Izolacja i charakterystyka mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie i scharakteryzowanie mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli pęcherzyków egzokomórkowych lub mikrocząstek w komunikacji komórka-komórka w różnych procesach fizjologicznych, w tym w raku, stanach zapalnych i gojeniu się ran. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest stosunkowo szybka, opłacalna i pozwala na ocenę składu p'henotypowego mikrocząstek lub mikropęcherzyków w aktywach funkcjonalnych.

Procedurę zademonstrują Ariel Finkielsztein, adiunkt w moim laboratorium, oraz Joseph Lee, student w moim laboratorium. W celu separacji gradientu gęstości mysich komórek polimorfonulicznych szpiku kostnego lub PMN, najpierw powoli ułóż trzy mililitry świeżo przygotowanego roztworu o temperaturze pokojowej 1,077 grama na mililitr na trzy mililitry świeżo przygotowanego roztworu o temperaturze pokojowej 1,119 grama na mililitr roztworu o gęstości w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów na próbkę komórek szpiku kostnego. Następnie nałóż jeden mililitr świeżo wyizolowanych komórek szpiku kostnego w lodowatym PBS na górną warstwę gradientu gęstości każdej probówki i oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości.

Pod koniec separacji ostrożnie usunąć warstwy komórek jednojądrzastych na granicy faz między PBS a warstwami gradientu górnej gęstości w każdej probówce, nie naruszając pasm PMN. Za pomocą pipety transferowej zbierz warstwy PMN do jednej nowej probówki o pojemności 15 mililitrów na próbkę i doprowadź końcową objętość w każdej probówce do 15 mililitrów za pomocą przefiltrowanego PBS o wielkości 0,1 mikrona. Granulować PMN przez odwirowanie, a następnie drugie odwirowanie w dwóch mililitrach świeżo przefiltrowanego PBS na probówkę.

Następnie ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżo przefiltrowanego PBS w celu zliczenia. Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach przefiltrowanego HBSS o wielkości 0,1 mikrona, uzupełnionego interesującym stymulantem na 10 milionów komórek. Inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec stymulacji zebrać komórki przez odwirowanie i przenieść bezkomórkowe supernatanty do jednej nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 militera na próbkę. Odwirować supernatanty, aby usunąć wszelkie resztki komórek, i przenieść oczyszczone supernatanty do nowych probówek ultra-wirówek, a następnie ultra-odwirować supernatanty i przechowywać granulowane mikrocząstki w ultra-wirówkach uszczelnionych parafiną w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy eksperymentalnej. Aby podać mikrocząsteczki do okrężnicy myszy, najpierw umieść w pełni znieczuloną mysz w pozycji leżącej i użyj kleszczy do biopsji i endoskopu wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości, aby wygenerować od trzech do pięciu powierzchownych ran wzdłuż grzbietowej strony okrężnicy.

Wróć mysz do klatki z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. 24 godziny później użyj endoskopu, aby uzyskać obrazy zadanych ran w znieczuleniu. Następnie użyj systemu mikroiniekcji opartego na kolonoskopii, aby podać eksperymentalną objętość mikrocząstek PMN ponownie zawieszonych w 100 mikrolitrach HBSS bezpośrednio do każdego miejsca rany.

Niejednorodność wielkości mikrocząstek PMN można ocenić, porównując mikrocząstki ze znanymi kulkami cytometrii przepływowej. Jak wykazano, ekspresję interesujących białek przez mikrocząstki można również badać za pomocą cytometrii przepływowej. W tym eksperymencie ekspresję kluczowych cząsteczek zapalnych i przeciwzapalnych przez stymulowane aktywatorem mikrocząstki pochodzące z PMN oceniano za pomocą immunoblot.

Wpływ mikrocząstek PMN na gojenie się komórek nabłonka można monitorować poprzez akwizycję obrazu monowarstw nabłonka zranionych przez zadrapania w określonych punktach czasowych in vitro, a także po zranieniu kleszczykami biopsyjnymi in vivio. Po opanowaniu, mikrocząstki pochodzące z PMN można wyizolować w ciągu czterech godzin, jeśli technika zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przed stymulacją PMN powinien być przechowywany na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji i utracie mikrocząstek.

Zgodnie z tą procedurą, cytometria przepływowa, immunoblotting i techniki reakcji proliferacji w czasie rzeczywistym mogą być wykorzystane do określenia zawartości mikrocząstek, w różnych warunkach stymulujących lub z różnych komórek pochodzenia. Technika ta jest przydatna do badania roli udziału mikrocząstek w regulacji odpowiedzi immunologicznej, funkcji bariery, uszkodzeniu i naprawie tkanek, a także w progresji raka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i oznaczać mysie mikrocząstki oraz wykorzystywać mikrocząstki w funkcjonalnym zasobie gojenia ran in vivo.

Nie zapominaj, że praca z żywymi zwierzętami może być niebezpieczna, a środki ostrożności sugerujące, że przed wykonaniem tej procedury należy zawsze założyć środki ochrony osobistej i ukończyć odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa.