Name: Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj prostą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego. Technika ta ułatwia analizę genetyczną nowotworów metodą sekwencjonowania nowej generacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy całemu personelowi medycznemu i pomocniczemu szpitala oraz pacjentom za zgodę na udział. Dziękujemy dr Gabrielle White Wolf z Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) za zredagowanie projektu tego raportu. Badanie to było wspierane przez Grant-in-Aid for Genome Research Project z prefektury Yamanashi (Y.H. i M.O.) oraz grant z The YASUDA Medical Foundation (Y.H.).

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Path+to+Cancer+-+Three+Strikes+and+You%27re+Out%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out.</a> N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).</li>
<li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome+atlas+pan-cancer+analysis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The cancer genome atlas pan-cancer analysis project.</a> Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li>
<li>Nagasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variant+discovery+by+deep+whole-genome+sequencing+of+1%2C070+Japanese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals.</a> Nat Commun. 6 (8018), (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genome+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer genome landscapes.</a> Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).</li>
<li>Zehir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+of+metastatic+cancer+revealed+from+prospective+clinical+sequencing+of+10%2C000+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients.</a> Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).</li>
<li>Garraway, L. A., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from the cancer genome.</a> Cell. 53 (1), 17-37 (2013).</li>
<li>Chalkley, R., Hunter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-histone+propinquity+by+aldehyde+fixation+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).</li>
<li>Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixation+on+the+amplification+of+nucleic+acids+from+paraffin-embedded+material+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction.</a> J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>Adhya, A. K., Mohanty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+touch+imprint+cytology+in+the+preoperative+diagnosis+of+malignancy+in+low+resource+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting.</a> Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).</li>
<li>Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+Imprint+Cytology+and+Frozen-section+Analysis+for+Intraoperative+Evaluation+of+Sentinel+Nodes+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer.</a> Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).</li>
<li>Sumiyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+intraoperative+touch+smear+cytology+in+breast-conserving+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery.</a> Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).</li>
<li>Amemiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+imprint+cytology+with+massively+parallel+sequencing+%28TIC-seq%29%3A+a+simple+and+rapid+method+to+snapshot+genetic+alterations+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors.</a> Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+multiple+lung+cancers%3A+Discrimination+between+primary+and+metastatic+lung+cancers+by+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile.</a> Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tumor-derived+DNA+dispersed+in+the+airway+improves+the+diagnostic+accuracy+of+bronchoscopy+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer.</a> Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono alternatywną metodę pozyskiwania DNA guza z klinicznych próbek patologicznych za pomocą TIC. Przygotowanie TIC jest bardzo proste i zajmuje mniej czasu w porównaniu z metodami FFPE, bez konieczności stosowania specjalnych instrumentów10. Wszystkie procedury, od przygotowania TIC do ekstrakcji DNA, można wykonać w ciągu dwóch dni (ryc. 1). Metoda ta skraca w ten sposób czas realizacji badań genetycznych. W szczególności zapewnia to znac...

Technologia sekwencjonowania nowej generacji zapewniła badaczom znaczący postęp w analizie informacji o genomie w wariantach genetycznych, chorobie Mendla, dziedzicznych predyspozycjach i nowotworach 1,2,3. Atlas Genomu Raka (TCGA) i Międzynarodowe Konsorcjum Genomu Raka (ICGC) dążą do identyfikacji zmian genetycznych w kilku typach powszechnych nowotworów4. Udało się zidentyfikować setki kluczowych genów odpowiedzialnych za raka, a niektóre z tych cząsteczek są celem badań nad lekami1,5,6.
W warunkach klinicznych, próbki FFPE są powszechnie używane do diagnozy patologicznej i testów molekularnych na różne choroby, w tym raka. Jednak podczas procesu utrwalania formaliną dochodzi do sieciowania DNA-białka lub DNA-DNA i indukowana jest fragmentacja DNA. W związku z tym próbki DNA FFPE nie zawsze nadają się do analizy genetycznej ze względu na niską jakość i ilość DNA7,8,9. Dodatkowo przygotowanie próbek FFPE zajmuje kilka dni, a do dokładnego przygotowania przekrojów niezbędne są umiejętności techniczne. Dlatego pożądane jest opracowanie prostej i szybkiej metody uzyskiwania wysokiej jakości nienaruszonego DNA.
Cytologia jest alternatywną metodą diagnozy patologicznej. Przygotowanie próbki cytologicznej jest prostszym, tańszym i szybszym podejściem w porównaniu z przygotowaniem FFPE10. Technika TIC jest wykonywana na wartowniczych węzłach chłonnych i tkankach brzeżnych od pacjentek z rakiem piersi w celu śródoperacyjnej szybkiej diagnozy od kilku lat11,12. Istnieje jednak kilka doniesień, w których zbadano, czy wysokiej jakości genomowe DNA można wyekstrahować z próbek TIC i wykorzystać do późniejszej analizy genetycznej. Próbki cytologiczne są zwykle barwione barwieniem Papanicolaou (Pap) lub Giemsa, a wcześniej informowaliśmy, że ilość i jakość DNA wyekstrahowanego z próbek TIC (zwłaszcza próbek barwionych metodą Giemsa) jest lepsza niż próbki uzyskane z tkanek FFPE13. W porównaniu z barwieniem cytologicznym, barwienie Giemsa ma tę zaletę, że wymaga mniejszej liczby procedur barwienia. W barwieniu cytologicznym, po utrwaleniu i wybarwieniu próbek, należy je zamontować za pomocą podłoża montażowego (np. Malinolu) w celu rozróżnienia zawartości próbki, takiej jak komórki nowotworowe, normalne komórki i komórki zapalne pod mikroskopem. Jeśli próbka Pap jest przygotowywana bez etapu montażu, prawie niemożliwe jest obserwowanie komórek pod mikroskopem, ponieważ próbka jest suszona. Dla porównania, barwienie Giemsa można zaobserwować w stanie wysuszonym, dlatego etap montażu nie jest konieczny do szybkiej oceny komórkowej. W przypadku mikrodysekcji barwienie Giemsa jest bardziej odpowiednie, ponieważ wymaga suchych próbek.
W tym raporcie przedstawiamy prostą i szybką metodę przygotowania próbek TIC z barwieniem Giemsa i pokazujemy, że TIC jest lepszym źródłem DNA w porównaniu z próbkami FFPE.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 mikro szkło ślizgowe</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane z membraną Arcturus PEN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A roztwór</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B roztwór</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>Maj-Grunwald Roztwór</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Giemsa</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw tkanek QIAamp DNA FFPE</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific 4444557</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do wykrywania RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan od FFPE DNA QC Test v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optyczna folia samoprzylepna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka jonowa Zestaw ilościowy TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td> Adaptery kodów kreskowych <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Zestaw 1-16 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View Zestaw sekwencjonowania (200 podstaw)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-dołkowy termocykler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Zestaw butelek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&handel; AMPure&handel; Zestaw XP Beckman</td><td>Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16-pozycyjny stojak magnetyczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofugowania, 1,5 ml (rurka o niskim poziomie wiązania)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Optyczne 96-dołkowe płytki reakcyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Przezroczysta folia samoprzylepna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&handel; Zestaw XP Beckman</td><td>Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (10M)</td> <td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td> Mini inkubator <td>wirówkowy</td></tr><tr>do<td>małych</td> wirówek <td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Inkubator powietrzny</td></tr><tr><td>SensiCare Bezpudrowe rękawice nitrylowe</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka MediCool</td><td></td><td>SANYO MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>PIÓRO DO PRZYCINANIA PIÓR</td><td></td><td>NR 130</td><td></td></tr><tr><td>PIÓRO DO PRZYCINANIA PIÓR</td><td></td><td>NR 260</td><td></td></tr><tr><td>PIÓRO S</td><td>PIÓRO</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Mieszalnik wirowy</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówka</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości dna guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Kluczowe jest określenie statusu mutacji w raku przed podaniem i leczeniem specyficznych leków molekularnych dla pacjentów z rakiem. W warunkach klinicznych tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie są szeroko stosowane do badań genetycznych. Jednak DNA FFPE jest na ogół uszkadzane i fragmentowane podczas procesu utrwalania formaliną. Dlatego DNA FFPE czasami nie nadaje się do badań genetycznych ze względu na niską jakość i ilość DNA. W artykule przedstawiamy metodę cytologii odcisku dotykowego (TIC) w celu uzyskania genomowego DNA z komórek nowotworowych, które można obserwować pod mikroskopem. Morfologię komórek i liczbę komórek nowotworowych można ocenić za pomocą próbek TIC. Co więcej, ekstrakcja genomowego DNA z próbek TIC może zostać zakończona w ciągu dwóch dni. Całkowita ilość i jakość DNA TIC uzyskanego tą metodą była wyższa niż DNA FFPE. Ta szybka i prosta metoda pozwala naukowcom uzyskać wysokiej jakości DNA do testów genetycznych (np. analizy sekwencjonowania nowej generacji, cyfrowego PCR i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym) oraz skrócić czas oczekiwania na raportowanie wyników.

Rysunek 1 przedstawia cały proces, od przygotowania preparatów TIC do ekstrakcji DNA. Co istotne, procedura uzyskania genomowego DNA z próbek TIC zajmuje tylko dwa dni. Oceniono wpływ przechowywania guza przed opracowaniem preparatów na szkiełkach. Stwierdzono, że komórki nowotworowe przylegały do szkiełka przedmiotowego, gdy preparaty tkankowe zostały natychmiast dotknięte do szkiełka oraz gdy tkanki były przechowywane w sterylnej gazie zwilżonej solą fizjol...

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej jakości DNA guza z próbek klinicznych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w naukach podstawowych i klinicznych, takich jak badania nad rakiem, diagnoza i decyzje dotyczące leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać DNA guza prościej i szybciej niż przy użyciu poprzednich metod.Aby rozpocząć protokół, należy kilkakrotnie dotknąć powierzchni guza wcześniej przygotowanej i wyciętej tkanki na normalnym szkiełku podstawowym rękami w rękawiczkach. Potwierdź wzrokowo, że dotykany obszar obejmuje ponad 80% szklanego szkiełka. Lekko dociśnij normalne szkiełko do szkiełka z naftalanu etylenu lub szkiełka z membraną PEN i delikatnie przetrzyj je dwa do trzech razy rękami w rękawiczkach.Potwierdź wzrokowo, że komórki są przenoszone z normalnego szkiełka do szkiełka membranowego PEN. Suszyć na powietrzu zarówno szkło, jak i szkiełka membranowe PEN przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu wybarwić normalne szkiełko do bezpośredniego badania cytologicznego.Zanurz szkiełka w roztworze utrwalającym na pięć sekund, a następnie zabarwiaj roztworem barwiącym Giemsa przez 15 sekund. Oceń i przeprowadź badania przesiewowe zawartości guza i komórek na normalnym szkiełku podstawowym całkowicie za pomocą mikroskopu w celu szybkiej oceny. Oceń komórki nowotworowe na podstawie kilku kryteriów.Jeśli próbka wykazuje komórkowość guza ponad 60% w wyniku szybkiej oceny mikroskopowej z poprzedniej sekcji, przeciąć dotkniętą guzem warstwę szkiełek membranowych PEN do ekstrakcji DNA nożem i rękami w rękawiczkach. Przenieś wyciętą folię do sterylnej probówki mikrowirówkowej z zestawem szpilek i rękami w rękawiczkach. Probówkę do mikrowirówki zawierającą film należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ekstrakcji DNA.Otwórz oprogramowanie i zaplanuj warunek uruchomienia oraz ustaw parametr uruchamiania w oprogramowaniu. Kliknij kartę plan i wybierz szablon, a następnie wybierz odpowiednią metodę uruchamiania. Wybierz aplikację i typ techniki, a następnie kliknij przycisk Dalej.Wybierz urządzenie, zestaw do przygotowania próbki, typ zestawu biblioteki, zestaw szablonów, zestaw do sekwencjonowania, podstawowy tryb kalibracji, typ chipa, sekwencję kontrolną i zestaw kodów kreskowych, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz wtyczki i kliknij dalej. Wybierz projekt i kliknij przycisk Dalej.Następnie wybierz domyślne pliki referencyjne i pliki BED regionu docelowego. Wpisz nazwę próbki, wybierz kod kreskowy i kliknij przycisk zaplanuj uruchomienie. Następnie należy wykonać przygotowanie szablonu i załadunek wiórów w automatycznym urządzeniu zgodnie z instrukcjami producenta.Przed użyciem rozmrozić wkład z odczynnikiem w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Rozcieńczyć nierozcieńczoną bibliotekę wodą wolną od nukleaz zgodnie ze stężeniem biblioteki obliczonym w kroku 6.8 i utworzyć 20 bibliotek pikomolarnych. Przygotuj bibliotekę w puli do sekwencjonowania i przechowuj ją na lodzie.Dodaj 25 mikrolitrów z puli za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów na dno probówki z próbką. Włącz zasilanie i otwórz pokrywę automatycznego instrumentu. Umieść chip sekwencjonujący, adapter chipa, wkład wzbogacający, wkład z końcówką, płytkę PCR, uszczelkę ramy PCR, probówkę odzyskiwania, kasetę z roztworem i kasetę z odczynnikiem w odpowiedniej pozycji automatycznego instrumentu.Dotknij, skonfiguruj, uruchom i krok po kroku na ekranie. Zamknij pokrywę i dotknij przycisku rozpocznij sprawdzanie na ekranie. Po zakończeniu skanowania pokładu dotknij przycisku Dalej.Sprawdź zawartość wyświetlacza, typ zestawu, identyfikator chipa, identyfikator próbki, typ chipa, plany. Ustaw godzinę i dotknij OK. Po zakończeniu ładowania chipa dotknij dalej i otwórz pokrywę. Wyjmij chip sekwencjonujący z adaptera chipa rękami w rękawiczkach.Umieść chip w pojemniku na wióry, owiń go parafilmem i przechowuj chip w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu reakcji sekwencjonowania. Następnie wyjmij wkład wzbogacający, płytkę PCR, uszczelkę ramy PCR, probówkę odzyskiwania, kasetę z roztworem i kasetę z odczynnikiem z odpowiedniej pozycji automatycznego instrumentu rękami w rękawiczkach. Przenieś pusty wkład z końcówką do pozycji końcówki odpadu w automatycznym narzędziu rękami w rękawiczkach.Dotknij dalej i zamknij pokrywę. Następnie dotknij start i wyczyść automatyczny instrument promieniami ultrafioletowymi przez cztery minuty. Rozpuść tabletkę chlorynu sodu w 1 000 mililitrach ultraczystej wody i przefiltruj roztwór filtrem 0,22 mikrona.Gdy przyrząd do sekwencjonowania się rozgrzeje, dotknij clean i dalej na ekranie przyrządu do sekwencjonowania. Wyczyść przyrząd do sekwencjonowania 250 mililitrami wysterylizowanego z filtrem roztworu chlorynu sodu, a następnie 250 mililitrami ultraczystej wody. Następnie dotknij przycisku inicjalizacji i wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania na ekranie.Zainstaluj szarego nadawcę z rękami w rękawiczkach. Zainicjuj przyrząd do sekwencjonowania roztworem do przemywania roztworem, roztworem do regulacji pH i roztworem wzorcowym pH. Następnie dodaj 20 mikrolitrów nukleotydów DATP, DGTP, DCTP i DTTP w 50-mililitrowych probówkach za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów.Zainstaluj szarego nadawcę w odpowiednim miejscu rękami w rękawiczkach. Załaduj rurkę o pojemności 50 mililitrów i przykręć ją do przyrządu do sekwencjonowania. Wybierz przycisk Dalej na ekranie, aby rozpocząć krok inicjalizacji.Po zakończeniu kroku inicjalizacji dotknij opcji uruchom na ekranie i wybierz odpowiednie narzędzie do przygotowywania biblioteki. Zeskanuj dwuwymiarowy kod kreskowy chipa. Włóż chip sekwencjonujący w odpowiedniej pozycji.Zamknij zacisk chipowy i drzwiczki przyrządu, a następnie dotknij przycisku sprawdzania chipów, a następnie OK na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie. Po reakcji sekwencjonowania przenieś dane i wykonaj potok analizy danych na serwerze sekwencjonowania. Bezwzględne ilości DNA i wartość RQ, wskaźnik poziomu degradacji genomowego DNA, pokazują, że wyższą wydajność DNA osiąga się przy użyciu próbek TIC w porównaniu z próbkami FFPE.Ponadto wartości RQ z DNA TIC były znacznie wyższe w porównaniu z wartościami DNA FFPE w różnych typach nowotworów. APC Q1367 * został zidentyfikowany zarówno w FFPE, jak i TIC DNA wyekstrahowanym z miejsca pierwszego, a APC S1356 * KRAS G12D i TP53 M237i wykryto zarówno w FFPE, jak i TIC DNA wyekstrahowanym z miejsca drugiego, trzeciego i czwartego, co sugeruje, że identyczne mutacje somatyczne zostały zidentyfikowane w sparowanych próbkach FFPE i TIC DNA przygotowanych z tego samego miejsca guza. Warto zauważyć, że te same mutacje somatyczne wykryto między pierwotnym rakiem jelita grubego a dwiema próbkami przerzutowego raka wątroby, co sugeruje, że klony guza z miejsca drugiego dały przerzuty do wątroby.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami molekularnymi i medycznymi w celu identyfikacji nowotworów genetycznych.

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną i efektywną strategię usuwania bio-cząsteczek obecnych w próbkach 'touch DNA', wraz z ulepszonym protokołem amplifikacji obejmującym jednoetapową 5 μl mikroobjętościową lizę/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie krótkich profili powtórzeń tandemowych (STR) dawcy (dawców) biocząstek.

Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.

Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Poznaj prostą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego. Technika ta ułatwia analizę genetyczną nowotworów metodą sekwencjonowania nowej generacji.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego (Wideo) | JoVE Journal

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Przeglądaj więcej filmów