Name: Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Technika ta pozwala uzyskać szczegółowe informacje o rozwoju morfologicznym i procesie pigmentacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Seanowi B. Carrollowi i Thomasowi Wernerowi za dostarczenie materiałów na muchy, Naoyuki Fuse za sprzęt, Byung Seok Jin za pomoc w filmowaniu, Kiyokazu Agata za mentoring i Elizabeth Nakajima za montaż w języku angielskim. Prace te były wspierane przez KAKENHI 17K19427 i Fundację Naukową Takeda.

<ol><li>Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarson%2C+HL+%22Essays+in+evolution+and+genetics+in+honor+of+Theodosius+Dobzhansky%22">Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky</a>. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).</li>
<li>Markow, T. A., O'Grady, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarkow%2C+TA+%22Drosophila%3A+a+guide+to+species+identification+and+use%22">Drosophila: a guide to species identification and use</a>. , Academic Press. New York. (2006).</li>
<li>Patterson, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatterson%2C+JT+%22The+Drosophilidae+of+the+southwest%22">The Drosophilidae of the southwest</a>. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).</li>
<li>Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10164-014-0399-z">Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata.</a> J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).</li>
<li>Werner, T., Jaenike, J. <a target="_blank" href="http://humanities.lib.rochester.edu/drosophilaguide/">Drosophilids of the Midwest and Northeast</a>. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).</li>
<li>Arnoult, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+diversification+of+fly+pigmentation+through+evolution+of+a+gene+regulatory+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module.</a> Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).</li>
<li>Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origination+and+diversification+of+a+dimorphic+gene+regulatory+network+through+parallel+innovations+in+cis+and+trans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans.</a> PLoS Genet. 11 (4), e1005136(2015).</li>
<li>Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chance+caught+on+the+wing%3A+cis-regulatory+evolution+and+the+origin+of+pigment+patterns+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila.</a> Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).</li>
<li>Glassford, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-option+of+an+ancestral+Hox-regulated+network+underlies+a+recently+evolved+morphological+novelty%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty.</a> Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).</li>
<li>Koshikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+modularity+and+the+evolution+of+new+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Enhancer modularity and the evolution of new traits.</a> Fly. 9 (4), 155-159 (2015).</li>
<li>Koshikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+cis-regulatory+activities+underlies+novel+domains+of+wingless+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).</li>
<li>McGregor, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evolution+through+multiple+cis-regulatory+mutations+at+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene.</a> Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+mechanisms+underlie+the+evolutionary+diversification+of+Drosophila+sex+combs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).</li>
<li>Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+wing+colour+pattern+by+the+Wingless+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen.</a> Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).</li>
<li>Wittkopp, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+polymorphism+to+interspecific+divergence%3A+genetics+of+pigmentation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila.</a> Science. 326 (5952), 540-544 (2009).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+in+the+wing+of+Drosophila%3A+a+study+of+the+engrailed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene.</a> Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).</li>
<li>Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+development+and+pigmentation+process+of+a+polka-dotted+fruit+fly%2C+Drosophila+guttifera+%28Insecta%2C+Diptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera).</a> Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).</li>
<li>Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoshikawa%2C+S+%22Diversity+and+evolution+of+butterfly+wing+patterns%3A+an+integrative+approach%22">Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach</a>. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).</li>
<li>True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+wing+melanin+patterns+form+by+vein-dependent+elaboration+of+enzymatic+prepatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns.</a> Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeography+of+the+Subgenus+Drosophila+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%3A+evolutionary+history+of+faunal+divergence+between+the+Old+and+the+New+Worlds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds.</a> PLoS ONE. 11 (7), e0160051(2016).</li>
<li>Resh, V. H., Cardé, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aResh%2C+VH+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).</li>
<li>DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+families+of+sigmoidal+curves%3A+application+to+bioassay%2C+radioligand+assay%2C+and+physiological+dose-response+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves.</a> Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1050590207/abstract">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).</li>
<li>McKinney, M. L., McNamara, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcKinney%2C+ML+%22Heterochrony%3A+the+evolution+of+ontogeny%22">Heterochrony: the evolution of ontogeny</a>. , Plenum Press. New York. (1991).</li>
<li>Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pixels+to+picograms%3A+a+beginners%27+guide+to+genome+quantification+by+Feulgen+image+analysis+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry.</a> J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).</li>
<li>Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size+of+termites+%28Insecta%2C+Dictyoptera%2C+Isoptera%29+and+wood+roaches+%28Insecta%2C+Dictyoptera%2C+Cryptocercidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae).</a> Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisujemy tutaj protokoły definiowania stadiów poczwarki, usuwania poczwarki w celu szczegółowej obserwacji, pomiaru czasu trwania stadiów poczwarki oraz pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle u D. guttifera. Protokoły te można zastosować do wielu Drosophila i pokrewnych gatunków much, zwłaszcza gatunków z pigmentacją skrzydeł.
Pogłębiona obserwacja i opisanie bardziej szczegółowych zdarzeń rozwojowych umożliwiłoby dalszy podział etapów. W wielu przypadkach zdarzenie...

Niektóre cechy morfologiczne Drosophila są zróżnicowane wśród gatunków1,2,3,4,5. Do pytania o to, w jaki sposób powstaje różnorodność morfologiczna, możemy podejść poprzez porównanie mechanizmów powstawania tych morfologii. Przykładami takich morfologii są trichomy larw, grzebienie płciowe dorosłych, zewnętrzne narządy płciowe, pigmentacja brzucha i pigmentacja skrzydeł6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Aby zbadać różnice morfologiczne między dorosłymi osobnikami, ważna jest obserwacja i analiza stadiów poczwarki, ponieważ los cech dorosłych osobników jest determinowany w późnych stadiach larwalnych, a późniejsza morfogeneza przebiega w okresie poczwarki.
W badaniach biologii rozwojowej Drosophila melanogaster, "godziny APF" (godziny po uformowaniu się poczwarki) to powszechna metoda oznaczania stadium poczwarki16. System ten wykorzystuje bezwzględny czas po uformowaniu się poczwarki i jest bardzo wygodny w rutynowych eksperymentach. Jednak szybkość rozwoju może się różnić między poczwarkami i mogą mieć na nią wpływ niewielkie różnice genetyczne, epigenetyczne lub mikrośrodowiskowe, a zatem ten sam bezwzględny czas po utworzeniu poczwarki nie gwarantuje, że poczwarki są na tym samym etapie rozwoju. W wielu przypadkach stadia zdefiniowane przez cechy morfologiczne są preferowane do porównywania wielu osobników. W szczególności porównanie między gatunkami wymaga precyzyjnego stopniowania i porównania między odpowiadającymi im (homologicznymi) stadiami.
Bainbridge and Bownes17 rozpoznał 20 stadiów poczwarki (od P1 do P15(ii)) na podstawie cech morfologicznych poczwarek Drosophila melanogaster. Ta klasyfikacja jest najczęściej używanym systemem morfologicznej oceny stopnia rozwoju18. W poprzednim badaniu przeprowadziliśmy ocenę stopnia zaawansowania poczwarki Drosophila guttifera, aby stworzyć podstawę do badań nad pigmentacją skrzydeł19. D. guttifera ma wzór w kropki na skrzydłach i jest jednym z gatunków modelowych do tworzenia pigmentacji skrzydeł20. Chociaż odnieśliśmy się do kryteriów morfologicznych opisanych w badaniach Bainbridge'a i Bownesa17, bezpośrednio mierzyliśmy czas trwania etapu za pomocą obserwacji seryjnych19, zamiast używać oszacowania czasu trwania etapu Bainbridge'a i Bownesa na podstawie obserwowanej częstotliwości. W tym miejscu opisujemy metodę oceny stanu poczwarki i pomiaru czasu trwania stadiów poczwarki Drosophila zastosowaną w Fukutomi et al19.
Aby zbadać mechanizm rozwoju pigmentacji skrzydeł, musimy wiedzieć, kiedy w stadium poczwarkowym lub dorosłym występuje pigmentacja. Fukutomi i wsp. 19 ilościowe określenie gęstości optycznej (OD) pigmentacji w stadium poczwarki i dorosłego osobnika poprzez analizę obrazów skrzydeł. Uważa się, że pigmentacja skrzydeł Drosophila jest spowodowana nagromadzeniem czarnej melaniny21. Do kwantyfikacji OD użyto obrazów w skali szarości i oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)22. Aby rozpoznać i określić ilościowo pigmentację specyficzną dla plamki (ΔOD), odejmujemy OD na zewnątrz plamki od OD wewnątrz plamki. Aby metoda ta była powtarzalna i obiektywna, miejsca pomiaru OD powinny być wyznaczane za pomocą żył skrzydłowych jako punktów orientacyjnych. W tym artykule szczegółowo opisujemy tę metodę ilościowego oznaczania pigmentacji skrzydeł u Drosophila guttifera.

<table><tbody><tr><td>Drosophila guttifera</td><td>The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego</td><td>15130-1971.10</td><td>Drosophila guttifera, gatunek muszki owocowej używany w tym artykule</td></tr><tr><td>Fiolka plastikowa</td><td>Hightech</td><td>MKC-30</td><td>Fiolka plastikowa, do konserwacji stada much</td></tr><tr><td>Zatyczki brzęczące do fiolek i zamknięć butelek do szklanych fiolek</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-271</td><td>Korek celulozowy, do konserwacji stada muchowego</td></tr><tr><td>Cukier miękki biały</td><td>Mitsui Cukier</td><td>J-500g</td><td>Cukier miękki biały, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana</td><td>Nippon Młynki</td><td>F</td><td>Mąka kukurydziana, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>Grys kukurydziany - C</td><td>Młyny do mąki Nippon</td><td>GC</td><td>Kasza kukurydziana - C, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Matsuki Kanten Sangyo</td><td>No.602</td><td>Proszek agarowy, do standardowej mąki kukurydzianej / cukru / drożdży / agaru</td></tr><tr><td>Suche drożdże piwne</td><td>Asahi Food & Opieka zdrowotna</td><td>Y2A</td><td>Suche drożdże piwne, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>P-hydroksybenzoesan butylu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06327-02</td><td>P-hydroksybenzoesan butylu, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>Etanol, do standardowej mąki kukurydzianej/cukru/drożdży/agaru</td></tr><tr><td>Mikroprobówka z płaskim dnem</td><td>Ina Optica</td><td>CF-0150</td><td>1,5 ml mikroprobówka, do zbieranie poczwarek</td></tr><tr><td>CAPSULEFUGE</td><td>Tomy</td><td>PMC-060</td><td>Mini mikrowirówka, do zbierania poczwarek</td></tr><tr><td>Sterylizowany Schale NB</td><td>Sansei Medical</td><td>01-013</td><td>Plastikowa szalka Petriego (średnica 90 mm x wysokość 15 mm)</td></tr><tr><td>Stojak na probówki z surowicą</td><td>Iwaki</td><td>9796-050</td><td>Używany jako komora wilgotna, do obserwacji poczwarek</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Plastikowa szalka Petriego (średnica 35 mm x wysokość 10 mm)</td></tr><tr><td>Standardowa szalka do hodowli tkankowych</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td>Plastikowa szalka Petriego (średnica 60 mm x wysokość 15 mm)</td></tr><tr><td>Pinezka</td><td>Kokuyo</td><td>51233709</td><td>Pinezka, do robienia otworów na pokrywie mikroprobówki</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td>, <td>do obserwacji morfologicznej</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Olympus</td><td>DSE-330-A Aparat</td><td>cyfrowy, do obrazowania</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna NICETACK</td><td>Nichiban</td><td>NW-15SF</td><td>Taśma dwustronna, do usuwania poczwarek</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Kleszcze, do usuwania poczwarki</td></tr><tr><td>Van Gogh VISUAL Pędzel malarski</td><td>Talens Japan</td><td>GWVR-#5/0</td><td>Pędzel do usuwania puparium</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Merck</td><td>665-180</td><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, do pomiaru czasu trwania okresów poczwarki</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>NaCl, dla PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>285-14</td><td>KCl, dla PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td>Na2HPO4&middot; 12H2O, dla PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td>KH2PO4, dla filtra PBS</td></tr> o <tr><td>stopniowanej neutralnej gęstości (ND) 0,04 - 3,0</td><td>Edmund Optics</td><td>64-384</td><td>Stopniowy filtr gęstości, do kalibracji pomiaru pigmentacji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8.0-101</td><td>Oprogramowanie ImageJ, do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle (https://imagej.nih.gov)</td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe FINE FROST</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>FF-001</td><td>Szkiełko podstawowe, do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle</td></tr><tr><td>Kwadratowa szklana osłona mikroskopu 18 x 18</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>C018181</td><td>Szkiełko wystawowe do pomiaru intensywności czarnych plam na skrzydle</td></tr></tbody></table>

metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł drosophila guttifera

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Zróżnicowane gatunki muszki owocowej (Drosophila) dają możliwość badania mechanizmów rozwoju i zmian genetycznych odpowiedzialnych za zmiany ewolucyjne. W szczególności stadium dorosłe jest bogatym źródłem cech morfologicznych do porównań międzygatunkowych, w tym porównania pigmentacji skrzydeł. Aby zbadać różnice rozwojowe między gatunkami, wymagana jest szczegółowa obserwacja i odpowiednia ocena stopnia zaawansowania w celu precyzyjnego porównania. W tym miejscu opisujemy protokoły oceny okresów poczwarki i ilościowego oznaczania pigmentacji skrzydeł u muszki owocowej w kropki, Drosophila guttifera. W pierwszej kolejności opisujemy metodę szczegółowej obserwacji morfologicznej i definiowania stadiów poczwarki na podstawie morfologii. Metoda ta obejmuje technikę usuwania poczwarki, która jest zewnętrznym chitynowym przypadkiem poczwarki, w celu umożliwienia szczegółowej obserwacji morfologii poczwarki. Po drugie, opisujemy metodę pomiaru czasu trwania określonych stadiów poczwarki. Na koniec opisano metodę kwantyfikacji pigmentacji skrzydeł w oparciu o analizę obrazu z wykorzystaniem obrazów cyfrowych i oprogramowania ImageJ. Dzięki tym metodom możemy stworzyć solidną podstawę do porównania procesów rozwojowych cech dorosłych osobników w stadiach poczwarkowych.

Okres poczwarki D. guttifera podzielono na 17 stadiów (P1 – P15(ii); obrazy trzech reprezentatywnych stadiów (P1, P5 – 6, P10) przedstawiono na Rysunku 3, a wszystkie 17 stadiów zilustrowano na Rysunku 4). Chociaż Bainbridge i Bownes17 wyróżnili 20 stadiów u D. melanogaster, niektóre z nich nie mogły zostać zastosowane do D. guttifera. Kolejność dwóch zdarzeń rozwojowych – pojawi...

Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest etap okresów poczwarki i pomiar pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ewolucyjnej biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób rozwijają się wzorce pigmentacji u Drosophila. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać szczegółowe informacje na temat rozwoju morfologicznego i procesu pigmentacji.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat rozwoju morfologicznego i procesu pigmentacji Drosophila guttifera, można ją zastosować do innych gatunków Drosophila. Aby rozpocząć usuwanie poczwarki, przyklej kawałek taśmy dwustronnej na kawałku ręcznika papierowego. Umieść poczwarkę na taśmie dwustronnej, brzuszną stroną do góry.Zlokalizuj przestrzeń między przednią stroną poczwarki a poczwarką wewnętrzną. Chwyć i usuń poczwarkę wokół tej szczeliny za pomocą kleszczy. I odsłoń przednią stronę głowy poczwarki.Włóż końcówkę kleszczy, przesuwając ją równolegle do osi przednio-tylnej. Podnieś końcówkę kleszczy, aby miejscowo złamać poczwarkę. Powtarzaj tę czynność, aż pęknięcie dotrze do tylnej części poczwarki.Upewnij się, że między puparium a nogami poczwarki utworzyła się szczelina. I złam brzuszną stronę poczwarki, jednocześnie minimalizując uszkodzenia wewnętrznej poczwarki. Po jak największym rozbiciu poczwarki wyjmij poczwarkę za pomocą drobnego pędzla.Umieść poczwarkę na kawałku bibuły, który został zwilżony ddH2O i umieszczony na plastikowej szalce Petriego. Natychmiast rób zdjęcia, ponieważ odsłonięta poczwarka jest wrażliwa i łatwo wysycha. Przystąp do przygotowania obrazu i usuń przednią część poczwarki za pomocą kleszczy.Wyjmij poczwarkę i umieść ją w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na plastikowej szalce Petriego. Następnie wytnij podstawowy staw skrzydła. Gdy skrzydło jest złożone, umieść je na plastikowej szalce Petriego wypełnionej ddH2O, aby przedłużyć je pod ciśnieniem osmotycznym.Zbieraj nowo zamknięte dorosłe osoby raz na 10 minut z pliku giełdowego. Znieczulij muchę za pomocą podkładki znieczulającej CO2. Potwierdź znieczulenie przez unieruchomienie i przetnij staw podstawowy skrzydła.Upuść 10 mikrolitrów PBS na szklane szkiełko. Umieść skrzydło w kropli. I przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym.Następnie włącz światło mikroskopu stereoskopowego i ustaw je na maksimum. Ustaw soczewkę obiektywu na 11,5x i ustaw przysłonę w najbardziej otwartym stanie. Następnie włącz kamerę i ustaw kamerę.Ustaw ostrość na próbce, przesuwając pokrętło ostrości mikroskopu. Naciśnij spust migawki na pilocie zdalnego sterowania, aby zrobić zdjęcie. Zrób zdjęcie skrzydła, wyśrodkowane w dzwonkowatym czubku, umieszczając dystalną część skrzydła po lewej stronie, a wewnętrzną część skrzydła po górnej stronie.Otwórz obrazek z plamką czułkową dzwonkowatą pośrodku. Kliknij opcję Obraz, Wpisz 1, 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy. Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt.Ustaw prawą stronę prostokąta tak, aby znajdowała się na prawo od plamki czułości dzwonka. Kliknij opcję Edycja, Zaznaczenie, Dodaj do menedżera, a następnie zaznacz kolumnę Pokaż wszystko. Następnie kliknij narzędzie kąta w narzędziach do zaznaczania linii.Narysuj pierwszą linię na tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Ustaw lewe punkty końcowe linii na wierzchołku poprzednio narysowanego prostokąta. Narysuj drugą linię w górnej części prostokąta.Naciśnij M, aby zmierzyć kąt między dwiema liniami narysowanymi w tym kroku. Kliknij okno obrazu na ekranie komputera. Kliknij Edycja, Zaznaczenie, Dodaj do menedżera.Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu. Kliknij przycisk Edycja, Zaznaczenie, Obróć. Wpisz stopnie ujemne poprzednio zmierzonego kąta w kolumnie Kąt i kliknij przycisk OK, aby obrócić prostokąt narysowany w tym kroku.Przesuń prostokąt narysowany za pomocą strzałek i ustaw punkt końcowy tylnej linii drugiej żyły podłużnej po lewej stronie prostokąta. A dolną stronę prostokąta przymocuj do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Upewnij się, że została narysowana prostopadła linia od punktu końcowego drugiej żyły podłużnej do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej.Zdefiniuj stopę prostopadłej linii jako punkt A.Zapisz współrzędną X i współrzędną Y punktu A, wskazanymi poniżej narzędzi wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie A.Otwórz obraz z punktem A pośrodku. Kliknij opcję Obraz, Typ, 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy. Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu.Kliknij Edytuj, Zaznaczenie, Określ. Zaznacz opcję Kolumna owalna i wyśrodkowana. Wpisz 100 pikseli w kolumnach szerokości i wysokości.Wpisz współrzędne X punktu A w kolumnie Współrzędna X i wpisz współrzędne Y punktu A w kolumnie Współrzędne Y, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie kliknij przycisk Analizuj i mierz. Jeśli kalibracja została już zakończona, OD są wskazane w kolumnie Średnia. Porównanie danych z wielu etapów wykazało, że etap P12 to czas wystąpienia pigmentacji, a pigmentacja kończy się w ciągu 12 godzin po ekluzji.Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się ewolucyjną biologią rozwoju do badania różnic w rozwoju poczwarek i procesie pigmentacji wśród gatunków Drosophila.

methods-for-staging-pupal-periods-measurement-wing-pigmentation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zróżnicowanie fenotypowe cech może wynikać z mutacji w sekwencjach elementów cis-regulatorowych (CRE), które kontrolują wzorce ekspresji genów. Metody opracowane do zastosowania u Drosophila melanogaster pozwalają na ilościowe porównanie poziomów przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów pośredniczonych przez zmodyfikowane lub naturalnie występujące warianty CRE.

Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Ten artykuł opisuje technikę usuwania poczwarki owada przy jednoczesnym zachowaniu wewnętrznej poczwarki w stanie nienaruszonym, a tym samym nadającej się do dalszych badań. Przykładowy protokół przedstawia procedurę z Drosophila guttifera; jednak technika ta ma zastosowanie do innych gatunków Drosophila.

Usuwanie puparium owadów: metoda badania poczwarek

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Tutaj prezentujemy łatwą w użyciu i wszechstronną metodę do wykonywania na żywo obrazowania procesów rozwojowych w ogóle, a morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej w szczególności u żyjących poczwarek Drosophila.

In vivo (in vivo) Obrazowanie morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej u poczwarek Drosophila

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Technika ta pozwala uzyskać szczegółowe informacje o rozwoju morfologicznym i procesie pigmentacji.

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

Przeglądaj więcej filmów