Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Ogólnym celem tej metodologii podwójnego znakowania jest obserwacja aktywnie zdrewniałych stref tkanek roślinnych. W tym przepływie pracy strategia reportera chemicznego jest stosowana przy użyciu dwóch odrębnych reporterów chemicznych w sekwencyjnej kombinacji bioortogonalnych reakcji chemicznych typu click. Metoda ta może pomóc w rozszyfrowaniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii roślin, takich jak określenie, jakie czynniki regulują przestrzenne lub czasowe tworzenie ligniny w roślinach i ścianach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona ukierunkowana wyłącznie na ligninę, która jest wytwarzana podczas inkorporacji metabolicznej. Odróżnia ją od wszelkich istniejących wcześniej ligniny w próbce. Chociaż pierwotnie opracowaliśmy tę metodę do badania flag lignifikacji, można ją stosować z innymi gatunkami, takimi jak rzodkiewnik, topola, a nawet każda inna roślina wytwarzająca ligninę.

Aby zaprezentować tę technikę, mamy Clemence'a Simona, który jest doktorantem pracującym na styku chemii i biologii, i który używa tej techniki do badania dynamiki lignifikacji. Najpierw przygotuj 300 mikrolitrowy chemiczny roztwór reporterowy zawierający dziesięć mikromüllerów znakowanego alkinem G reportera. I dziesięć mikromüllerów znakowanego azydkiem reportera H i płynnego sterylnego podłoża 1/2 MS.

Zwirować roztwór i przenieść go do jednego dołka na 48-dołkowej płytce za pomocą pipety transferowej. Przygotować 300 mikrolitrów roztworu kontroli ujemnej zawierającego dziesięć mikromüllerów G i dziesięć mikromüllerów H oraz płynną sterylną pożywkę 1/2 MS. Zwiruj roztwór i przenieś go do drugiego dołka na tej samej 48-dołkowej płytce.

Za pomocą czystej żyletki odetnij łodygę dwumiesięcznej rośliny lnu na wysokości dziesięciu centymetrów nad poziomem gleby. Starannie przygotuj 50 swobodnych przekrojów poprzecznych łodygi za pomocą żyletki i natychmiast umieść je w podłożu 1/2 MS. Następnie wybierz nienaruszone, całe przekroje i losowo rozprowadź dziesięć z nich w studzience wypełnionej chemicznym roztworem reporterowym, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.

Przekroje poprzeczne muszą być cięte mocno i czysto, a przekrój musi być prosty. Potrzebujesz pewnej ręki i ostrej żyletki, aby utrzymać tkanki w stanie nienaruszonym. Zaleca się wcześniejsze ćwiczenie.

Po rozprowadzeniu dziesięciu nienaruszonych odcinków w roztworze kontroli ujemnej, inkubować płytkę w ciągłym świetle w komorze wzrostowej w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Następnego dnia usunąć roztwór monolignalu z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS do każdej studzienki i delikatnie mieszaj przez dziesięć minut.

Następnie usuń roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Przygotować jeden mililitr roztworu cykloaddycji azydkowo-alkinowej promowanego szczepem. Zawiera pięć mikromüllerów barwnika fluorescencyjnego znakowanego cyklooktenem i płynną sterylną pożywkę 1/2 MS.

Następnie zwiruj roztwór. Po końcowych etapach przemywania w protokole inkorporacji metabolicznej, usunąć pożywkę 1/2 MS i dodać 300 mikrolitrów roztworu SPAAC do każdej studzienki za pomocą mikropipety. Osłoń 48-dołkową płytkę przed światłem, umieszczając ją w pudełku.

Następnie delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia. Następnie umyj każdą studzienkę cztery razy 1/2 MS podłoża, jak opisano wcześniej, trzymając płytkę w ciemności. Przygotuj jeden mililitr katalizowanego miedzią roztworu cykloaddycji alkinowej azydku zawierającego askorbinian sodu, siarczan miedzi i barwnik fluorescencyjny znakowany azydkiem oraz płynne sterylne podłoże 1/2 MS.

Następnie zwiruj roztwór. Po usunięciu pożywki 1/2 MS umieścić płytkę w pudełku i dodać 300 mikrolitrów roztworu CuAAC do każdej studzienki za pomocą mikropipety. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.

Wyjąć płytkę z wytrząsarki mechanicznej i usunąć roztwór CuAAC z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS i mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez dziesięć minut w ciemności. Po dwukrotnym przemyciu pożywką 1/2 MS dodaj do każdej studzienki 500 mikrolitrów roztworu metanolu i wody w proporcji 7:3.

Mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez godzinę w ciemności. Następnie usuń roztwór z dołków. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki 1/2 MS do każdej studzienki i mieszaj w ciemności przez dziesięć minut.

Po czterokrotnym powtórzeniu tego prania, przekroje poprzeczne należy przechowywać w podłożu o stężeniu 1/2 MS, chronić przed światłem. Umieść pięć kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym. Następnie ostrożnie umieść każdy przekrój poprzeczny oznaczony reporterem chemicznym na szkiełku.

Nałóż lakier do paznokci po dwóch przeciwnych stronach szkiełka. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Następnie usuń nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.

Następnie uszczelnij próbkę lakierem do paznokci ze wszystkich czterech stron. Po wyschnięciu lakieru do paznokci przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do czasu obserwacji pod mikroskopem konfokalnym. Sekcje roślin mają tendencję do chrupania po wyschnięciu.

Upewnij się, że zawsze trzymasz je w roztworze i uszczelniasz szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci ze wszystkich stron. Wydłuża to okres trwałości zamontowanych szkiełek. Umieść szkiełko z próbką na stoliku mikroskopowym pod soczewką obiektywu.

Obserwuj i obracaj próbkę, aby zidentyfikować pożądany obszar tkanki roślinnej. Następnie wybierz najbardziej fluorescencyjną płaszczyznę na osi Z. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, aby uzyskać optymalny rozkład sygnału w całym zakresie poziomu szarości dla każdego kanału.

Na koniec uzyskaj wysokiej jakości obrazy konfokalne. BLISS zapewnia trzy kolorowe mapy lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin, celuje wyłącznie w ligninę wytwarzaną in novo podczas inkorporacji metabolicznej i odróżnia ją od wcześniej istniejącej ligniny w próbce. Podkreśla aktywne miejsca zdrewnienia w różnych tkankach narządu, w różnych typach komórek tkanki lub w różnych warstwach ścian lub podstrukturach komórki.

Znakowane alkinami profile inkorporacji reporterowej G i azydkowe H od kambium do rdzenia w wtórnym ksylemie lnu wskazują, że maksymalne zdrewnienie jest szybko osiągane w tracheidach włókien podczas rozwoju, podczas gdy komórki rasowe nadal zawierają ligninę na znacznie późniejszych etapach swojego życia. Zmiana proporcji reporterów chemicznych pokazuje, że skład ligniny w drugorzędowych tkankach ksylemu jest bezpośrednio zależny od dostępności monolignalu w ścianach komórkowych. A nie na swoistości peroksydazy lub lakkazy podczas polimeryzacji ligniny.

Włączenie reportera chemicznego jest ograniczone do rogów komórek i środkowej blaszki pierwotnej ściany komórkowej niektórych, ale nie wszystkich włókien łykowych. W korzeniach lnu reportery chemiczne są wbudowane w ściany komórek endodermalnych, w których nie ma pasma Caspara. W celu lepszej wizualizacji architektury tkankowej można również generować rekonstrukcje stosu 3D Z.

Po tym wizualnym można również przeprowadzić kompleksowe przetwarzanie danych. Przy zachowaniu wszelkich środków ostrożności możliwe jest uzyskanie stałych wyników poprzez porównanie względne, odczyt próbki między różnymi próbkami. Można to zrobić jako dodatek do lokalizacji aktywnego prowadzenia różnych obszarów.

Ta metoda jest wspaniałym narzędziem dla biologów roślin, takich jak ja, którzy badają ścianę komórkową. Gdy już to opanujesz, możesz to zrobić w kilka godzin. Jest bardzo czuły i może być stosowany do wielu różnych eksperymentalnych systemów modelowych in vitro in vivo.

Zastosowanie strategii reportera chemicznego do ligniny toruje biologom chemicznym drogę do zbadania dynamiki lignifikacji i dowiedzenia się, co kontroluje ten proces polimeryzacji, który pod wieloma względami nadal stanowi niezbadane terytorium.