Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Ogólnym celem tej epifluorescencyjnej przyżyciowej mikroskopii wideo lub protokołu IVM naczyń krwionośnych jest wizualizacja i ilościowe określenie toczenia i adhezji leukocytów w skorodowanych tętnicach w nadciśnieniu indukowanym angiotensyną II u myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w patologii dysfunkcji naczyń krwionośnych i nadciśnienia tętniczego, takie jak mechanizm interakcji między leukocytami, a w szczególności lizosomami i komórkami dodatnimi, a pracą naczyń. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zobaczyć interakcje in vivo między krążącymi komórkami krwi a zrozumieniem naczyniowym.

Przygotować samca myszy do operacji po siedmiu dniach leczenia angiotensyną za pomocą pompy osmatycznej zgodnie z tekstem protol. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić je podczas zabiegu. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej na płytce chirurgicznej o temperaturze 39 stopni Celsjusza i włóż sondę doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę.

Użyj bawełnianego wacika do rozprowadzenia i wcieraj krem do depilacji w szyję, aż włosy zaczną wypadać. Następnie, po dodatkowych 2 minutach, użyj szpatułki, aby usunąć włoski i krem. Następnie zdezynfekuj skórę za pomocą alkoholowego środka antyseptycznego do skóry.

Następnie pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj podłużne nacięcie o długości od 1 do 1,5 cm w skórze szyi, 1 cm od tchawicy. Następnie wykonaj 2 prostopadłe nacięcia na obu końcach pierwszego nacięcia. Ostrożnie usuń tkankę znajdującą się tuż pod skórą i usuń kawałek skóry pokrywający lewą żyłę szyjną i tchawicę.

Następnie użyj dwóch zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie odizolować skorodowane gruczoły podjęzykowe i podszczękowe od strefy zainteresowania. Uważając, aby nie przeciąć ani nie uszkodzić gruczołów, ustaw je tak, aby umożliwić najlepszy dostęp do żyły szyjnej i korridów. Następnie, aby wyizolować żyłę szyjną, włóż cienkie kleszcze między naczynie a otaczającą tkankę i powoli otwieraj i zamykaj instrument, aby delikatnie uwolnić żyłę z tkanki.

Gdy żyła szyjna jest całkowicie czysta, umieść kleszcze pod naczyniem i umieść pod nim dwa szwy 7-0 o długości 10 cm. Zawiąż dwa węzły, aby zamknąć szew proksymalnie do głowy, a drugim szwem przygotuj jeden węzeł, ale go nie zamykaj. Teraz z kleszczami w jednej ręce przytrzymaj cewnik wypełniony sterylną solą fizjologiczną o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie drugą ręką użyj nożyczek lub zakrzywionej igły o rozmiarze 26, aby wykonać małe nacięcie w naczyniu.

Włóż cewnik do żyły szyjnej i zamknij węzeł dwa razy. Następnie zamknij szew proksymalny do głowy nad cewnikiem, aby zapewnić całkowite unieruchomienie. Aby wyizolować i przygotować skorodowane tętnice, użyj cienkich zakrzywionych kleszczy, aby wypreparować obszar pokrywający tchawicę.

Następnie, gdy skorodowane ciała są wolne od otaczających tkanek, usuń nerw vegas z naczynia bez jego przecinania, powoli zamykając i otwierając cienkie kleszcze, jeśli to konieczne, aby delikatnie zmobilizować nerw. Gdy obie tętnice są całkowicie czyste, umieść kleszcze pod pierwszą skorodowaną tętnicą i uważając, aby nie rozciągnąć nadmiernie naczynia, umieść pod naczyniem mały,, plastikowy uchwyt na naczynie o wymiarach 3 mm na 2,5 cm. Po umieszczeniu uchwytu naczynia na miejscu upewnij się, że występuje przepływ krwi.

Aby uniknąć rozciągania naczynia, ręka operatora powinna poruszać się tak mało, jak to możliwe, jednym ruchem pierwszych kleszczy, aby odizolować skorodowaną tętnicę i przy pomocy drugich kleszczy, aby zrobić otwór pod naczyniem. Gdy uchwyt naczynia jest prawidłowo ustawiony, umieść drugą tętnicę nad urządzeniem. Jeśli mysz nie zostanie umieszczona bezpośrednio pod mikroskopem, umieść gruczoły z powrotem nad tchawicą i zastosuj sterylną sól fizjologiczną o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby uniknąć wysuszenia strefy.

W strzykawce o pojemności 1 ml przygotować 1-4 rozcieńczenie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej roztworu podstawowego 2 mg na ml rozmrożonego pomarańczy akrydynowej. Chronić strzykawkę przed światłem. Aby przeprowadzić pomiary, umieść mysz pod szybkim, szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu kondensatora dalekiego zasięgu i 10-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie z monochromaterem, rozdzielaczem wiązki i kamerą CCD.

Uzyskuj obrazy w czasie rzeczywistym, skupiając obiektyw w środku skorodowanej tętnicy na powierzchni śródbłonka. Powoli wstrzyknąć 50 ml pomarańczy akrydyny. Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało 100 obrazów, z czasem naświetlania 120 milisekund na zdjęcie.

Nagraj cztery filmy na skorodowaną tętnicę w różnych miejscach tętnicy dla każdego filmu. Jeśli sygnał fluorescencyjny zmniejszy się, wstrzyknij kolejne 50 ml pomarańczy akrydynowej. Aby przetestować różne warunki, wstrzyknij oranż akrydynowy bezpośrednio do bocznej żyły ogonowej, jeśli nie został wprowadzony cewnik szyjny, i przeprowadź tę samą akwizycję obrazu.

Jako kontrolę, zapisz pomiary kwiatostanu od niewstrzykniętych myszy lys-Mcre-dodatnich, IRG-dodatnich. Określ ilościowo komórki toczące się i przylegające w prostokącie o wymiarach 200 mikronów na 250 mikronów umieszczonym w środku naczynia dla każdego filmu, wyświetlanego z prędkością 10 obrazów na sekundę. Policz komórki toczące się i przylegające.

Komórki przylegające definiuje się jako komórki, które nie poruszają się ani nie odłączają od śródbłonka w ciągu 10-sekundowego filmu. Aby uprościć kwantyfikację, usuń kanał z czerwoną fluorescencją i używaj tylko zielonej fluorescencji do liczenia toczących się i przylegających komórek. W tym badaniu zaobserwowano skorodowane myszy z dodatnim wynikiem lys-mCre, IRG-dodatnim, którym podawano angiotensynę 2, przy użyciu IVM.

Jak widać na początku badania, obecność cewnika szyjnego powodowała adhezję komórek fluorescencyjnych lys-M-dodatnich. Po wstrzyknięciu pomarańczy akrydynowej komórki śródbłonka również były fluorescencyjne. Następnie, redukcja tła w celu ograniczenia fluorescencji związanej ze śródbłonkiem, ujawniła, że wszystkie jądrzaste przylegające komórki były lys-M dodatnie.

W tym eksperymencie, po tygodniu infuzji angiotensyny 2, interakcje śródbłonka leukocytów w skorodowanych tętnicach myszy lis-M Cre-dodatnich IRG-dodatnich zostały zobrazowane i uwidocznione za pomocą IVM, z lub bez wstrzyknięcia pomarańczy akrydyny, przez cewnik szyjny lub przez żyłę ogonową. Bez cewnika lub wstrzyknięcia, zwijanie się komórek dodatnich lys-M znacznie się zwiększyło po infuzji angiotensyny 2 w porównaniu z nieleczonymi myszami. Zwiększono również przyczepność.

Wstrzyknięcie pomarańczy akrydynowej za pomocą cewnika szyjnego zwiększyło adhezję i zwijanie się u myszy leczonych angiotensyną 2 w większym stopniu w porównaniu z myszami bez cewnika. Wreszcie, jak widać w tych panelach, wstrzyknięcie pomarańczy akrydynowej do żyły ogonowej prowadzi do podobnej adhezji i toczenia się w porównaniu z myszami, które nie otrzymały wstrzyknięcia pomarańczy akrydynowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w trzydzieści minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać, aby nie uszkodzić tkanek otaczających naczynia. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się układem sercowo-naczyniowym i hemostazą do badania leukocytów i adhezji płytek krwi do ściany naczyniowej in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ograniczyć wpływ wstrzykiwania barwnika i operacji w IVM.

Nie zapominaj, że praca z interkalacyjnymi barwnikami fluorescencyjnymi może być niezwykle niebezpieczna, a kontakt skóry z barwnikiem należy unikać przy użyciu odpowiedniego materiału, takiego jak rękawiczki.