianu sodu i sześciowodnego siarczanu żelaza(II) amonu muszą być świeże w dniu użycia. Roztwór lizyny można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej. Roztwór PLP może być przechowywany przez miesiąc w temperaturze 4 °C. Roztwór naziemnej telewizji cyfrowej można przechowywać przez miesiąc w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Reakcje na skalę analityczną
<ol>
	<li>Opracowanie metody reakcji dekarboksylacji (5R)-hydroksy-L-lizyny
	<ol>
		<li>Dodać 11 μl 1 M roztworu buforu HEPES o pH 7,5 (stężenie końcowe 50 mM) do mikroprobówki o pojemności 2 ml. Następnie dodaj 22 μl 100 mM (5S)-hydroksy-L-lizyny (stężenie końcowe 10 mM), 2,2 μl 100 mM PLP (stężenie końcowe 1 mM) i 2,2 μl 100 mM DTT (stężenie końcowe 1 mM). 
		UWAGA: W przypadku reakcji z LDCSrum dodanie DTT nie jest konieczne.</li>
		<li>Dodać oczyszczony PLP-DC (stężenie końcowe 0,1 mg/ml). W komplecie zH2O, aby uzyskać końcową objętość 220 μL.</li>
		<li>Wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu, z prędkością 300 obr./min przez 3 godziny 
		UWAGA: Potrząsanie mieszaniną reakcyjną z otwartą pokrywą na wolnym powietrzu zapewnia dobre natlenienie pożywki reakcyjnej. Nie jest zatem konieczne pęcherzykowanie tlenu w pożywce reakcyjnej.</li>
		<li>Zebrać 10 μl mieszaniny reakcyjnej, która ma być poddana analizie zgodnie z procedurą monitorowania reakcji opisaną w kroku 6. Próbki są korzystnie derywatyzowane i analizowane bezpośrednio po pobraniu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie metody enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej jeden etap hydroksylacji katalizowany przez αKAO z dekarboksylacją katalizowaną przez PLP-DC
	<ol>
		<li>Dodać 11 μl z 1 M buforu HEPES o pH 7,5 (końcowe stężenie 50 mM) do mikroprobówki o pojemności 2 ml. Następnie dodać 22 μl ze 150 mM kwasu α-ketoglutarowego (stężenie końcowe 15 mM), 5,5 μl ze 100 mM askorbinianu sodu (stężenie końcowe 2,5 mM), 22 μl 10 mM soli Mohra (stężenie końcowe 1 mM) i 22 μl 100 mM L-lizyny (stężenie końcowe 10 mM).</li>
		<li>UzupełnićH2Odla końcowej objętości 220 μl, biorąc pod uwagę objętość roztworu enzymu, który ma być dodany w kroku 3.2.3.</li>
		<li>Dodać wymagany oczyszczony enzym αKAO zgodnie z docelową regioselektywnością: KDO1 dla hydroksylacji w pozycji C-3 lub KDO2 dla pozycji C-4 L-lizyny. Końcowe stężenie oczyszczonego enzymu (0,05-0,5 mg/ml) określono w taki sposób, aby umożliwić pełną konwersję w ciągu około 3 godzin.</li>
		<li>Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu, z prędkością 300 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 2,2 μl ze 100 mM PLP (stężenie końcowe ~ 1 mM) i 2,2 μl ze 100 mM DTT (stężenie końcowe ~ 1 mM). 
		UWAGA: W przypadku reakcji z LDCSrum dodanie DTT nie jest konieczne.</li>
		<li>Dodać oczyszczony PLP-DC o stężeniu umożliwiającym całkowitą konwersję w ciągu 18 godzin: LDCSrum o przybliżonym stężeniu końcowym 0,1 mg/ml dla reakcji kaskadowej z KDO1 i DCCpin o przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg/ml dla reakcji kaskadowej z KDO2.</li>
		<li>Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu z prędkością 300 obr./min przez 18 godzin.</li>
		<li>Uruchom procedurę monitorowania, jak w kroku 3.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie metody enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej dwa etapy hydroksylacji katalizowane przez αKAO z dekarboksylacją katalizowaną przez PLP-DC
	<ol>
		<li>Uruchom kroki 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Dodać KDO1 w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml. Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu, z prędkością 300 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać KDO2 w przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg/ml, obliczonym na podstawie początkowej objętości reakcji. Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu, z prędkością 300 obr./min przez 18 godzin.</li>
		<li>Uruchom krok 3.2.5.</li>
		<li>Dodać oczyszczony Cpin PLP-DCDC o przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg/ml, obliczonym na podstawie początkowej objętości reakcji. Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z otwartą pokrywką na wolnym powietrzu, z prędkością 300 obr./min przez 18 godzin.</li>
		<li>Uruchom procedurę monitorowania jak w kroku 3.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Półpreparatywna jednogarnkowa reakcja biokatalityczna
UWAGA: Reakcje enzymatyczne przeprowadza się na 0,1 mmol L-lizyny w szklanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml na wolnym powietrzu o całkowitej objętości 10 ml.
<ol>
	<li>Synteza pochodnych monohydroksylowanych
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 ml 1 M buforu HEPES o pH 7,5 (końcowe stężenie 50 mM) do kolby. Następnie dodaj 1 ml 100 mM L-lizyny (końcowe stężenie 10 mM), 1 ml 150 mM kwasu α-ketoglutarowego (końcowe stężenie 15 mM), 0,25 ml 100 mM askorbinianu sodu (końcowe stężenie 2,5 mM) i 1 ml 10 mM soli Mohra (końcowe stężenie 1 mM).</li>
		<li>UzupełnićH2Odla końcowej objętości 10 ml, biorąc pod uwagę objętość roztworu enzymu, który ma być dodany w kroku 4.1.3.</li>
		<li>Dodać wymagany oczyszczony enzym αKAO zgodnie z docelową regioselektywnością: KDO1 o końcowym stężeniu 0,075 mg/ml do hydroksylacji w pozycji C-3 lub KDO2 do końcowego stężenia 0,5 mg/ml dla pozycji C-4 L-lizyny. Końcowe stężenie oczyszczonego enzymu określono w taki sposób, aby umożliwić całkowitą konwersję w ciągu około 3 godzin.</li>
		<li>Wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej z prędkością 300 obr./min przez odpowiedni czas. Gdy monitorowanie reakcji wykaże zakończoną reakcję hydroksylacji (należy wykonać wszystkie kroki opisane w kroku 6 protokołu monitorowania reakcji), przejdź do kroku 4.1.5. Typowy czas reakcji to 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μL 100 mM PLP do mieszaniny reakcyjnej αKAO (stężenie końcowe ~ 1 mM). Następnie dodaj 100 μl ze 100 mM DTT (stężenie końcowe ~ 1 mM), z wyjątkiem przypadku stosowania LDCSrum.</li>
		<li>Dodać oczyszczony PLP-DC:LDC Srum o przybliżonym stężeniu końcowym 0,05 mg/ml dla reakcji kaskadowej z KDO1 lub DCCpin przy przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg/ml dla reakcji kaskadowej z KDO2.</li>
		<li>Potrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, 300 obr./min, przez 18 godzin i przejść bezpośrednio do kroków opisanych w kroku 4.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza pochodnej dihydroksylowanej
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 ml 1 M buforu HEPES o pH 7,5 (stężenie końcowe 50 mM), 1 ml 100 mM L-lizyny (stężenie końcowe 10 mM), 1 ml 150 mM kwasu α-ketoglutarowego (stężenie końcowe 15 mM), 0,25 ml 100 mM askorbinianu sodu (stężenie końcowe 2,5 mM) i 1 ml 10 mM soli Mohra (stężenie końcowe 1 mM). UzupełnićH2Odla końcowej objętości 10 ml, biorąc pod uwagę objętość roztworu enzymu, który ma być dodany w kroku 4.2.2.</li>
		<li>Dodać KDO1 do końcowego stężenia 0,075 mg/ml. Wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej, z prędkością 300 obr./min przez odpowiedni czas.</li>
		<li>Gdy monitorowanie reakcji wskazuje na zakończoną reakcję hydroksylacji (zob. krok 6 w celu zapoznania się z protokołem monitorowania reakcji), przejdź do kroku 4.2.5. Typowy czas reakcji to 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 1 ml 150 mM kwasu α-ketoglutarowego (końcowe stężenie 15 mM), 0,25 ml 100 mM askorbinianu sodu (końcowe stężenie 2,5 mM) i 1 ml 10 mM soli Mohra (końcowe stężenie 1 mM).</li>
		<li>Dodać KDO2 do przybliżonego stężenia końcowego 0,5 mg/ml, obliczonego na podstawie początkowej objętości reakcji. Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej przy 300 obr./min przez 18 godzin.</li>
		<li>Gdy monitorowanie reakcji wskazuje na zakończoną reakcję dihydroksylacji (patrz krok 6 w celu zapoznania się z protokołem monitorowania reakcji), należy przejść do kroku 4.2.7. Typowy czas reakcji to 18 godzin.</li>
		<li>Dodać 100 μl ze 100 mM naziemnej telewizji cyfrowej (stężenie końcowe ~ 1 mM), z wyjątkiem korzystania z LDCSrum.</li>
		<li>Dodać oczyszczony DCCpin o przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg/ml, obliczonym na podstawie początkowej objętości reakcji.</li>
		<li>Wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej przy 300 obr./min przez 18 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hartowanie
	<ol>
		<li>Schłodzić mieszaninę reakcyjną, umieszczając szklaną kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml w łaźni lodowej.</li>
		<li>Dodać ostrożnie, przez około 1 minutę, 0,25 ml 6 M HCl, ręcznie delikatnie wstrząsając schłodzoną mieszaniną reakcyjną. Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami bezpieczeństwa, co opisane w kroku 2.1.</li>
		<li>Przenieść kwaśną mieszaninę do probówki wirówkowej o stożkowym dnie o pojemności 50 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura wyposażonej w bańkę, a następnie odwirować w temperaturze 1,680 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Pobrać supernatant i umieścić w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml.</li>
		<li>Dodaj 10 ml wody dejonizowanej do probówki wirówki ze stożkowym dnem zawierającej osad. Wir, aby ponownie zawiesić pellet.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 1 680 x g, 4 °C, przez 15 min.</li>
		<li>Pobrać supernatant i dodać go do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml zawierającej pierwszy supernatant (krok 4.3.4).</li>
		<li>Zebrane supernatanty należy zamrozić przez zanurzenie kolby w ciekłym azocie przy ciągłym ręcznym obracaniu, a następnie natychmiast przenieść kolbę do liofilizatora laboratoryjnego, aby zapobiec rozmrażaniu materiału.</li>
		<li>Po zakończeniu procesu liofilizacji (przez noc) wyjąć kolbę z liofilizatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oczyszczanie aminoalkoholi z surowej mieszaniny reakcji enzymatycznych
<ol>
	<li>Żywica jonowymienna
	<ol>
		<li>Rozpuścić liofilizowany produkt w minimalnej ilości wodnego 0,1 M HCl (około 4 ml) do momentu, gdy cząstki stałe przestaną być widoczne gołym okiem.</li>
		<li>Kondycjonować żywicę kationitową grupy funkcyjnej kwasu sulfonowego, 200-400 mesh, w szklanej kolumnie (20 x 250 mm) przez elucję pod ciśnieniem atmosferycznym 1M HCl (4 objętości kolumny), a następnie 0,1 M HCl (4 objętości kolumn; objętość kolumny = 10 ml).</li>
		<li>Ostrożnie załadować próbkę na wierzch żywicy na ścianki szklanej kolumny za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl. Następnie przepłukać probówkę wirówkową ze stożkowym dnem, w której znajdował się produkt surowy, trzykrotnie 1 ml 0,1 M wodnego roztworu HCl na jedno przemycie i w ten sam sposób załadować powstałe objętości płukania do kolumny.</li>
		<li>Elute o nieliniowym gradiencie: 4 objętości kolumn 0,1 M HCl, 4 objętości kolumn wody, 4 objętości kolumn 5% NH4OH, 4 objętości kolumn 10% NH4OH, 4 objętości kolumn 15% NH4OH, 4 objętości kolumn 20% NH4OH, 4 objętości kolumn 25% NH4OH i wreszcie 4 objętości kolumn 28% NH4OH.</li>
		<li>Monitorować oczyszczanie za pomocą HPLC (patrz krok 6).</li>
		<li>Zebrać frakcje zawierające ten związek (NH4OH 20-28%) i liofilizować zgodnie z opisem w krokach 4.3.8-4.3.9. 
		UWAGA: Kolumna jonowymienna może być ponownie użyta po elucji wodą dejonizowaną do neutralizacji wody elucyjnej (około 50 ml), a następnie kondycjonowania przez elucję 50 ml 1 M HCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spe
	<ol>
		<li>Liofilizowany związek rozpuścić w około 2 mlH3PO4/wodę (20 μL/ml).</li>
		<li>Umieścić wkład z kationowymiennością SPE 6 ml w trybie mieszanym na kolektorze ekstrakcyjnym podłączonym do pompy wodnej. Kondycjonować wkład, przeciągając przez 4 ml metanolu pod zmniejszonym ciśnieniem dostarczanym przez kolektor. Zrównoważyć wkład, przeciągając przez 4 mlH3PO4/wodę (20 μL/ml).</li>
		<li>Załadować próbkę do wkładu za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl umieszczonej na górze żywicy na ściankach szklanej kolumny i przepłukać fiolkę zawierającą produkt trzykrotnie 0,75 ml H3PO4 / wodę (20 μl / ml) na przemycie. W ten sam sposób załaduj powstałą objętość płukania na kolumnę.</li>
		<li>Umyj wkład, eluując pod zmniejszonym ciśnieniem, dostarczanym przez kolektor, 4 ml 2% HCOOH w wodzie, a następnie 4 ml wody. Eluować z gradientem NH4OH w wodzie (4 ml na każdą elucję, zaczynając od 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% i 28%).</li>
		<li>Monitorować oczyszczanie za pomocą HPLC, analizując każdą frakcję zgodnie z protokołem monitorowania reakcji opisanym w kroku 6. Zachować wszystkie frakcje zawierające czystą pożądaną pochodną zgodnie z chromatogramem ultrafioletowym (UV) i przejść do kroku 5.2.6.</li>
		<li>Zebrać frakcje zawierające pożądany związek w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml, przepłukać probówki zawierające frakcje wodą i dodać objętość płukania do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej wyposażonej w termostat w łaźni wodnej, czajnik o temperaturze 40 °C i podłączony do pompy próżniowej ustawionej na ciśnienie 10 mbar.</li>
		<li>Rozpuścić ciało stałe w minimalnej objętości wody i przenieść roztwór do zważonej kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml. Przepłukać kolbę minimalną objętością wody, dodać objętość płukania do kolby o pojemności 25 ml i przejść do kroku 5.2.9.</li>
		<li>Zważyć oczyszczony produkt i obliczyć wydajność.</li>
		<li>Oczyszczony produkt rozpuścić w minimalnej objętości 2M HCl do momentu, gdy cząstki stałe przestaną być widoczne gołym okiem i liofilizować zgodnie z opisem w krokach 4.3.8-4.3.9. 
		UWAGA: Aminoalkohole są związkami wrażliwymi i są przechowywane jako sole chlorowodorku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Monitorowanie reakcji i analiza produktu
<ol>
	<li>Derywatyzacja substratów i produktów przed analizą HPLC 
	UWAGA: Podłoża i produkty muszą być derywatyzowane jako pochodne aromatyczne, aby zwiększyć ich wykrywalność chromatograficzną UV. Użyliśmy 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (DNFB). Każdą próbkę wstrzyknięto do HPLC natychmiast po derywatyzacji.
	<ol>
		<li>Weź 10 μl reakcji enzymatycznej i przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl 0,25 M roztworu wodnego NaHCO3, 100 μl etanolu i 30 μl 2,5 mg/ml roztworu DNFB w etanolu.</li>
		<li>Zamknąć mikroprobówkę i wstrząsać powstałym roztworem przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C, przy 1 000 obr./min. Ugasić 10 μl 1 M HCl.</li>
		<li>Przefiltrować przez niesterylny filtr strzykawkowy o średnicy 4 mm z hydrofilową membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości porów 0,22 μm za pomocą strzykawki Luer o pojemności 1 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić monitorowanie reakcji dioksygenazy przy użyciu dowolnego systemu zdolnego do separacji pochodnych aminokwasów. Protokół ten obejmuje detekcję UV aminokwasów derywatyzowanych przez grupę chromoforową dinitrobenzenu (DNB)27.
	<ol>
		<li>Wyposażyć HPLC z C18 w kolumnę z odwróconymi fazami z trimetylosililosililową końcówką (5 μm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę C18 z (30:70) eluentem B (MeCN + 0,1% TFA) z eluentem A (H2O+ 0,1% TFA) przy natężeniu przepływu 1 ml/min i 35 °C przez 15 minut (co odpowiada około 20 objętościom kolumny).</li>
		<li>Wstrzyknąć 10 μl derywatyzowanej mieszaniny reakcyjnej (patrz krok 6.1) do kolumny HPLC C18. Mieszaninę MeCN, 0,1% TFA/H2Oi 0,1% TFA należy stosować jako eluent o gradiacji liniowej (stosunek 30:70 do 70:30 w ciągu 9 min, temperatura 35 °C, przepływ 1 ml/min).</li>
		<li>Użyć detekcji UV ustawionej na 400 nm do analizy produktów eluowanych na kolumnie chromatograficznej. DNB-lizyna zwykle eluuje około 6,5 min, hydroksylowana DNB-lizyna około 5,5 min, dihydroksylowana DNB-lizyna około 4,2 min, a DNB-aminodiol około 5,3 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza NMR oczyszczonych aminoalkoholi
<ol>
	<li>Rozpuścić oczyszczone aminoalkohole wD2O(700 μl) i przenieść roztwór do probówki magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).</li>
	<li>Uzyskaj widma NMR 1H i 13C zgodnie z odpowiednimi protokołami obiektu NMR28.</li>
</ol>

<ol><li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+retrosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).</li>
<li>Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+catalysed+tandem+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzyme catalysed tandem reactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).</li>
<li>Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.201100256/abstract">Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives.</a> Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).</li>
<li>Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C2-Amino+Alcohols+and+Their+Heterocyclic+Derivatives+as+Chiral+Auxiliaries+in+Asymmetric+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis.</a> Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).</li>
<li>Abiko, A., Masamune, S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403900611334">An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4.</a> Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).</li>
<li>McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jo00065a020">A convenient reduction of amino acids and their derivatives.</a> J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).</li>
<li>Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+chirons%3A+a+tool+for+asymmetric+synthesis+of+heterocycles%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles.</a> Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).</li>
<li>Colomer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminomethylhydroxylation+of+alkenes%3A+Exploitation+in+the+synthesis+of+scaffolds+for+small+molecule+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).</li>
<li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.200700051/abstract">Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation.</a> Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).</li>
<li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+Thermodynamic+and+Kinetic+Limitations+of+Aldolase-Catalyzed+Reactions+by+Applying+Multienzymatic+Dynamic+Kinetic+Asymmetric+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).</li>
<li>Kohls, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.201500214/abstract">Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction.</a> Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).</li>
<li>Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1381117714003245">Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines.</a> J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).</li>
<li>Martinez, S., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+Mechanisms+of+Fe%28II%29-+and+2-Oxoglutarate-dependent+Oxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases.</a> J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).</li>
<li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cctc.201402498/abstract">Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds.</a> ChemCatChem. , (2014).</li>
<li>Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9784431552116">Polyamines</a>. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).</li>
<li>Kind, S., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+production+of+the+platform+chemical+1%2C5-diaminopentane%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria%3A+recent+achievements+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li>
<li>Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine%3A+A+five+carbon+diamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li>
<li>Shin, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+microorganisms+for+the+production+of+L-arginine+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell.+Fact%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives.</a> Microb. Cell. Fact. 13, (2014).</li>
<li>Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentative+Production+of+the+Diamine+Putrescine%3A+System+Metabolic+Engineering+of+Corynebacterium+Glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.</a> Metabolites. 5 (2), 211(2015).</li>
<li>Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Classification+of+Amino+Acid+Decarboxylases+from+the+Alanine+Racemase+Structural+Family+by+Phylogenetic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies.</a> Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).</li>
<li>Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Characteristics+of+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase+Capable+of+Decarboxylating+Both+L-Lysine+and+L-Ornithine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li>
<li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li>
<li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.201600934/full">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li>
<li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017).</li>
<li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe%28II%29%2Falpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li>
<li>Hüttel, W. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cite.201300008/abstract">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li>
<li>Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cctc.201300881/abstract">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li>
<li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta%2Falpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li>
<li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBiochem%22%5BJournal%5D)">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chiralne aminoalkohole i pochodne mają szeroki zakres zastosowań, od chiralnych środków pomocniczych do syntezy organicznej po terapię farmaceutyczną. Wieloetapowa synteza do produkcji aminoalkoholi za pomocą konwencjonalnej syntezy organicznej jest liczna, ale nie zawsze może być skuteczna ze względu na żmudne etapy ochrony/deprotekcji wraz z czułą kontrolą stereochemii16. Dobrą alternatywą jest podejście biokatalityczne, które rezygnuje z etapów ochrony/deprotekcji i jest zwykle wysoce stereosel...

Mimo korzyści oferowanych przez biokatalizę, integracja etapów biokatalitycznych w szlakach syntetycznych lub całkowitych drogach biokatalitycznych pozostaje w dużej mierze ograniczona do enzymatycznych rozdzielczeń kinetycznych. Metody te są szeroko stosowane jako pierwszy krok w asymetrycznej syntezie chemoenzymatycznej, jednak biokataliza oferuje znacznie więcej możliwości w zakresie interkonwersji grup funkcyjnych z wysoką stereoselektywnością1,2,3. Ponadto, ponieważ reakcje biokatalityczne prowadzone są w podobnych warunkach, możliwe jest przeprowadzanie reakcji kaskadowych w systemie one-pot4,5.
Chiralne aminoalkohole są wszechstronnymi cząsteczkami wykorzystywanymi jako pomocniki lub szkielety w syntezie organicznej6. Fragment aminoalkoholu często występuje w metabolitach wtórnych oraz w aktywnych składnikach farmaceutycznych (API). Pierwotne β-aminoalkohole są łatwo dostępne z odpowiednich α-aminokwasów poprzez konwencjonalną syntezę chemiczną, jednak dostęp do chiralnych γ-aminoalkoholi lub wtórnych aminoalkoholi często wymaga żmudnych ścieżek syntetycznych wraz z rygorystyczną kontrolą stereochemii7,8,9,10. Dzięki wysokiej stereoselektywności biokataliza może stanowić lepszą drogę syntezy tych chiralnych bloków budulcowych1,12,13,14.
Wcześniej zgłosiliśmy syntezę mono- i dihydroksy-L-lizyn poprzez diastereoselektywne hydroksylowanie enzymatyczne katalizowane przez dioksygenazy z rodziny oksygenaz zależnych od żelaza(II)/α-ketokwasu (αKAO) (Rysunek 1)15. W szczególności, wyjściowo z L-lizyny, dioksygenaza KDO1 katalizuje tworzenie pochodnej (3S)-hydroksylowej (1), podczas gdy pochodna (4R)-hydroksylowa (2) powstaje w reakcji z dioksygenazą KDO2. Kolejne regiodywersyjne hydroksylowania przez KDO1 i KDO2 prowadzą do powstania (3R,4R)-dihydroksy-L-lizyny (3) w formie optycznie czystej. Jednak ograniczony zakres substratowy tych enzymów utrudnia ich szerokie zastosowanie w syntezie chemicznej, zwłaszcza w hydroksylowaniu prostych amin, ponieważ obecność grupy kwasu karboksylowego w pozycji α względem grupy aminowej jest niezbędna dla ich aktywności16.
<img alt="Schemat konwersji chemicznej z enzymami KDO1, KDO2; przedstawiono 100% wydajności reakcji aminokwasowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Biokatalityczne konwersje L-lizyny. Konwersja do (3S)-hydroksy-L-lizyna (1) katalizowane przez dioksygenazę KDO1; (4R)-hydroksy-L-lizyna (2) katalizowane przezy KDO2 dioksygenazę; oraz (3R,4R)-dihydroksy-L-lizyna (3) poprzez reakcję kaskadową katalizowaną sukcesywnie przez dioksygenazy KDO1 i KDO2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Dekarboksylacja jest powszechną reakcją w metabolizmie17. W szczególnościy dekarboksylazy (DC) aminokwasów (EC 4.1.1) są enzymami niezależnymi od kofaktora (zależnymi od piruwalo grupy) lub zależnymi od PLP i katalizują dekarboksylację aminokwasów do odpowiadających im poliamin w bakteriach i organizmach wyższych18,19,20,21,2. Związki mono- i dihydroksylowe (Rysunek 3) 4-7, 10-1 odpowiadają hydroksylowanej kadawerynie, diamini otrzymywanej w wyniku dekarboksylacji L-lizyny. Kadaweryna jest kluczowym budulcem dla przemysłu chemicznego, w szczególności stanowi składnik polimerów poliamidowych i poliuretanowych. Dlatego bio-produkcja tej diaminy z zasobów odnawialnych przyciągnęła uwagę jako alternatywa dla drogi opartej na produktach naftowych i w tym celu zmodyfikowano różne mikroorganizmy. W tych szlakach metabolicznych kluczowym enzymem jest dekarboksylaza lizyny (LDC). LDC jest enzymem zależnym od PLP, należącym do strukturalnej rodziny rakemaz alaninowych (AR)23. Znane jest, że dekarboksylazy zależne od PLP (PLP-DCs) wykazują wysoką specyficzność substratową. Jednakże kilka enzymów posiada zdolność do lekkiej niespecyficzności, wykazując aktywność zarówno wobec L-ornityny, jak i L-lizyny, na przykład LDC z Selenomonas rumirantium (LDCSrum), która posiada podobne stałe kinetyczne dla dekarboksylacji lizyny i ornityny24,25. Ta rozszerzona specyficzność substratowa sprawia, że enzym ten jest dobrym kandydatem do dekarboksylacji mono- i di-hydroksy-L-lizyny. Ponadto, aby znaleźć DC aktywne wobec pochodnych hydroksylowych lizyny, zbadaliśmy kontekst genomiczny genów kodujących enzymy αKAO. Rzeczywiście, w genomach prokariontów geny kodujące enzymy zaangażowane w ten sam szlak biosyntetyczny są zazwyczaj współlokalizowane w klastrach genów. Gen KDO2 (z Chitinophaga pinensis) okazał się współlokalizowany z genem kodującym domniemaną PLP-DC (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, podczas analizy kontekstu genomicznego dioxygenazy KDO1 nie znaleziono genu kodującego DC. Białko PLP-DC z C. pinensis (DCCpin) zostało zatem wybrane jako obiecujący kandydat do katalizy etapu dekarboksylacji w reakcji kaskadowej.
<img alt="Schemat genów Chitinophaga pinensis, adnotacja funkcji białek, analiza szlaków metabolicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kontekst genomowy genu KDO2 w C. pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W konsekwencji zaprojektowaliśmy kaskadowe reakcje enzymatyczne z udziałem dioksygenaz i DC, aby umożliwić syntezę alifatycznych chiralnych β- i γ-aminooksyalkoholi z aminokwasów (Rysunek 3). Jak zgłaszano wcześniej, utlenianie C-H katalizowane przez αKAO wprowadza hydroksylowane centrum stereogeniczne z całkowitą diastereoselektywnością; chiralność Cβ/γ zostanie zachowana w etapie dekarboksylacji, który wpływa jedynie na węgiel Cα grupy aminokwasowej16.
<img alt="Ścieżka reakcji chemicznej, dekarboksylacja, hydroksylacja, synteza L-lizyny, schemat cząsteczkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Analiza retrosyntetyczna. (A) Retrosynteza $\beta$- i $\gamma$-aminoalkoholi (R)-1,5-diaminopentan-2-ol (4) z (5R)-hydroksy-L-lizyna oraz (S)-1,5-diaminopentan-2-ol (5) oraz 1,5-diaminopentan-3-ol (6) z L-lizyny. (B) Retrosynteza $\beta,\gamma$- i $\beta,\delta$-aminodioli (2S,3S)-1,5-diaminopentan-2,3-diol (10) oraz (2R,4S)-1,5-diaminopentano-2,4-diol (11) zaczynając od (5R)-hydroksy-L-lizyna oraz (2R,3R)-1,5-diaminopentan-2,3-diol (7) zaczynając od L-lizyny. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wychodząc z L-lizyny i jej pochodnej (5R)-hydroksylowej, przedstawiamy w niniejszej pracy dwu- lub trzyetapową, jednopułkową procedurę enzymatyczną, łączącą dioksygenazy i PLP-DC w celu otrzymania docelowych aminoalkoholi. Przed syntezą cząsteczek docelowych w skali laboratoryjnej, metoda została opracowana w skali analitycznej w celu dostosowania warunków reakcji, np. stężeń enzymów, niezbędnych do zapewnienia pełnej konwersji substratów; prezentujemy również tę procedurę.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-lizyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5S)-hydroksy-L-lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Outsourcing</td></tr> <tr><td>&kwas alfa;-ketoglutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan pirydoksalu (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimeraptobutano-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sód wodór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl HiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,2,2-trifluorooctowy</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Amoniak 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Metanol HiPerSolv CHROMANORM do LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolumna HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>System Accela UHPLC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor PDA Accela</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm filtry strzykawkowe - 0,22 i mikro; m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka tuberkulinowa z podziałką ml, końcówka Luer VWR</td><td></td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Żywica kationowymienna 100-200&nbsp; siatka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Wkład ekstrakcyjny do fazy stałej z kationowymiennością mieszaną 6 ml</td><td>Wody</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor ekstrakcyjny</td><td>Wody</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>B&uuml; chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator alfa 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta 20 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta 100 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta 500 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta 1000 & mikro; L</td><td>Spektrometr Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz</td><td>Mikroprobówka Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa ze stożkowym dnem</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna 25 ml 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 ml kolba okrągłodenna 29/32</td><td>Kolba okrągłodenna Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 29/32</td> Kolba Erlenmeyera <td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 ml</td><td>15496143</td><td></td> <td>Fischerbrand</td></tr></tbody></table>

enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z l-lizyny

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Aminoalkohole to wszechstronne związki o szerokim zakresie zastosowań. Na przykład były używane jako rusztowania chiralne w syntezie organicznej. Ich synteza za pomocą konwencjonalnej chemii organicznej często wymaga żmudnych, wieloetapowych procesów syntezy, z trudną kontrolą wyniku stereochemicznego. Przedstawiamy protokół enzymatycznej syntezy aminoalkoholi rozpoczynając od łatwo dostępnej L-lizyny w ciągu 48 godzin. Protokół ten łączy w sobie dwie reakcje chemiczne, które są bardzo trudne do przeprowadzenia przez konwencjonalną syntezę organiczną. W pierwszym etapie regio- i diastereoselektywne utlenianie nieaktywowanego wiązania C-H łańcucha bocznego lizyny jest katalizowane przez dioksygenazę; Drugie utlenienie regio- i diastereoselektywne katalizowane przez dioksygenazę regiorozwergentną może prowadzić do powstania 1,2-dioli. W ostatnim etapie grupa karboksylowa aminokwasu alfa jest rozszczepiana przez dekarboksylazę (DC) pirydoksalofosforanu (PLP). Ten etap dekarboksylacyjny wpływa tylko na alfa węgiel aminokwasu, utrzymując hydroksylowane centrum stereogeniczne w pozycji beta / gamma. Powstałe w ten sposób aminoalkohole są optycznie wzbogacane. Protokół został z powodzeniem zastosowany do syntezy czterech aminoalkoholi w skali półpreparatywnej. Monitorowanie reakcji prowadzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) po derywatyzacji 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenem. Proste oczyszczanie przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE) zapewniło aminoalkoholom doskonałe plony (od 93% do >95%).

Wcześniej opisaliśmy syntezę mono- i dihydroksy-L-lizyn poprzez diastereoselektywną hydroksylację enzymatyczną katalizowaną przez dioksygenazy z rodziny żelaza(II)/αKAO (Rycina 1)16. Aby zoptymalizować protokół całych kaskad przedstawionych w niniejszej pracy, które łączą jeden lub dwa etapy hydroksylacji katalizowanej przez αKAO, a następnie etap dekarboksylacji katalizowanej przez PLP-DC, warunki reakcji dostosowano tak, aby spełnić ...

Chiralne aminoalkohole są wszechstronnymi cząsteczkami do wykorzystania jako rusztowania w syntezie organicznej. Zaczynając od L-lizyny, syntetyzujemy aminoalkohole w enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej diastereoselektywne utlenianie C-H katalizowane przez dioksygenazę, a następnie rozszczepienie ugrupowania kwasu karboksylowego odpowiedniego aminokwasu hydroksylowego przez dekarboksylazę.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Ogólnym celem tej procedury jest synteza i oczyszczenie chiralnych aminoalkoholi, które są związkami o szerokim zakresie zastosowań, od chiralnych środków pomocniczych do syntezy organicznej po terapię farmaceutyczną. Jest to wszechstronny miernik, który pozwala uzyskać dostęp do chiralnego aminokwasu, pochodzącego z naturalnego aminokwasu, lizyny, w dwóch lub trzech etapach enzymatycznych w jednoczęściowej procedurze. Głównymi zaletami tej procedury jest prostota protokołu i skuteczność etapów oczyszczania.Będzie to demonstrować Aurelie Fossey-Jouenne, technik z mojego laboratorium. Aby zsyntetyzować di-hydroksylowaną pochodną lizyny, dodać bufor hepes, l-lizynę, kwas glutarowy alpaquita, askorbinian sodu i więcej soli do kolby Erlenmyera o pojemności 250 ml. Następnie dodać wodę do końcowej objętości 10 ml, biorąc pod uwagę objętość roztworu enzymu, który ma zostać dodany.Dodać deoksygenazę KD-01 do końcowego stężenia 0,075 mg na ml. Wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej z prędkością 300 obr./min przez odpowiedni czas. Po wymieszaniu przenieś 10mcl mieszaniny reakcyjnej do probówki ependorf o pojemności 1,5 ml.Następnie dodać roztwór wodorowęglanu sodu Aquias,

enzymatic-cascade-reactions-for-synthesis-chiral-amino-alcohols-from

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Ciecze jonowe (IL) zapewniają szybki, prosty i tani dostęp do 1,6-ketoestrów o wysokiej diastereoselektywności i dobrych plonach. Protokół reakcji jest solidny, a 1,6-ketoestry można uzyskać w skali gramowej po prostym protokole filtracji. Co więcej, 1,6-ketoestry są silnymi żelatorami w rozpuszczalnikach węglowodorowych.

Wysoce stereoselektywna synteza 1,6-ketoestrów za pośrednictwem cieczy jonowych: trójskładnikowa reakcja umożliwiająca szybki dostęp do nowej klasy żelatorów o niskiej masie cząsteczkowej

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Tutaj prezentujemy efektywną hydrolizę i późniejszą ochronę Fmoc aminokwasu wyizolowanego z kompleksu zasad Ni-Schiffa. Przedstawione tutaj warunki hydrolizy są odpowiednie do stosowania, gdy wymagane jest zachowanie kwasowo-labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego. Technika ta może być dostosowana do różnych nienaturalnych substratów aminokwasowych.

Hydroliza kompleksu zasad Ni-Schiffa w warunkach odpowiednich do zachowania kwasowo-labilnych grup ochronnych

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Opisano dwuetapowy, jednoetapowy protokół dotyczący eliminacji enolanów ketonowych do gatunków enolonu i dodania nukleofilu do pozycji α. Nukleofile obejmują chlorki, azydki, azole, allil-silany i związki aromatyczne.

Dwuetapowy protokół funkcjonalizacji ketonów metodą Umpolung za pośrednictwem gatunków enolonu

Enancjomerycznie wzbogacone szkielety bispiro[γ-butyrolakton-pirolidyn-4,4'-pirazolon] są asymetrycznie syntetyzowane przez prostą organokatalityczną reakcję cykloaddycji 1,3-dipolarnej.

Wydajna budowa lekopodobnych rusztowań bispirocyklicznych poprzez cykloaddycje organokatalityczne α-imino γ-laktonów i alkilolidenopirazlonów

Wspomagane mikrofalami wewnątrzcząsteczkowe reakcje dehydrogenacyjne Dielsa-Aldera (DA) zapewniają zwięzły dostęp do funkcjonalizowanych bloków budulcowych cyklopenta[b]naftalenu. Użyteczność tej metodologii wykazano poprzez jednoetapową konwersję odwodornionych cykloloadduktów DA w nowe solwatochromowe barwniki fluorescencyjne w reakcjach sprzęgania krzyżowego katalizowanych palladem Buchwalda-Hartwiga.

Wspomagane mikrofalami wewnątrzcząsteczkowe dehydrogenacyjne reakcje Dielsa-Aldera do syntezy funkcjonalizowanych naftalenów/barwników solwatochromowych

Poznaj enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny. Ta metoda oferuje prostotę protokołu i wysokie wydajności, znajdując zastosowanie w syntezie organicznej oraz terapii farmaceutycznej.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

Przeglądaj więcej filmów