Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

Ogólnym celem tej procedury jest synteza i oczyszczenie chiralnych aminoalkoholi, które są związkami o szerokim zakresie zastosowań, od chiralnych środków pomocniczych do syntezy organicznej po terapię farmaceutyczną. Jest to wszechstronny miernik, który pozwala uzyskać dostęp do chiralnego aminokwasu, pochodzącego z naturalnego aminokwasu, lizyny, w dwóch lub trzech etapach enzymatycznych w jednoczęściowej procedurze. Głównymi zaletami tej procedury jest prostota protokołu i skuteczność etapów oczyszczania.

Będzie to demonstrować Aurelie Fossey-Jouenne, technik z mojego laboratorium. Aby zsyntetyzować di-hydroksylowaną pochodną lizyny, dodać bufor hepes, l-lizynę, kwas glutarowy alpaquita, askorbinian sodu i więcej soli do kolby Erlenmyera o pojemności 250 ml. Następnie dodać wodę do końcowej objętości 10 ml, biorąc pod uwagę objętość roztworu enzymu, który ma zostać dodany.

Dodać deoksygenazę KD-01 do końcowego stężenia 0,075 mg na ml. Wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej z prędkością 300 obr./min przez odpowiedni czas. Po wymieszaniu przenieś 10mcl mieszaniny reakcyjnej do probówki ependorf o pojemności 1,5 ml.

Następnie dodać roztwór wodorowęglanu sodu Aquias, etanol i 2,5 mg na ml roztworu DNFB w etanolu. Zamknij mikroprobówkę i potrząsaj roztworem przez 1 godzinę przy 1000 obr./min i 65 stopniach Celsjusza. Po zakończeniu użyj mini wirówki, aby osadzić roztwór.

Ugasić mieszaninę reakcyjną 10mcl 1M kwasu hydrochlronowego. Zwiruj roztwór, a następnie użyj mini wirówki, aby go osadzić. Za pomocą strzykawki z przynętą o pojemności 1 ml przefiltruj mieszaninę przez niesterylny filtr strzykawkowy o średnicy 4 mm z hydrofilową membraną z fluorku winylidenu o wielkości 0,22 mcm.

Następnie umieścić pochodną próbki mieszaniny reakcyjnej w przyrządzie HPLC. Wstrzyknąć 10mcl do kolumny C-18 za pomocą detekcji UV, przy 400 nanometrach, aby przeanalizować produkt. Gdy monitorowanie reakcji wskazuje na zakończoną reakcję, dodać do kolby kwas glutarowy alphaquita, askorbinian sodu i więcej soli.

Dodać deoksygenazę KD-02 do odpowiedniego stężenia końcowego 0,5 mg na ml. Obliczone na podstawie początkowej objętości reakcji. Wstrząsaj mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej przy 300 obr./min przez 18 godzin.

Gdy monitorowanie reakcji wskazuje na zakończoną reakcję, dodaj 100mcl 100 milimolowego DTT do mieszaniny reakcyjnej. Plus 100mcl 100 milimolowego PLP. Dodać oczyszczoną dekarboksylazę Dccpin w przybliżonym stężeniu końcowym 0,5 mg na ml.

Oblicza się na podstawie początkowej objętości reakcji. Następnie wstrząsać mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej przy 300 obr./min przez 18 godzin. Po zakończeniu reakcji schłodzić mieszaninę, umieszczając kolbę w łaźni lodowej.

Ostrożnie dodaj 0,25 ml 6 molowych hcl i delikatnie potrząśnij zimną mieszaniną reakcyjną podczas dodawania. Teraz przenieś mieszaninę akdynową do stożkowej dolnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą szklanej pipety pastewnej. Odwiruj mieszaninę pod ciśnieniem 1 680 razy większym niż grawitacja i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po odwirowaniu przenieść sklarowany osad do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Następnie dodaj 10 ml wody dejonizowanej do probówki wirówkowej zawierającej osad. Vortex, aby ponownie zawiesić pellet.

Po odwirowaniu próbki przenieść supernatant do kolby okrągłodennej, zawierającej pierwszy supernatant. Zebrać supernatanty zamrozić, wynurzając się z kolby do postaci ciekłego azotu, stale obracając ręką. Natychmiast przenieść kolbę do liofilizatora stołowego, aby zapobiec rozmrażaniu się materiału.

Po zakończeniu procesu liofilizacji wyjąć kolbę z liofilizatora i przeprowadzić etapy oczyszczania. Do biokatalitycznej dekarboksylacji mono-hydroksylowych L-lizyn prąd stały z S Rhumerentium wykazywał aktywność w stosunku do wszystkich mono-hydroksylizyn. Gdzie zaobserwowano najlepszą konwersję dla trzech i pięciu pochodnych odpowiadających im chiralnych hydroksydiaminy.

Zgodnie z oczekiwaniami, Dccpin okazał się najbardziej odpowiedni do dekarboksylacji 4R-hydroksy-L-lizyny 2. W normalnych warunkach reakcji konwersja 3S-hydroksy-L-lizyny 1 do jej dekarboksylowanego odpowiednika 5 z DCcpin była niska. Nie zaobserwowano też aktywności w stosunku do 5R-hydroksy-L-lizyny.

W przypadku biokatalitycznej dekarboksylacji dehydroksy-L-lizyn tylko 3R, 4R, dihydroksy-L-lizyna 3 została ilościowo przekształcona w odpowiadającą jej dihydroksy-diaminę7 w standardowych warunkach reakcji. Konwersja 45-dihydroksy-L-lizyny 8 była umiarkowana, ale uległa poprawie poprzez zwiększenie obciążenia enzymem. Żaden z PLP-DC nie był aktywny w stosunku do 35-dihydroksy-L-lizyny 9.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe wykazujące konwersję kwantykatacyjną, określoną za pomocą monitorowania HPLC, udało się zwiększyć skalę. Aminoalkohole oczyszczono ze złożonych mieszanin reakcji enzymatycznych i doskonałych yeildów oraz scharakteryzowano za pomocą NMR. Po opanowaniu tej enzymatycznej syntezy kaskadowej i późniejszego oczyszczania można ją przeprowadzić w ciągu 48 godzin, jeśli jest ona prawidłowo uformowana.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że dobre natlenienie głównej reakcji jest niezbędne dla reakcji odtlenionych. A także dokładne monitorowanie, aby upewnić się, że cała lizyna jest spożywana przed dodaniem dikarbokoksydazy. Główną wadą tego protokołu jest ograniczone subsydiowane zakresy enzymu dioksygenazy i dekarboksylazy.

Niemniej jednak biochatalityczną syntezę różnych aminokwasów z aminokwasów można badać przy użyciu innego zestawu enzymów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić enzymatyczną reakcję kaskadową i jak oczyścić aminoalkohole ze złożonych mieszanin reakcyjnych. Nie zapominaj, że praca z DNFB może być niebezpieczna i w przeciwnym razie należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i przygotowanie reakcji w dygestorium.