Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest opracowanie przedklinicznego modelu myszy do zbadania roli komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie biologii nowotworów, dotyczących tego, w jaki sposób nowotworowe i mezenchymalne komórki macierzyste komunikują się za pomocą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i czy sprzyja to progresji raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie roli adaptacji mezenchymalnych komórek macierzystych przez nowotworowe EV, na progresję i powstawanie przerzutów in vivo.

Implikacje tej procedury rozciągają się na naszą terapię raka, ponieważ możemy użyć GSA do zakłócenia komunikacji EV i sygnalizacji androgenowej w celu zahamowania postępu raka. Oprócz zapewnienia wglądu w komunikację za pośrednictwem EV w kostniakomięsaku, metoda ta może być również stosowana do wielu innych typów raka. Rzeczywiście, szpik kostny pochodzący z mezenchymalnych komórek macierzystych jest łatwo rekrutowany do większej liczby miejsc, w których mogą różnicować się w komórki wspierające raka.

Zacznij od wysiewu ośmiu kolb o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych z 3 milionami komórek 143B każda. Hoduj komórki przy użyciu pożywki o zubożonej wartości EV przez 36 do 48 godzin. Gdy komórki są w 80 do 90% zlewne, zbierz supernatanty z ośmiu kolb w celu izolacji EV.

Następnie należy zastosować wirowanie różnicowe, aby usunąć wszystkie komórki i resztki komórek z supernatantu. Polega ona na wielokrotnym wirowaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z maksymalnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Po każdym etapie wirowania zebrać supernatant i pozostawić jeden mililitr supernatantu w probówce wirówkowej.

Teraz załaduj wstępnie oczyszczony supernatant do probówek ultrawirówek w ilości 38,5 mililitra na probówkę. Następnie izoluj EV za pomocą ultrawirówki o wadze 70 000 g przez godzinę, z powolną przerwą i w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ultrawirowaniu ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając około jednego mililitra.

Następnie ponownie zamieszaj granulki zawierające EV w pozostałej objętości. Zbierz wszystkie zawieszenia. I umyj zebrane zawiesiny PBS.

Napełnij rurkę do 38,5 mililitra. Następnie powtórz cykl ultrawirowania, ale nie używaj przerwy. Wirnik powinien przestać się obracać po około godzinie.

Następnie ostrożnie usuń supernatant bez naruszania osadu i pozostaw od 100 do 200 mikrolitrów roztworu. Na koniec ponownie zawieś granulkę EV i dostosuj końcową objętość do 200 mikrolitrów za pomocą PBS. EV można następnie scharakteryzować za pomocą TEM, znakować barwnikami do eksperymentów absorpcyjnych lub wykorzystać do edukacji mezenchymalnych komórek macierzystych do eksperymentów in vivo.

Bardzo ważne jest, aby pierwotne MSC miały odpowiednią gęstość komórek przed ekspozycją na rakowe EV. Komórka powinna być zlewana w około 70%, aby osiągnąć optymalny stosunek EV komórki, a także zapobiec przerostowi w okresach edukacji. W tym eksperymencie wykorzystano zaaklimatyzowane dorosłe myszy Athymic Nude-Foxn1nu.

Na dzień przed zabiegiem chirurgicznym należy podać paracetamol wraz z wodą do picia. W dniu zabiegu należy przygotować komórki 143B w dawce 200 000 na mikrolitr w PBS. Na 20 minut przed zabiegiem należy podać zwierzęciu buprenorfinę.

Tuż przed znieczuleniem załaduj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów ze skoncentrowanymi komórkami 143B. Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia i nałożeniu maści do oczu, należy ułożyć zwierzę na plecach tylnymi nogami w kierunku operatora. Następnie przymocuj maskę anestezjologiczną do zwierzęcia.

Następnie zegnij lewe kolano i przetrzyj skórę trzema naprzemiennymi peelingami z 70% etanolu i jodowidonu, a następnie nałóż 2% lidokainy jako miejscowy środek przeciwbólowy. Teraz wykonaj małe nacięcie w skórze tuż pod kolanem, aby odsłonić kość piszczelową. Następnie, za pomocą wiertła do mikroskrętów o grubości 0,8 milimetra, wykonaj otwór w kości piszczelowej, około 2 milimetry poniżej kolana.

Unikaj wiercenia w obu korach piszczelowych. Kontynuuj, powoli wstrzykując jeden mikrolitr komórek do otworu przez około pięć sekund. Następnie zamknij otwór kroplą kleju tkankowego, aby zapobiec cofaniu się zawiesiny.

Zakończ operację, zamykając skórę szwami i jedną kroplą kleju tkankowego. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po podgrzaniu i potraktuj je paracetamolem przez 24 godziny. Dwa dni później użyj strzykawki insulinowej o średnicy 0,5 milimetra, aby wstrzyknąć MSCs do żyły ogonowej.

Prawidłowe podanie podczas iniekcji do żyły ogonowej można potwierdzić wizualnie. Jeśli pojawi się biały obszar lub wystąpi opór, należy ponownie wstrzyknąć lek w obszar powyżej poprzedniego miejsca wstrzyknięcia. Następnie, dwa razy w tygodniu, śledź wzrost guza za pomocą bioluminescencji.

Wstrzyknij myszom D-lucyferynę za pomocą strzykawki insulinowej, a 10 minut później zmierz strumień fotonów generowany z komórek nowotworowych za pomocą systemu obrazowania. Gdy średnica guza zwierzęcia przekroczy 15 milimetrów lub jego utrata masy ciała przekroczy 15%, należy poddać zwierzę eutanazji i pobrać wszystkie odpowiednie tkanki. 10 minut przed eutanazją wstrzyknąć D-lucyferynę, tak jak przed obrazowaniem.

Po eutanazji zbierz płuca, wątrobę, śledzionę i nerki za pomocą wysterylizowanych nożyczek i pęsety. Umyj krew z narządów za pomocą PBS i ułóż je na szalce Petriego w celu obrazowania. Korzystając z systemu obrazowania bioluminescencyjnego, udokumentuj obie strony narządów.

Po wykonaniu zdjęć należy natychmiast przymocować narządy do przyszłej analizy histologicznej. Aby przetworzyć dokumenty fotograficzne, po prostu zastosuj ręczne progowanie i policz liczbę guzków na każdym zdjęciu. Upewnij się, że używasz tego samego progu dla każdego zdjęcia i dokumentujesz tkanki z każdego kierunku, zwłaszcza płuca.

Po odwapnieniu kości piszczelowej myszy przystąp do odwodnienia i zatopienia parafiny. Następnie za pomocą mikrotomu przygotuj sześciomikronowe skrawki parafiny i zbierz skrawki na szkiełkach podstawowych. Po wyschnięciu szkiełek przechowuj je przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia wykonaj pobieranie antygenu za pośrednictwem ciepła przy użyciu buforu cytrynianowego. Następnie wybarwić tkanki przeciwciałem anty-GFP w ilości od 1 do 900, a następnie za pomocą przeciwbarwienia DAPI. Na koniec należy udokumentować wybarwione skrawki tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Czystość wyizolowanych EV została potwierdzona za pomocą mikroskopii elektronowej. Preparaty zawierały pęcherzyki o średnicy od 40 do 100 nanometrów. Aby ocenić, czy rakowe EV wchodzą w interakcje z MSC, EV oznaczono zielonym fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem łącznikowym i inkubowano przez noc z MSC.

W ten sposób potwierdzono skuteczne wykorzystanie pojazdów elektrycznych przez MSC. Właściwości immunomodulacyjne EV na MSCs potwierdzono za pomocą testu immunologicznego cytokin opartych na multipleksie B. Nowotworowe EV powodowały zwiększoną produkcję IL-8 i IL-6 w MSCs, w porównaniu z ludzkimi EV kontrolującymi fibroblasty.

Następnie, w ortotopowym mysim modelu kostniakomięsaka z ksenoprzeszczepem, wykazano, że myszy leczone MSC edukowanymi przez EV miały przyspieszony wzrost guza. Cztery dni po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu MSC wykazujących ekspresję GFP, komórki wykazujące ekspresję GFP wykryto w szpiku kostnym i tkance nowotworowej, wykazując naprowadzanie MSC na miejsce guza. Obrazowanie ex vivo różnych narządów uwidoczniło tworzenie się guzków płucnych.

Ostatecznie myszy otrzymujące MSC edukowane przez EV miały więcej przerzutów do płuc. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak edukować komórki zrębu za pomocą rakowych EV ex vivo i badać efekty wykształconych komórek zrębu in vivo przy użyciu przedklinicznych modeli mysich. Po opanowaniu procedura ta może zostać wykonana w ciągu czterech tygodni, pod warunkiem, że dostępna jest wystarczająca liczba EV na raka.

Podejmując się tej procedury, ważne jest, aby planować z wyprzedzeniem i uzyskać powtarzalne oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych raka, a także użyć mezenchymalnych komórek macierzystych o niskiej przepuszczalności.