Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera
24 stycznia 2018
Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest etap okresów poczwarki i pomiar pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ewolucyjnej biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób rozwijają się wzorce pigmentacji u Drosophila. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać szczegółowe informacje na temat rozwoju morfologicznego i procesu pigmentacji.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat rozwoju morfologicznego i procesu pigmentacji Drosophila guttifera, można ją zastosować do innych gatunków Drosophila. Aby rozpocząć usuwanie poczwarki, przyklej kawałek taśmy dwustronnej na kawałku ręcznika papierowego. Umieść poczwarkę na taśmie dwustronnej, brzuszną stroną do góry.
Zlokalizuj przestrzeń między przednią stroną poczwarki a poczwarką wewnętrzną. Chwyć i usuń poczwarkę wokół tej szczeliny za pomocą kleszczy. I odsłoń przednią stronę głowy poczwarki.
Włóż końcówkę kleszczy, przesuwając ją równolegle do osi przednio-tylnej. Podnieś końcówkę kleszczy, aby miejscowo złamać poczwarkę. Powtarzaj tę czynność, aż pęknięcie dotrze do tylnej części poczwarki.
Upewnij się, że między puparium a nogami poczwarki utworzyła się szczelina. I złam brzuszną stronę poczwarki, jednocześnie minimalizując uszkodzenia wewnętrznej poczwarki. Po jak największym rozbiciu poczwarki wyjmij poczwarkę za pomocą drobnego pędzla.
Umieść poczwarkę na kawałku bibuły, który został zwilżony ddH2O i umieszczony na plastikowej szalce Petriego. Natychmiast rób zdjęcia, ponieważ odsłonięta poczwarka jest wrażliwa i łatwo wysycha. Przystąp do przygotowania obrazu i usuń przednią część poczwarki za pomocą kleszczy.
Wyjmij poczwarkę i umieść ją w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na plastikowej szalce Petriego. Następnie wytnij podstawowy staw skrzydła. Gdy skrzydło jest złożone, umieść je na plastikowej szalce Petriego wypełnionej ddH2O, aby przedłużyć je pod ciśnieniem osmotycznym.
Zbieraj nowo zamknięte dorosłe osoby raz na 10 minut z pliku giełdowego. Znieczulij muchę za pomocą podkładki znieczulającej CO2. Potwierdź znieczulenie przez unieruchomienie i przetnij staw podstawowy skrzydła.
Upuść 10 mikrolitrów PBS na szklane szkiełko. Umieść skrzydło w kropli. I przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie włącz światło mikroskopu stereoskopowego i ustaw je na maksimum. Ustaw soczewkę obiektywu na 11,5x i ustaw przysłonę w najbardziej otwartym stanie. Następnie włącz kamerę i ustaw kamerę.
Ustaw ostrość na próbce, przesuwając pokrętło ostrości mikroskopu. Naciśnij spust migawki na pilocie zdalnego sterowania, aby zrobić zdjęcie. Zrób zdjęcie skrzydła, wyśrodkowane w dzwonkowatym czubku, umieszczając dystalną część skrzydła po lewej stronie, a wewnętrzną część skrzydła po górnej stronie.
Otwórz obrazek z plamką czułkową dzwonkowatą pośrodku. Kliknij opcję Obraz, Wpisz 1, 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy. Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt.
Ustaw prawą stronę prostokąta tak, aby znajdowała się na prawo od plamki czułości dzwonka. Kliknij opcję Edycja, Zaznaczenie, Dodaj do menedżera, a następnie zaznacz kolumnę Pokaż wszystko. Następnie kliknij narzędzie kąta w narzędziach do zaznaczania linii.
Narysuj pierwszą linię na tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Ustaw lewe punkty końcowe linii na wierzchołku poprzednio narysowanego prostokąta. Narysuj drugą linię w górnej części prostokąta.
Naciśnij M, aby zmierzyć kąt między dwiema liniami narysowanymi w tym kroku. Kliknij okno obrazu na ekranie komputera. Kliknij Edycja, Zaznaczenie, Dodaj do menedżera.
Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu. Kliknij przycisk Edycja, Zaznaczenie, Obróć. Wpisz stopnie ujemne poprzednio zmierzonego kąta w kolumnie Kąt i kliknij przycisk OK, aby obrócić prostokąt narysowany w tym kroku.
Przesuń prostokąt narysowany za pomocą strzałek i ustaw punkt końcowy tylnej linii drugiej żyły podłużnej po lewej stronie prostokąta. A dolną stronę prostokąta przymocuj do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej. Upewnij się, że została narysowana prostopadła linia od punktu końcowego drugiej żyły podłużnej do tylnej linii trzeciej żyły podłużnej.
Zdefiniuj stopę prostopadłej linii jako punkt A.Zapisz współrzędną X i współrzędną Y punktu A, wskazanymi poniżej narzędzi wyboru obszaru podczas umieszczania kursora w punkcie A.Otwórz obraz z punktem A pośrodku. Kliknij opcję Obraz, Typ, 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na obraz 8-bitowy. Kliknij prostokąt w narzędziach do zaznaczania obszaru i narysuj prostokąt o rozmiarze około 1/9 okna obrazu.
Kliknij Edytuj, Zaznaczenie, Określ. Zaznacz opcję Kolumna owalna i wyśrodkowana. Wpisz 100 pikseli w kolumnach szerokości i wysokości.
Wpisz współrzędne X punktu A w kolumnie Współrzędna X i wpisz współrzędne Y punktu A w kolumnie Współrzędne Y, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie kliknij przycisk Analizuj i mierz. Jeśli kalibracja została już zakończona, OD są wskazane w kolumnie Średnia. Porównanie danych z wielu etapów wykazało, że etap P12 to czas wystąpienia pigmentacji, a pigmentacja kończy się w ciągu 12 godzin po ekluzji.
Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się ewolucyjną biologią rozwoju do badania różnic w rozwoju poczwarek i procesie pigmentacji wśród gatunków Drosophila.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokoły wyznaczania etapów rozwoju poczwarki oraz pomiaru pigmentacji skrzydeł u Drosophila guttifera. Metody te dostarczają wiedzy na temat mechanizmów rozwoju cech osobników dorosłych i umożliwiają porównania międzygatunkowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ewolucyjna biologia rozwoju
- Entomologia
- Genetyka
Wstęp
- Drosophila guttifera jest organizmem modelowym do badań nad biologią rozwoju.
- Zrozumienie wzorów pigmentacji może ujawnić adaptacje ewolucyjne.
- Określanie etapów okresu poczwarki jest kluczowe dla analizy procesów rozwojowych.
- Niniejsze badania można rozszerzyć na inne gatunki Drosophila.
Cel badania
- Określenie etapów okresów poczwarki Drosophila guttifera.
- Pomiar i ilościowe określenie pigmentacji skrzydeł.
- Badanie mechanizmów rozwojowych leżących u podstaw cech osobników dorosłych.
Zastosowane metody
- Usuwanie pupariów za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.
- Obserwacja poczek do oceny pigmentacji.
- Ilościowa analiza pigmentacji skrzydeł.
- Analiza porównawcza z innymi gatunkami Drosophila.
Główne wyniki
- Pomyślnie przeprowadzono wyznaczenie etapów rozwoju poczwarki.
- Ilościowe określenie pigmentacji skrzydeł dostarczyło cennych danych.
- Uzyskano informacje na temat rozwoju morfologicznego Drosophila.
- Metodę tę można zastosować do innych gatunków w celu przeprowadzenia badań porównawczych.
Wnioski
- Opracowane protokoły są skuteczne w badaniu rozwoju Drosophila.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia adaptacji ewolucyjnych w zakresie pigmentacji.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych studiów z dziedziny biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Precyzyjne określanie etapów okresu poczwarki oraz ilościowy pomiar pigmentacji skrzydeł u Drosophila guttifera umożliwiają rzetelne porównawcze badania rozwojowe, co wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Metody te dostarczają zestandaryzowanych, powtarzalnych wyników, które są kluczowe dla walidacji celów oraz analizy szlaków w biologii rozwoju ewolucyjnego. Przedstawione podejście zwiększa pewność prognostyczną w badaniach opartych na fenotypie oraz w analizach cech międzygatunkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szczegółowe określanie stadiów morfologicznych w celu doprecyzowania czasu rozwoju oraz momentu pojawienia się cech.
- Wspiera walidację funkcjonalną szlaków genetycznych wpływających na wzory pigmentacji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie zmiennych rozwojowych w różnych stadiach poczwarki.
- Zapewnia ilościowe ramy do testowania hipotez w badaniach nad ewolucją cech.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zestandaryzowane protokoły obrazowania i pomiarów w celu zapewnienia powtarzalności analiz fenotypowych.
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do porównań między różnymi warunkami i gatunkami.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych genetycznych lub farmakologicznych.
- Umożliwia niezawodną ocenę fenotypów pigmentacji w celu opracowania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie pomiarów cech rozwojowych z odkrywaniem biomarkerów translacyjnych w organizmach modelowych.
- Zapewnia ciągłość procesu, od wczesnej fazy odkryć po przedkliniczną walidację zależności fenotyp-genotyp.
- Dostarcza wartości prognostycznej dla oceny ryzyka w oparciu o cechy w badaniach porównawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnych etapów rozwoju po ilościową analizę fenotypową – wspierając identyfikację związków wiodących oraz wybór modeli przedklinicznych, gdy jest to właściwe.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących czasu rozwoju i pojawiania się cech.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary pigmentacji w celu przygotowania do analizy.
- Analityka: Dostarcza zestandaryzowane wyniki oparte na obrazach do porównań statystycznych między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie fenotypów rozwojowych do potencjalnych biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje przenośny protokół, który można dostosować do innych gatunków Drosophila oraz badań nad cechami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w analizie cech rozwojowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje etapy rozwoju i pomiary w celu zapewnienia powtarzalności oraz skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych danych ilościowych do walidacji cech.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów rozwojowych w oparciu o analizę ryzyka oraz badania porównawcze.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie etapowania morfologicznego i cyfrowej analizy obrazu.
- Niezbędny jest dostęp do stereomikroskopii, systemów obrazowania oraz oprogramowania analitycznego (np. ImageJ).
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności gromadzenia i analizy danych.
- Metoda jest dostosowalna do różnych gatunków Drosophila, przy wprowadzeniu niezbędnych modyfikacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują podatność odsłoniętych poczwarek na uszkodzenia oraz krytyczny dla czasu przebieg etapów obrazowania.
