Name: Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ! (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Odkryj metodę BLISS do wizualizacji dynamiki zdrewniałości w tkankach roślinnych za pomocą chemii kliknięć. Ta technika umożliwia różnicowanie nowo syntetyzowanej ligniny od istniejącej w próbce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Federacji Badawczej FRABio i platformie obrazowania TisBio (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tej pracy.

UWAGA: Płynne i stałe podłoża 1/2 MS muszą być przygotowane wcześniej, jak opisano w Tabeli Uzupełniającej 1.
1. Kultura roślin
<ol>
	<li>Uprawa 2-miesięcznych roślin lnu
	<ol>
		<li>Wysiewaj nasiona lnu (Linum usitatissimum L.) w plastikowych doniczkach za pomocą kompostu doniczkowego.</li>
		<li>Uprawiać len w komorach wzrostowych w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc.</li>
		<li>Wyposaż rośliny w podparcie pionowe po 1 miesiącu i rosną do 2 miesiąca życia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa 2-tygodniowych sadzonek lnu
	<ol>
		<li>Zawiń 12 nasion lnu w kawałek gazy serowej i przymocuj gumką, aby utworzyć wiązkę. 
		UWAGA: Kolejne kroki należy wykonać w sterylnych warunkach pod wyciągiem z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Umieść wiązkę nasion w uprzednio autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 250 ml.</li>
		<li>Dodaj 70 ml 70% EtOH do butelki i delikatnie mieszaj przez 1 minutę.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć EtOH przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.</li>
		<li>Dodaj 100 ml 2% podchlorynu sodu i delikatnie mieszaj przez 10 minut.</li>
		<li>Usunąć roztwór podchlorynu sodu przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Dodaj 100 ml sterylnej ultraczystej wody i mieszaj przez 1 minutę.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.2.8 3 razy, zwiększając czas płukania dla każdego płukania (5, 10 i 15 min).</li>
		<li>Ciepłe stałe podłoże 1/2 MS, wlać do sterylnego pudełka z kulturami roślinnymi na wysokość 2 cm i pozostawić do ostygnięcia do zestalenia.</li>
		<li>Delikatnie umieść każde nasiono na stałym podłożu za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
		<li>Zamknij sterylne pudełko.</li>
		<li>Przenieść pudełko do komory wzrostowej w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc i uprawiać sadzonki lnu przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metaboliczna inkorporacja reporterów chemicznych
UWAGA: Poniżej przedstawiono trzy modele eksperymentalne: i) metaboliczne znakowanie przekrojów poprzecznych łodyg, ii) całe łodygi i iii) siewki roślin. Każdy protokół jest przedstawiany dla jednej kontrpróby biologicznej, a ilości mogą być dostosowane do liczby wymaganych kontrprób biologicznych. Roztwory monolignolu przygotowuje się z roztworów podstawowych, które są sporządzane zgodnie z opisem w tabeli 2 przed doświadczeniem. Roztwory podstawowe mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C. Proporcje HAZ:GALK lub H:G można dostosować tak, aby pasowały do wszystkich niestandardowych projektów eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Chemiczne wbudowywanie reportera w 2-miesięczne przekroje łodyg lnu
	<ol>
		<li>Przygotować 300 μl chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do jednego dołka na 48-dołkowej płytce za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Przygotować 300 μl roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zwirować roztwór H/G i przenieść go do drugiego dołka na tej samej 48-dołkowej płytce.</li>
		<li>Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki.</li>
		<li>Delikatnie przygotuj 50 odręcznych przekrojów poprzecznych łodygi za pomocą żyletki (o grubości około 150-250 μm).</li>
		<li>Natychmiast umieść przekroje w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS w szkiełku zegarkowym.</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem HAZ/GALK.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.8 dla studzienki wypełnionej roztworem H/G (jako kontrola ujemna).</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.8 dla trzeciej studzienki wypełnionej 300 μl pożywki 1/2 MS (jako kontrola tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).</li>
		<li>Inkubować płytkę w ciągłym świetle w komorze wzrostowej w temperaturze 20 °C przez 20 godzin.</li>
		<li>Usunąć roztwór monolignolu z każdej studzienki za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemiczne włączenie reportera do 2-miesięcznych całych łodyg lnu
	<ol>
		<li>Przygotować 5 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.</li>
		<li>Przygotować 5 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zmieszaj roztwór H/G i przenieś go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.</li>
		<li>Przygotować trzecią szklaną probówkę zawierającą 5 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów z mikroskopii konfokalnej).</li>
		<li>Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki. Wyrzuć system korzeniowy i dolną część łodygi i przejdź do następnego kroku z górną częścią łodygi rośliny.</li>
		<li>Zanurzyć podstawę całego odciętego trzpienia w probówce zawierającej roztwór HAZ/GALK. Umieść łodygę w roztworze inkubacyjnym natychmiast po usunięciu systemu korzeniowego, aby zapobiec jej wysuszeniu. 
		UWAGA: Jeśli metoda jest stosowana do młodszych/starszych roślin i/lub innych gatunków, objętość roztworów monolignolu musi być dostosowana do wielkości/wieku rośliny i średnicy jej łodygi.</li>
		<li>Przymocuj trzpień do pionowego wspornika, aby utrzymać go prosto.</li>
		<li>Uszczelnij szklaną rurkę parafilmem, aby uniknąć parowania roztworu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.2.6-2.2.9 dla ujemnej próbki kontrolnej z roztworem H/G.</li>
		<li>Powtórzyć czynności 2.2.6-2.2.9 dla próbki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.</li>
		<li>Inkubuj każdą łodygę przez 20 godzin w ciągłym świetle za pomocą światła neonowego.</li>
		<li>Po 20 godzinach od inkorporacji metabolicznej usunąć łodygę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK i przepłukać ją 1/2 MS pożywki.</li>
		<li>Odetnij i wyrzuć dolny 1 cm łodygi za pomocą żyletki, a następnie przygotuj cylinder o wysokości 1 cm od podstawy pozostałej łodygi.</li>
		<li>Ostrożnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów poprzecznych (o grubości około 150-250 μm) z tego cylindra i natychmiast umieść je w szkiełku zegarkowym wypełnionym 1/2 MS medium.</li>
		<li>Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla łodygi kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla kontrolnej łodygi kontrolnej tła fluorescencji inkubowanej z pożywką 1/2 MS.</li>
		<li>Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemiczny reporter do 2-tygodniowych sadzonek lnu 
	UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w sterylnych warunkach.
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.</li>
		<li>Przygotować 2 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.</li>
		<li>Zmieszać roztwór H/G i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.</li>
		<li>Przygotować trzecią szklaną probówkę o wysokości 20 cm zawierającą 2 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).</li>
		<li>Delikatnie usuń 2-tygodniową sadzonkę lnu z twardego podłoża o stężeniu 1/2 MS za pomocą długiej pęsety (sekcja 1.2. powyżej).</li>
		<li>Delikatnie przenieś sadzonkę do probówki zawierającej roztwór HAZ/GALK, upewniając się, że jej korzenie są zanurzone w roztworze.</li>
		<li>Zamknij szklaną rurkę plastikową nakrętką, aby uniknąć parowania.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontroli ujemnej z roztworem H/G.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.</li>
		<li>Każdą sadzonkę inkubować w ciągłym świetle w komorze wzrostowej przez 20 godzin w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Sadzonkę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK delikatnie wyjąć i przepłukać 1/2 MS pożywki.</li>
		<li>Delikatnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów (o grubości około 150-250 μm) hipokotylu.</li>
		<li>Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla sadzonki kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla kontrolnej sadzonki fluorescencji tła inkubowanej z pożywką 1/2 MS.</li>
		<li>Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podwójne znakowanie fluorescencyjne próbek o przekroju poprzecznym roślin przez SPAAC i CuAAC
UWAGA: Protokół etykietowania BLISS jest identyczny dla wszystkich 3 modeli eksperymentalnych (sekcja 2).
<ol>
	<li>Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC)
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml roztworu SPAAC zawierającego 5 μM DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110 w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zwiruj roztwór i trzymaj go w ciemności.</li>
		<li>Po końcowych etapach przemywania w protokole inkorporacji metabolicznej [2.1.13, 2.2.21 lub 2.3.19 w zależności od wybranego schematu doświadczalnego], usunąć pożywkę 1/2 MS i dodać 300 μl roztworu SPAAC do dołka za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Osłoń 48-dołkową płytkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową lub umieszczając w pudełku.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej katalizowanej miedzią (CuAAC)
	<ol>
		<li>Umyj każdą studzienkę 4 razy, jak opisano w kroku 2.1.13, trzymając płytkę w ciemności.</li>
		<li>Przygotować 1 ml roztworu CuAAC zawierającego 2,5 mM askorbinianu sodu, 0,5 mMCuSO4 i 5 μM 3-azydku 5-TAMRA-PEG w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zmieszaj roztwór i trzymaj go w ciemności. 
		UWAGA: Ten roztwór CuAAC musi być świeżo przygotowany przed użyciem i nie może być przechowywany dłużej niż kilka dni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć 1/2 MS pożywki z każdej studzienki i bezpośrednio dodać 300 μl roztworu CuAAC do studzienki za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.</li>
		<li>Usunąć roztwór CuAAC za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór myjący. Powtórz dwa razy.</li>
		<li>Dodać 500 μl roztworu MeOH/woda o proporcji 7:3, mieszać w ciemności przez 1 godzinę, a następnie usunąć roztwór 
		UWAGA: Metanol jest toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest oznaczony jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Jego utylizacja wymaga zainstalowania dygestoriów i rękawic chemicznych.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór. Powtórz 4 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż próbek na szkiełkach mikroskopowych
<ol>
	<li>Umieść 5 kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Ostrożnie umieść każdy przekrój oznaczony HAZ/GALK na szkiełku.</li>
	<li>Nałóż lakier do paznokci po dwóch przeciwnych stronach szkiełka.</li>
	<li>Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Usuń nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.</li>
	<li>Uszczelnij próbkę lakierem do paznokci ze wszystkich 4 stron. Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (około 30 min).</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.1-4.6 dla przekrojów H/G kontroli ujemnej.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.6 dla przekrojów kontrolnych tła fluorescencyjnego.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu obserwacji pod mikroskopem konfokalnym. 
	UWAGA: Przygotowane preparaty można przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy w zależności od jakości preparatu. Jeżeli po przechowywaniu ma być dokonana nowa obserwacja, należy upewnić się, że próbki nie wyschły.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Włącz wszystkie niezbędne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej we właściwej kolejności, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wybierz żądany obiektyw z maksymalną aperturą numeryczną i dostosowanymi długościami fal wzbudzenia i emisji (np. obj. 60x, N.A. 1.2. Kanał autofluorescencyjny: λex 405 nm, λem 450 nm /25; Kanał SPAAC HAZ: Λex 488 nm, λem 525 nm /25; Kanał CuAAC GALK: Λex 561 nm, λem 595 nm /25 ; tryb sekwencyjny).</li>
	<li>Wybierz żądane parametry generowania obrazów w oprogramowaniu (wymagane 12- lub 16-bitowe, rozmiar piksela dostosowany do kryterium Nyquista).</li>
	<li>Umieścić szkiełko HAZ/GALK na stoliku mikroskopu i umieścić próbkę pod soczewką obiektywu.</li>
	<li>Obserwuj i znajdź żądany obszar tkanki roślinnej.</li>
	<li>Uzyskaj wysokiej jakości obrazy konfokalne podwójnie znakowanej próbki HAZ/GALK.
	<ol>
		<li>Wybierz najbardziej fluorescencyjną płaszczyznę na osi Z.</li>
		<li>Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, aby uzyskać optymalny rozkład sygnału w całym zakresie poziomów szarości dla każdego kanału (autofluorescencja, HAZ i GALK). Te same parametry muszą być stosowane w odniesieniu do wszystkich kolejnych przejęć.</li>
		<li>Uruchom pobieranie wybranego obrazu i zapisz plik. Powtórzyć te czynności dla każdego odpowiedniego obszaru próbki. 
		UWAGA: W razie potrzeby można również nabyć rekonstrukcje 3D Z-stack</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy nieoznakowanej próbki inkubowanej tylko w 1/2 MS w celu określenia poziomu autofluorescencji (kontrola tła fluorescencji, jak opisano w sekcji 2).</li>
	<li>Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy dla próbek kontroli ujemnej inkubowanych z natywnymi monolignolami H/G w celu określenia niespecyficznej adhezji fluoroforu do próbki.</li>
	<li>Zastosuj obróbkę danych do uzyskanych obrazów, aby odjąć sygnały autofluorescencji tła zarówno na obrazach kontroli ujemnej H/G, jak i obrazach HAZ/GALK.</li>
</ol>

<ol><li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+biological+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li>
<li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li>
<li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li>
<li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery%2C+architecture%2C+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li>
<li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li>
<li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li>
<li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334(2015).</li>
<li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li>
<li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li>
<li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Weng, J. -K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li>
<li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+lignins%3A+harnessing+the+plasticity+of+lignification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li>
<li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+the+way+for+lignin+valorisation%3A+recent+advances+in+bioengineering%2C+biorefining+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li>
<li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li>
<li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li>
<li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li>
<li>Späte, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li>
<li>Späte, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li>
<li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS%3A+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li>
<li>del Río, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+%28Linum+usitatissimum%29+fibers+and+shives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chemist%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li>
<li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li>
<li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li>
<li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/hfsg.2016.70.issue-9/hf-2015-0224/hf-2015-0224.xml">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li>
<li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+%CE%B2-d-galactoside+sialyltransferases+%28ST3Gal+I+and+ST6Gal+I%29+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%3A+Eur+J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jak wcześniej wspomniano, protokół podwójnego znakowania BLISS przedstawiony w tym artykule jest jednym z pierwszych przykładów kombinacji SPAAC/CuAAC in vivo 12,23. Każdy krok został dokładnie zoptymalizowany i zwalidowany, a bardzo ważne jest, aby przestrzegana była kolejność, w jakiej sekwencyjnie wykonywane są dwie reakcje znakowania chemicznego (tj. najpierw SPAAC, a następnie CuAAC). Wszystkie kontrole krzyżowe wykazały, że każdy etap etykietowania jest specyficzny, gdy stosowany jest protokół BLISS23 : przeprowadzenie etapu SPAAC najpierw prowadzi do wysoce chemoselektywnego znakowania funkcji azydku HAZ przez fluorofor funkcjonalizowany cyklooktyną poprzez [3+2] reakcję cykloaddycji z szybką kinetyką. Po oznaczeniu jednostek HAZ można przeprowadzić etap CuAAC wymagający katalizowanej miedzią (I) aktywacji końcowych alkinów GALK w celu wytworzenia wiązań triazolowych w reakcji z sondą azydkowo-fluorową 545. W przeciwieństwie do tego, odwrotna kolejność (tj. najpierw CuAAC, a następnie SPAAC) nie powinna być stosowana, ponieważ prowadzi to do sprzężenia krzyżowego jednostek GALK i HAZ, które konkuruje z ligacją fluoroforową i indukuje dramatyczną utratę sygnału. Ważne jest również, aby podkreślić konieczność stosowania pośrednich etapów prania, aby uniknąć niespecyficznych zabrudzeń.
Wykazaliśmy, że nasza metoda może być stosowana do różnych projektów eksperymentów biologicznych. Protokół znakowania BLISS został po raz pierwszy zastosowany do odręcznych przekrojów łodyg lnu (o grubości około 150-250 μm), które zostały wcześniej pocięte i inkubowane z monolignolami gotowymi do kliknięcia. Chociaż ten projekt ma tę zaletę, że minimalizuje potrzebne ilości reportera chemicznego (w miarę zmniejszania objętości inkubacji) i ułatwia produkcję kontrprób statystycznych, nie jest, ściśle mówiąc, systemem in vivo , a w niektórych przypadkach może nie odzwierciedlać wszystkich aspektów rzeczywistej dynamiki lignifikacji czasoprzestrzennej. W drugim projekcie eksperymentalnym dostosowaliśmy protokół BLISS do metody, która była wcześniej stosowana do badania wprowadzania znakowanych radioaktywnie monolignoli do sosny i miłorzębu27. W tym podejściu korzenie i łodyga rośliny są fizycznie oddzielone, a podstawa całej łodygi jest inkubowana w roztworze monolignolu w sposób, który można nazwać podejściem "wazon na kwiaty". Po pozostawieniu łodyg w pożądanym czasie (inkubacji) wycina się przekroje i wykonuje protokół BLISS. Pozwoliło nam to wykazać (i), że zmodyfikowane monolignole są transportowane przez żywą łodygę i są włączane do rosnących polimerów ligniny w ścianach komórkowych oraz (ii) że wzór lokalizacji był zasadniczo identyczny z podejściem opartym na przekroju poprzecznym. Ten rodzaj eksperymentu ma tę zaletę, że jest przeprowadzany w podejściu real living plant / live cell, co pozwala na dłuższe eksperymenty i bardziej dogłębne badania, ale wymaga większych ilości reportera chemicznego. Wreszcie, protokół BLISS został również wykorzystany w przypadku sadzonek roślin lnu, reprezentujących prawdziwy model żywej rośliny, w którym reportery chemiczne muszą zostać wchłonięte przez korzenie, zanim zostaną przetransportowane w górę łodygi. Chociaż model ten ma wyraźną zaletę polegającą na tym, że można go stosować na żywych roślinach, w praktyce ogranicza się on do młodych siewek i nie nadaje się do badania dynamiki zdrewnienia w starszych roślinach ze względów praktycznych (długi czas inkubacji, zwiększona ilość reporterów chemicznych). Niemniej jednak te trzy projekty eksperymentów są komplementarne i wszystkie mają swoje plusy i minusy w odniesieniu do aspektów praktycznych i znaczenia biologicznego, w zależności od rodzaju pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć.
Nasz protokół, opracowany w celu badania dynamiki zdrewnienia lnu, jest wysoce elastyczny, nie tylko pod względem projektu eksperymentu biologicznego, ale także pod względem jego zastosowania do innych gatunków roślin i organów/tkanek. Na przykład, BLISS można łatwo przenieść do rodzajów Arabidopsis lub Populus, które są bardziej podatne na badania z mutantami knock-out lub knock-down dla różnych genów. Zasadniczo, badania podwójnego znakowania z naszym podejściem można również rozszerzyć na inne biomolekuły przy użyciu dwóch odrębnych zmodyfikowanych prekursorów polimerów roślinnej ściany komórkowej - w tym wszystkich trzech głównych monolignoli lub ich prekursorów metabolicznych, a także różnych monosacharydów, które tworzą matrycę polisacharydową. Od samego początku chemia bioortogonalna została opracowana głównie w celu badania glikanów/polisacharydów za pomocą metabolicznej inżynierii oligosacharydowej (MOE)4,5,17,28, ale zaskakująco do tej pory było bardzo niewiele zastosowań w biologii roślin 7,8,9,10,11,12 . Jeśli chodzi o kompatybilność reakcji, badanie ligniny było rzeczywiście złożonym przypadkiem do rozwiązania, ponieważ oba reportery chemiczne są włączone do tego samego siatkowanego polimeru. Możliwość tworzenia się nieznakowanych usieciowań HAZ-G ALK była głównym problemem do pokonania ze względu na przestrzenną bliskość jednostek GALK i HAZ w strukturze 3D ligniny23, ograniczenie, które może nie występować, jeśli dwa reportery chemiczne nie są włączone do tego samego typu biopolimeru lub w tym samym regionie przestrzennym dowolnej komórki.
W szerszym zakresie metodologia BLISS może być zasadniczo zastosowana do dowolnego badania obrazowania fluorescencyjnego w dwóch kolorach na modelach bakteryjnych lub zwierzęcych przy użyciu dwóch odrębnych reporterów chemicznych opatrzonych odpowiednio znacznikiem azydkowym i końcowym alkinem.

W ciągu ostatnich dwóch dekad strategia reporterów chemicznych wyłoniła się jako potężna dwuetapowa metodologia badania dynamiki i funkcji biomolekuł niezakodowanych genetycznie.1,2,3 W tej strategii syntetyczny analog interesującej biomolekuły z niewielką modyfikacją – reporterem chemicznym – jest najpierw metabolizowany przez żywy organizm, a następnie sonda chemiczna (np. fluorofor do obrazowania w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej) jest kowalencyjnie łączona z wbudowanym reporterem za pomocą bioortogonalnej chemii klik. Sonda musi reagować szybko i specyficznie z wprowadzoną modyfikacją chemiczną, pozostając jednocześnie obojętną wobec wszelkich biomolekuł obecnych w żywym systemie. Pod wieloma względami metoda ta pokonuje ograniczenia powszechnych technik biokoniugacji dzięki zastosowaniu wysoce specyficznych ligacji chemii klik, co stwarza możliwość śledzenia metabolitów lub biomakrocząsteczek, które wcześniej były niedostępne w żywych systemach4,5,6.
Pomimo szybko rosnącej popularności tej potężnej metody w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych, doniesienia opisujące jej zastosowanie w biologii roślin są zaskakująco nieliczne i rzadkie7,8,9,10,11,12. Byliśmy szczególnie zainteresowani zastosowaniem tej strategii u roślin w celu zbadania powstawania ligniny, jednego z najpowszechniejszych biopolimerów na planecie i głównego składnika biomasy lignocelulozowej.13,14 Lignina jest polimerem fenolowym, który odgrywa kluczową rolę strukturalną i ochronną w rozwoju oraz życiu roślin wyższych.
Składa się on zazwyczaj z trzech jednostek 4-hydroksyfenylopropanoidowych: H (p-hydroksyfenylowej), G (guajacylu) i S (syringylu), pochodzących odpowiednio z trzech „monolignoli” (alkoholi p-kumarylowego, koniferylowego i sinapillowego), które są syntetyzowane w cytoplazmie komórki poprzez szlak fenylopropanoidowy (Rycina 1). Po transporcie do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym ulegają czysto chemicznym reakcjom sprzęgania rodnikowego, prowadząc do polimeryzacji w polimery ligniny; proces ten nazywa się lignifikacją.15,16 Chociaż ligniny mają silny wpływ na przemysłową waloryzację wielu produktów pochodzenia roślinnego, społeczność naukowa wciąż ma przed sobą długą drogę do rozszyfrowania złożonych mechanizmów regulujących lignifikację.
<img alt="Schemat biosyntezy ligniny: od fenyloalaniny do monolignoli, enzymy lakkazy, peroksydazy, ściana komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proces lignifikacji w komórkach roślinnych. Monolignole są biosyntetyzowane z fenyloalaniny w cytosolu. Po transporcie do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym ulegają czysto chemicznym reakcjom sprzęgania rodnikowego, polimeryzując do polimerów ligniny; proces ten nazywa się lignifikacją. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Choć doniesienia o wykorzystaniu reakcji bioortogonalnych do analizy glikanów są liczne,2,3,17 przykłady ich zastosowania w odniesieniu do innych typów biomolekuł są nieliczne. Wykorzystanie chemii bioortogonalnej do obrazowania ligniny zostało niedawno zainicjowane przez Tobimatsua et al.8 u Arabidopsis thaliana, aby dostarczyć informacji o włączaniu substytutów alkoholu koniferylowego do polimeru ligniny, w którym tworzą one jednostki G,8,9 wykazując tym samym dowód koncepcji, że strategie reporterów chemicznych są stosowalne w tym kontekście. Zastosowanie CuAAC zostało zilustrowane kilka miesięcy później przez Bukowskiego et al przy użyciu innego pochodnego alkoholu koniferylowego.9 Jednakże lignina zawiera również jednostki H i S, a głębsze zrozumienie procesu lignifikacji wymaga większej wiedzy na temat tego, jak wszystkie monolignole są włączane do polimeru oraz jakie czynniki mogą kontrolować jego skład. Nowe postępy w tej dziedzinie zależą obecnie od opracowania wydajnych metodologii pozwalających na jednoczesne śledzenie wielu reporterów chemicznych w systemach żywych. Mimo że w ostatnich latach kilka artykułów na temat glikanów położyło pod to podwaliny18,19,20,21,22, podejścia do podwójnego znakowania pozostają głównym wyzwaniem w chemii bioortogonalnej. Jeśli opracowanie powtarzalnego protokołu pojedynczego znakowania metodą click jest trudne, to podejścia do podwójnego znakowania, które wymagają tandemowej optymalizacji dwóch wzajemnie kompatybilnych reakcji bioortogonalnych dla dwóch oddzielnych reporterów chemicznych, są jeszcze trudniejsze. Nieliczne przykłady, które pioniersko podejdywały do tego aspektu, wykorzystywały kombinację cykloaddycji azydku z alkinem promowanej naprężeniem (SPAAC) oraz reakcji alkenu z tetrazyną w ramach odwróconego zapotrzebowania elektronowego w reakcji Dielsa-Aldera (DAinv) do badania glikanów w komórkach zwierzęcych. Uznaliśmy jednak, że bioortogonalność reakcji DAinv może nie być zagwarantowana w tym zastosowaniu ze względu na cechy strukturalne ligniny (która składa się z bogatych w elektrony podstawionych monomerów typu cynamylowego, mogących reagować z ubogimi w elektrony dienami, takimi jak sondy tetrazynowe stosowane w reakcjach DAinv), co może prowadzić do niespecyficznego znakowania. Dodatkowo reakcja DAinv wymaga uchwytów chemicznych, które są trudne do uzyskania syntetycznie, a ponadto są objętościowe i lipofilowe, co zwiększa prawdopodobieństwo, że szybkość wbudowywania, transport i/lub lokalizacja reportera chemicznego in vivo mogą zostać zaburzone. Ponieważ uznaliśmy, że ten ostatni aspekt jest szczególnie istotny w przypadku zastosowania chemii click do badania lignifikacji, wybraliśmy inny kierunek i opracowaliśmy Bioorthogonal Ligation Imaging Sequential Strategy (BLISS), wykorzystując kombinację cykloaddycji azydku z alkinem promowanej naprężeniem (SPAAC) oraz cykloaddycji azydku z alkinem katalizowanej miedzią (CuAAC) in vivo.23
Te dwie reakcje są w rzeczywistości dwoma głównymi bioortogonalnymi reakcjami typu click stosowanymi do tej pory, a w szczególności w kilku niedawno opublikowanych przykładach obrazowania ligniny.8,9 Nasza strategia podwójnego znakowania umożliwia zastosowanie grupy azydowej w jednym reporterze monolignolu i alkinu końcowego w drugim; są to dwie grupy funkcyjne, które i) nie reagują ze strukturami istotnymi biologicznie oraz ii) mają bardzo niewielki rozmiar (Rysunek 2). W rezultacie wpływ tych syntetycznych modyfikacji na właściwości fizykochemiczne badanej biomolekuły jest zminimalizowany, co ogranicza możliwe rozbieżności między nienaturalnymi a naturalnymi substratami monolignoli pod względem szybkości transportu i metabolizacji podczas etapu wbudowania metabolicznego. Chociaż połączenie SPAAC i CuAAC wydaje się na pierwszy rzut oka bardzo intuicyjne, z naszej wiedzy jest to dopiero drugi przykład podwójnego znakowania z wykorzystaniem tej strategii i pierwsze zastosowanie w strukturach innych niż glikany.12,23
<img alt="Proces znakowania polimeru ligniny z wykorzystaniem SPAAC i CuAAC; konfiguracja obrazowania mikroskopią konfokalną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia podwójnego znakowania BLISS. Reportery chemiczne HAZ i GALK są analogami znakowanymi natywnych monolignoli H i G. Są one najpierw włączane w rosnące polimery ligniny w ścianach komórkowych poprzez podawanie egzogenne (krok 1). Następnie fluorescencyjne sondy funkcjonalizowane cyklooktynem i azotkiem są sekwencyjnie łączone z włączonymi reporterami za pomocą bioortogonalnej chemii klik: reakcja SPAAC (krok 2) jest wysoce specyficzna dla jednostek HAZ, po której następuje reakcja CuAAC (krok 3) specyficzna dla jednostek GALK (krok 3), co umożliwia specyficzną lokalizację obu reporterów niezależnie w tej samej próbce. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W pierwszej kolejności zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy reporter monolignolu znakowanego azydkiem HAZ (zamiennik) p-alkohol kumarylowy i prekursor jednostek H ligniny), a następnie opracowano strategię podwójnego znakowania BLISS, w której jest on stosowany w połączeniu z wcześniej opisanym znakowaniem alkinyą GALK,9 (substytut alkoholu koniferylowego i prekursor jednostek G ligniny). W tym powtarzalnym protokole, opracowanym i przetestowanym na lnie, gatunku rośliny o dużym znaczeniu gospodarczym, podwójna metaboliczna inkorporacja HAZ i GALK do ligniny uzyskuje się w pierwszej kolejności, przed sekwencyjnym znakowaniem SPAAC/CuAAC. Tutaj znakowane HAZ jednostki są najpierw wyraźnie oznakowane poprzez ligacja SPAAC fluoroforu funkcjonalizowanego cyklooktynem, a następnie ligacja drugiej sondy fluorescencyjnej za pośrednictwem CuAAC na znaczniku GALK jednostki. Metodę tę zastosowano do zbadania dynamiki procesów lignifikacji w ścianach komórkowych roślin i można ją wykorzystać in vivo do przekrojów poprzecznych łodyg, żywych łodyg, jak również siewek różnych gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-(2-azydoetoksy)etoksy)etoksy)prop-1-en-1-ylo)fenol (<silny>HAZ)</td><td></td><td></td><td>Syntetyzowany jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td></tr><tr><td>(E)-4-hydroksy-3-propargyloksycynamylowy alkohol (<silny>GALK)</td><td></td><td></td><td>Zsyntetyzowane jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td></tr><tr><td>2% podchloryn</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>20 cm wysoka szklana rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Schott szklana butelka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr> 5<tr><td>/6-TAMRA-PEG3-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Gaza</td><td></td><td></td><td></td>serowa</tr><tr><td>Kompost zawierający glinę</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol igolinowy (G)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II) pentahydrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-5/6-Karboksyrodamina 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultraczysta woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nasiona lnu (L. usitatissimum L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&handel; Średni mikroskop elektronowy do montażu szkiełek</td><td>naukowych</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td></td><td></td><td></td>nakrywkowe</tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe szklane Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wzrostowa</td><td>CLF-Plant Klimatyzacja</td><td></td><td>Dla 2-tygodniowych upraw roślin</td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Angelantoni Nauki przyrodnicze</td><td></td><td>Dla 2-miesięcznych upraw roślin</td></tr><tr><td>Purpurowa roślina pudełko</td><td></td><td></td><td>hodowlane Dla 2-tygodniowej kultury sadzonek</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), pracuj w rękawiczkach pod kapturem</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lakier</td><td></td><td></td><td></td>do paznokci</tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Nikon A1R</td><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>orbitalna</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-Coumaryl alcohol (<silny>H</mocny>)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa nasadka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy garnek</td><td></td><td></td><td>Do uprawy roślin w wieku 2 miesięcy</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gumowa opaska</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>Sterylny zacisk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowe wsparcie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do cieczy i ciał stałych &frac12; MS średni</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4,7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4. H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiamina.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td><td></td>nikotynowy</tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: podwójne etykietowanie to bŁogoŚĆ!

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignina jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych biopolimerów na świecie i głównym składnikiem biomasy lignocelulozowej. Ten fenolowy polimer odgrywa istotną rolę strukturalną i ochronną w rozwoju i życiu roślin wyższych. Choć skomplikowane mechanizmy regulujące procesy zdrewnienia in vivo silnie wpływają na waloryzację przemysłową wielu produktów pochodzenia roślinnego, przed środowiskiem naukowym jeszcze długa droga do ich rozszyfrowania. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół podwójnego znakowania umożliwia badania bioobrazowe aktywnie zdrewniałych stref tkanek roślinnych, w prostym, trzyetapowym procesie pracy. Pierwszy etap polega na metabolicznym włączeniu dwóch niezależnych reporterów chemicznych, substytutów dwóch natywnych monolignolów, które dają początek jednostkom H i G ligniny. Po włączeniu do rosnących polimerów ligniny, każdy reporter jest następnie specjalnie znakowany własną sondą fluorescencyjną za pomocą sekwencyjnej kombinacji bioortogonalnych reakcji kliknięcia SPAAC/CuAAC. W połączeniu z autofluorescencją ligniny, podejście to prowadzi do wygenerowania trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i dostarcza precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnej maszynerii lignifikacyjnej w skali tkanek roślinnych, komórek i różnych warstw ściany komórkowej.

Dzięki zastosowaniu przedstawionego protokołu BLISS z wykorzystaniem syntetycznych analogów monolignoli i bioortogonalnej chemii klik, możliwe jest wizualizowanie dynamiki procesu lignifikacji w żywych roślinach. W przeciwieństwie do uznanych technik wizualizacji ligniny (takich jak barwienie histochemiczne, immunolokalizacja czy autofluorescencja), ten protokół „podwójnego kliknięcia” (double click) celuje wyłącznie w ligninę syntetyzowaną de novo podczas etapu wbudowy metabolicznej i odróżnia ją od istniejącej wcześniej ligniny w próbce za pomocą trójkanałowego obrazowania komórkowego metodą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3). Jednostki HAZ są wykrywane przy użyciu długości fal wzbudzenia i emisji DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110, która w etapie SPAAC specyficznie przyłącza się do funkcji azydowych wbudowanych cząsteczek HAZ (λex 501 nm /λem 526 nm, kanał zielony), podczas gdy jednostki GALK są w podobny sposób wykrywane przy charakterystycznych długościach fal sondy azidefluor 545, która w etapie CuAAC specyficznie przyłącza się do wbudowanych znaczników końcowego alkinu GALK (λex 546 nm /λem 565 nm, kanał czerwony); trzeci kanał odpowiada istniejącej wcześniej ligninie, która jest wykrywana przy użyciu jej wewnętrznej autofluorescencji przy 405 nm (kanał niebieski). Podejście to pozwala na generowanie trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin, które dostarczają precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnego aparatu lignifikacyjnego pomiędzy różnymi tkankami organu (Rysunek 3A), pomiędzy różnymi typami komórek w obrębie tej samej tkanki (Rysunek 3B-C) oraz w obrębie różnych warstw ściany tej samej komórki (Rysunek 3D). Innymi słowy, metodologia ta pozwala wyróżnić i specyficznie zlokalizować „aktywne” miejsca lignifikacji (kanały HAZ i GALK), odróżniając je od stref, w których lignina została utworzona na wcześniejszym etapie rozwoju rośliny (kanał autofluorescencji). Ponadto czułość tej techniki jest znacznie większa w porównaniu z autofluorescencją, co pozwala na wykrycie znacznie mniejszych ilości świeżo zsyntetyzowanej ligniny (Rysunek 3B).
<img alt="Mikroskopia przekroju tkanki roślinnej; obrazowanie fluorescencyjne; analiza struktury komórkowej; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazowanie wbudowanych chemicznych reporterów monolignoli w łodygach lnu. (A) Połowa wykonanego ręcznie przekroju poprzecznego łodygi lnu, obraz zrekonstruowany. (B) Powiększenie pierwszych warstw różnicującego się ksylemu. Panel lewy: autofluorescencja ligniny (niebieska, 405 nm), panel środkowy: nałożone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji HAZ (zielona, 526 nm), panel prawy: nałożone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji GALK (czerwona, 565 nm). Strzałka wskazuje pierwszą znakowaną ścianę komórkową od kambium, co ilustruje zwiększoną czułość metody BLISS w porównaniu z autofluorescencją. (C) Znakowanie w różnych typach komórek ksylemu wtórnego i (D) powiększenie komórek ksylemu wtórnego, ilustrujące różnice w znakowaniu w różnych warstwach tej samej ściany komórkowej. Panel lewy: nałożone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji HAZ (zielona, 526 nm), panel środkowy: nałożone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji GALK (czerwona, 565 nm), panel prawy: nałożone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski), HAZ (zielony) i GALK (czerwony). Ko-lokalizacja HAZ i GALK przedstawiona jest w kolorze żółtym. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
Strategie wykorzystujące raportery chemiczne, takie jak opisana tutaj metoda BLISS lub procedury pojedynczego znakowania opublikowane wcześniej przez Tobimatsu et al.8, pozwalają na znacznie dokładniejsze badania niż metody dostępne wcześniej, takie jak barwienia immunohistochemiczne lub histochemiczne, będąc jednocześnie bardzo prostymi w implementacji. Na przykład Rycina 4 ilustruje, że intensywność sygnału wbudowy HAZ/GALK w tracheidach/naczyniach włóknistych (FT) ksylemu wtórnego lnu jest bardzo wysoka w pierwszych kilku ścianach komórkowych od kambium, ale stopniowo maleje w starszych komórkach. Profil ten jest przeciwny do profilu autofluorescencji i wskazuje, że maksymalne zdrewnienie jest bardzo szybko osiągane w pierwszych dwóch do trzech warstwach komórek FT od kambium. W przeciwieństwie do tego, komórki promieniiste (R) zdają się kontynuować proces lignifikacji do znacznie późniejszych etapów rozwoju, ponieważ wbudowywanie HAZ/GALK jest znacznie bardziej stałe w ścianach wszystkich komórek od kambium do rdzenia. Nie jest zaskakujące, że typy komórek FT i R wykazują przeciwstawne dynamiki lignifikacji, ponieważ typy te pełnią różne role biologiczne, co wiąże się z różnicami w ich programie rozwojowym. FT to w istocie wydłużone rurki, które szybko dojrzewają i obumierają, pozostawiając martwe, puste komórki o grubych, zdrewniałych ścianach, które odgrywają kluczową rolę zarówno w podparciu mechanicznym, jak i w pionowym transporcie wody i minerałów, podczas gdy wąskie rzędy komórek R tworzące promienie ksylemu pozostają żywe w swoim dojrzałym i funkcjonalnym stanie, nie posiadając grubych, zdrewniałych ścian.
<img alt="Struktura tkanki roślinnej, obrazy mikroskopowe, wykresy danych z strefy kambialnej, analiza ksylemu i floemu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wbudowanie reporterów monolignoli specyficznych dla komórek w ksylemie lnu. Widok z mikroskopii konfokalnej w polu jasnym (A) fragmentu przekroju poprzecznego łodygi lnu wykonanego ręcznie. Różowe (komórki miąższu promieniowego, R) i żółte (komórki tracheid włóknistych, FT) strzałki wskazują wektory rozciągające się od strefy kambialnej w kierunku rdzenia, w których skanowano autofluorescencję ligniny przy 405 nm (B), fluorescencję HAZ przy 526 nm (C) oraz fluorescencję GALK przy 565 nm (D). (E) Widok ksylemu wtórnego. Panel lewy: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski), fluorescencji HAZ (zielony) i GALK (czerwony). Kolokalizacja HAZ i GALK przedstawiona jest kolorem żółtym. Panel prawy: schematyczna ilustracja struktury ksylemu wtórnego w łodydze lnu. V, naczynie; FT, tracheida włóknista; R, komórka miąższu promieniowego. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lion et al.23 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ponadto zastosowanie dwóch odrębnych reporterów chemicznych odpowiadających jednostkom H i G z dwiema reakcjami bioortogonalnymi w protokole BLISS pozwala na uzyskanie bardziej ilościowych wyników. Strategie znakowania multipleksowego, takie jak BLISS, mogłyby dostarczyć dodatkowych informacji na temat kontroli stosunków wbudowy monolignoli w różnych warunkach i mogłyby przyczynić się do odczytania nieuchwytnego procesu lignifikacji. Jeśli wzglutne procentowe zawartości monolignoli H, G i S w ligninach są rzeczywiście bardzo zmienne w zależności od gatunku, tkanki, wieku lub warunków środowiskowych rośliny, to złożone mechanizmy regulujące ten skład nie są jeszcze w pełni zrozumiane. Technologia podwójnego znakowania stanowi potężny sposób badania niektórych parametrów regulujących skład ligniny. Na przykład zmiana stosunku HAZ:GALK w protokole BLISS pozwoliła nam wykazać, że skład ligniny w tkankach ksylemu wtórnego zależy bezpośrednio od dostępności monolignoli w obrębie ścian komórkowych, a nie od specyficzności peroksydazy/lakazy (Rycina 5).
<img alt="Porównanie intensywności fluorescencji; obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy; analiza stosunku G-ALK do H-AZ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Efekt inkubacji przekrojów łodygi lnu z różnymi stosunkami procentowymi HAZ i GALK. Stosunki procentowe HAZ:GALK podano nad każdą kolumną rysunków. Góra: nałożone kanały HAZ i GALK. Dół: histogramy wskazujące średnią intensywność fluorescencji HAZ i GALK dla różnych stosunków procentowych. Wartości wyrażono jako średnia ze średniej intensywności fluorescencji w poziomach szarości ± SD. Pasek skali = 100 µm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Lion et al.23 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Len jest uprawiany dla jego włókien łykowych (BF), które są wykorzystywane do produkcji tekstyliów, papierów luksusowych lub ekologicznych materiałów kompozytowych. Ważnym aspektem ich waloryzacji przemysłowej jest to, że zawierają one bardzo niskie poziomy ligniny w ścianach komórkowych, które charakteryzują się niezwykle grubą wtórną warstwą S2/G19,24. Metoda BLISS pozwala wyróżnić różnice w dynamice lignifikacji pomiędzy różnymi warstwami tej samej ściany komórkowej. Rycina 6A pokazuje, że wbudowywanie reporterów HAZ i GALK ogranicza się do narożników komórek oraz lamelli środkowej/pierwotnej ściany komórkowej w niektórych, lecz nie we wszystkich włóknach łykowych. Całkowity brak lignifikacji w grubej warstwie wtórnej ściany komórkowej włókien łykowych, nawet po egzogennym dostarczeniu chemicznych reporterów monolignoli, wykazuje, że ich stan hipolignifikowany wynika z braku środowiska molekularnego odpowiedniego do enzymatycznie sterowanej oksydacji i wbudowywania monolignoli w rosnący łańcuch polimeru, a nie wynika on jedynie z regulacji transkrypcyjnej genów biosyntezy monolignoli, jak zgłoszono wcześniej25. Obserwacja ta koreluje również z faktem, że geny peroksydazy lnu są nadmiernie ekspresjonowane w zewnętrznych tkankach łodygi mutanta chemicznego lnu lbf1, który posiada z lignifikowanymi włókna łykowe26.
<img alt="Schemat mikroskopowy przedstawiający anatomię komórki roślinnej, z wyróżnieniem analizy struktury miękiszu i epidermy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: BLISS podkreśla różnice specyficzne dla podstruktury lub warstwy ściany komórkowej. (A) Panel lewy: obraz w jasnym polu przekroju łodygi lnu. Okrąg wskazuje pęczek włókien. Panel prawy: powiększenie włókien łykowych. Połączone kanały HAZ i GALK (z obrazem w jasnym polu i bez niego) wykazują, że lignifikacja jest ograniczona do naroży komórek (<img alt="Koncepcja stanu równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, ΣFy=0, przedstawiona na schemacie do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">) oraz blaszki środkowej/pierwotnej ściany komórkowej niektórych włókien łykowych. BF, włókno łykowe; Par, komórka miękiszu; M, blaszka środkowa; P, pierwotna ściana komórkowa; S1, pierwsza warstwa wtórnej ściany komórkowej; S2/G, warstwa wtórna/warstwa żelatynowa wtórnej ściany komórkowej. (B) Przekrój 2D i rekonstrukcja 3D powiększenia stosu z-stack z mikroskopu konfokalnego obszaru endodermy korzenia lnu. Pas Caspary’ego (<img alt="Koncepcja stanu równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, ΣFy=0, przedstawiona na schemacie do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">) wykazuje jedynie autofluorescencję i nie wbudowuje HAZ ani GALK. Powiązany fluorogram wykazuje antykorelację GALK/HAZ: wysoka zielona fluorescencja wiąże się z niskim sygnałem czerwonym (kora) i odwrotnie (endoderma). Perycykl (P), endoderma (E), kora (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wreszcie, ta dwukolorowa metodologia może dostarczyć cennych informacji na temat „stanu lignifikacji” podstruktur ścian komórkowych na różnych etapach rozwoju oraz w organach roślinnych innych niż łodyga. Na przykład endodermis korzeni lnu charakteryzuje się obecnością pasma Caspary'ego w radialnych i poprzecznych ścianach komórkowych podczas wczesnych etapów rozwoju. To pasmo hydrofobowego biopolimeru, składające się z suberyny i/lub ligniny, zapobiega pasywnemu przenikaniu wody i substancji rozpuszczonych pobieranych przez korzeń przez apoplast i wymusza ich przejście przez błonę plazmatyczną drogą symplastyczną, przyczyniając się tym samym do selektywnej zdolności pobierania substancji przez korzenie roślin. Zastosowanie naszej strategii w przypadku korzeni lnu wykazało, że HAZ i GALK są wbudowane w ściany styczne komórek endodermy, a także w części ścian radialnych, w których pasmo Caspary'ego nie występuje (Rycina 6B). Jednak całkowity brak wbudowania reporterów monolignoli w samym paśmie Caspary'ego wskazuje, że jest ono dojrzałe na tym etapie rozwoju, podczas gdy pozostałe ściany wciąż są miejscem dalszego osadzania biopolimeru. Zrekonstruowany widok 3D stosu obrazów z różnych płaszczyzn z (z-stack) wyraźnie uwidacznia pasmo Caspary'ego. Co ciekawe, ściany niektórych komórek kory przylegających do endodermy również okazały się zdolne do preferencyjnego wbudowywania HAZ (co wskazuje na obecność ligniny/suberyny w korze korzenia lnu), ale nie GALK. Analiza kolokalizacji wykazała antykorelację między HAZ a GALK, co sugeruje istnienie specyficznej dla komórek struktury ścian/machinerii enzymatycznej w tych dwóch sąsiadujących typach komórek.
Tabela uzupełniająca 1: Przygotowanie stałej pożywki ½ MS <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Przygotowanie roztworów zapasowych reporterów chemicznych <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Ogólnym celem tej metodologii podwójnego znakowania jest obserwacja aktywnie zdrewniałych stref tkanek roślinnych. W tym przepływie pracy strategia reportera chemicznego jest stosowana przy użyciu dwóch odrębnych reporterów chemicznych w sekwencyjnej kombinacji bioortogonalnych reakcji chemicznych typu click. Metoda ta może pomóc w rozszyfrowaniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii roślin, takich jak określenie, jakie czynniki regulują przestrzenne lub czasowe tworzenie ligniny w roślinach i ścianach.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona ukierunkowana wyłącznie na ligninę, która jest wytwarzana podczas inkorporacji metabolicznej. Odróżnia ją od wszelkich istniejących wcześniej ligniny w próbce. Chociaż pierwotnie opracowaliśmy tę metodę do badania flag lignifikacji, można ją stosować z innymi gatunkami, takimi jak rzodkiewnik, topola, a nawet każda inna roślina wytwarzająca ligninę.Aby zaprezentować tę technikę, mamy Clemence'a Simona, który jest doktorantem pracującym na styku chemii i biologii, i który używa tej techniki do badania dynamiki lignifikacji. Najpierw przygotuj 300 mikrolitrowy chemiczny roztwór reporterowy zawierający dziesięć mikromüllerów znakowanego alkinem G reportera. I dziesięć mikromüllerów znakowanego azydkiem reportera H i płynnego sterylnego podłoża 1/2 MS.Zwirować roztwór i przenieść go do jednego dołka na 48-dołkowej płytce za pomocą pipety transferowej. Przygotować 300 mikrolitrów roztworu kontroli ujemnej zawierającego dziesięć mikromüllerów G i dziesięć mikromüllerów H oraz płynną sterylną pożywkę 1/2 MS. Zwiruj roztwór i przenieś go do drugiego dołka na tej samej 48-dołkowej płytce.Za pomocą czystej żyletki odetnij łodygę dwumiesięcznej rośliny lnu na wysokości dziesięciu centymetrów nad poziomem gleby. Starannie przygotuj 50 swobodnych przekrojów poprzecznych łodygi za pomocą żyletki i natychmiast umieść je w podłożu 1/2 MS. Następnie wybierz nienaruszone, całe przekroje i losowo rozprowadź dziesięć z nich w studzience wypełnionej chemicznym roztworem reporterowym, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.Przekroje poprzeczne muszą być cięte mocno i czysto, a przekrój musi być prosty. Potrzebujesz pewnej ręki i ostrej żyletki, aby utrzymać tkanki w stanie nienaruszonym. Zaleca się wcześniejsze ćwiczenie.Po rozprowadzeniu dziesięciu nienaruszonych odcinków w roztworze kontroli ujemnej, inkubować płytkę w ciągłym świetle w komorze wzrostowej w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Następnego dnia usunąć roztwór monolignalu z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS do każdej studzienki i delikatnie mieszaj przez dziesięć minut.Następnie usuń roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Przygotować jeden mililitr roztworu cykloaddycji azydkowo-alkinowej promowanego szczepem. Zawiera pięć mikromüllerów barwnika fluorescencyjnego znakowanego cyklooktenem i płynną sterylną pożywkę 1/2 MS.Następnie zwiruj roztwór. Po końcowych etapach przemywania w protokole inkorporacji metabolicznej, usunąć pożywkę 1/2 MS i dodać 300 mikrolitrów roztworu SPAAC do każdej studzienki za pomocą mikropipety. Osłoń 48-dołkową płytkę przed światłem, umieszczając ją w pudełku.Następnie delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia. Następnie umyj każdą studzienkę cztery razy 1/2 MS podłoża, jak opisano wcześniej, trzymając płytkę w ciemności. Przygotuj jeden mililitr katalizowanego miedzią roztworu cykloaddycji alkinowej azydku zawierającego askorbinian sodu, siarczan miedzi i barwnik fluorescencyjny znakowany azydkiem oraz płynne sterylne podłoże 1/2 MS.Następnie zwiruj roztwór. Po usunięciu pożywki 1/2 MS umieścić płytkę w pudełku i dodać 300 mikrolitrów roztworu CuAAC do każdej studzienki za pomocą mikropipety. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.Wyjąć płytkę z wytrząsarki mechanicznej i usunąć roztwór CuAAC z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS i mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez dziesięć minut w ciemności. Po dwukrotnym przemyciu pożywką 1/2 MS dodaj do każdej studzienki 500 mikrolitrów roztworu metanolu i wody w proporcji 7:3.Mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności. Następnie usuń roztwór z dołków. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS do każdej studzienki i mieszaj w ciemności przez dziesięć minut.Po czterokrotnym powtórzeniu tego prania, przekroje poprzeczne należy przechowywać w podłożu o stężeniu 1/2 MS, chronić przed światłem. Umieść pięć kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym. Następnie ostrożnie umieść każdy przekrój poprzeczny oznaczony reporterem chemicznym na szkiełku.Nałóż lakier do paznokci po dwóch przeciwnych stronach szkiełka. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Następnie usuń nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.Następnie uszczelnij próbkę lakierem do paznokci ze wszystkich czterech stron. Po wyschnięciu lakieru do paznokci przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do czasu obserwacji pod mikroskopem konfokalnym. Sekcje roślin mają tendencję do chrupania po wyschnięciu.Upewnij się, że zawsze trzymasz je w roztworze i uszczelniasz szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci ze wszystkich stron. Wydłuża to okres trwałości zamontowanych szkiełek. Umieść szkiełko z próbką na stoliku mikroskopowym pod soczewką obiektywu.Obserwuj i obracaj próbkę, aby zidentyfikować pożądany obszar tkanki roślinnej. Następnie wybierz najbardziej fluorescencyjną płaszczyznę na osi Z. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, aby uzyskać optymalny rozkład sygnału w całym zakresie poziomu szarości dla każdego kanału.Na koniec uzyskaj wysokiej jakości obrazy konfokalne. BLISS zapewnia trzy kolorowe mapy lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin, celuje wyłącznie w ligninę wytwarzaną in novo podczas inkorporacji metabolicznej i odróżnia ją od wcześniej istniejącej ligniny w próbce. Podkreśla aktywne miejsca zdrewnienia w różnych tkankach narządu, w różnych typach komórek tkanki lub w różnych warstwach ścian lub podstrukturach komórki.Znakowane alkinami profile inkorporacji reporterowej G i azydkowe H od kambium do rdzenia w wtórnym ksylemie lnu wskazują, że maksymalne zdrewnienie jest szybko osiągane w tracheidach włókien podczas rozwoju, podczas gdy komórki rasowe nadal zawierają ligninę na znacznie późniejszych etapach swojego życia. Zmiana proporcji reporterów chemicznych pokazuje, że skład ligniny w drugorzędowych tkankach ksylemu jest bezpośrednio zależny od dostępności monolignalu w ścianach komórkowych. A nie na swoistości peroksydazy lub lakkazy podczas polimeryzacji ligniny.Włączenie reportera chemicznego jest ograniczone do rogów komórek i środkowej blaszki pierwotnej ściany komórkowej niektórych, ale nie wszystkich włókien łykowych. W korzeniach lnu reportery chemiczne są wbudowane w ściany komórek endodermalnych, w których nie ma pasma Caspara. W celu lepszej wizualizacji architektury tkankowej można również generować rekonstrukcje stosu 3D Z.Po tym wizualnym można również przeprowadzić kompleksowe przetwarzanie danych. Przy zachowaniu wszelkich środków ostrożności możliwe jest uzyskanie stałych wyników poprzez porównanie względne, odczyt próbki między różnymi próbkami. Można to zrobić jako dodatek do lokalizacji aktywnego prowadzenia różnych obszarów.Ta metoda jest wspaniałym narzędziem dla biologów roślin, takich jak ja, którzy badają ścianę komórkową. Gdy już to opanujesz, możesz to zrobić w kilka godzin. Jest bardzo czuły i może być stosowany do wielu różnych eksperymentalnych systemów modelowych in vitro in vivo.Zastosowanie strategii reportera chemicznego do ligniny toruje biologom chemicznym drogę do zbadania dynamiki lignifikacji i dowiedzenia się, co kontroluje ten proces polimeryzacji, który pod wieloma względami nadal stanowi niezbadane terytorium.

visualizing-lignification-dynamics-plants-with-click-chemistry-dual

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

W tym filmie opisujemy technikę barwienia Wiesnera do barwienia ligniny obecnej w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych. Ta technika barwienia pomaga uwidocznić zdrewniałe ściany komórkowe w łodygach Arabidopsis thaliana i pomaga określić ilościowo zdrewnienie w ścianach komórkowych różnych typów komórek.

Barwienie Wiesnera do wizualizacji ligniny: technika barwienia złogów ligniny obecnych w łodygach Arabidopsis thaliana

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Odkryj metodę BLISS do wizualizacji dynamiki zdrewniałości w tkankach roślinnych za pomocą chemii kliknięć. Ta technika umożliwia różnicowanie nowo syntetyzowanej ligniny od istniejącej w próbce.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Przeglądaj więcej filmów