In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Śledzenie pojedynczych cząsteczek in vivo na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila. Technika ta opisuje, w jaki sposób pojedyncze białka mogą być śledzone i obrazowane in vivo na zakończeniach nerwów ruchowych larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na obrazowanie, śledzenie i lokalizowanie pojedynczych białek w wysokich rozdzielczościach podobnych do obserwowanych w systemach in vitro.

Projekt transgenicznej Drosophila. Interesujące białko synaptyczne jest znakowane fotokonwertowalnym fluoroforem, który ulega ekspresji w Drosophila melanogaster. Preparacja larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Umieść wędrującą larwę w trzecim stadium na cylindrycznej lub półcylindrycznej podstawie Sylgarda. Dodaj 40 mikrolitrów pożywki dla owadów Schneidera na larwę. Pod mikroskopem preparacyjnym wbij maleńką szpilkę w głowę, a drugą w ogon larwy, aby ją unieruchomić.

Aby zapewnić dostęp, użyj maleńkiej szpilki, aby wykonać wąskie nacięcie na linii środkowej grzbietowej strony okolicy brzusznej larwy. Od tego miejsca nacięcia, za pomocą nożyczek sprężynowych, tnij wzdłuż ściany ciała w przednim tylnym kierunku. Usuń narządy wewnętrzne z larwy za pomocą drobnych kleszczy i nożyczek sprężynowych.

Umyj wypreparowaną larwę pożywką Schneidera Insect Medium. Wbij dwie maleńkie szpilki przez każdą z dwóch klap ścianki ciała, aby uzyskać wypreparowany preparat larwy w kształcie sześciokąta. Użyj nożyczek sprężynowych, aby odłączyć mózg larwy od brzusznego rdzenia nerwowego.

Za pomocą zakrzywionej pęsety wciśnij maleńkie szpilki w podstawę Sylgarda. Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywowaną śledzeniem pojedynczych cząstek. Odwróć podstawę Sylgard larwy na naczynie hodowlane ze szklanym dnem wypełnionym dwoma mililitrami pożywki dla owadów Schneidera o temperaturze pokojowej.

Nalej wodę na obiektyw 63-krotnego zanurzenia w wodzie mikroskopu ELYRA PS.1, a następnie umieść naczynie na stoliku. Włącz przechodzące światło i za pomocą okularu zlokalizuj larwę na podstawie Sylgard za pomocą obiektywu pneumatycznego 10x. Przełącz się na obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w wodzie i zidentyfikuj mięsień szósty, korzystając z jasnego oświetlenia pola.

Korzystając z oprogramowania ZEN Black Acquisition, wybierz konfigurację Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) (Całkowita fluorescencja wewnętrznego odbicia, TIRF). Przełącz laser 488 nm, aby wyświetlić eMos2 w kolorze zielonym. Zlokalizuj połączenia nerwowo-mięśniowe, które wyglądają jak koraliki na sznurku, i uzyskaj obraz TIRF o niskiej rozdzielczości, jednocześnie włącz laser 405-nanometrowy i laser 561-nanometrowy, aby dokonać fotokonwersji i zobrazować czerwone gatunki eMos2.

Wykorzystaj bardzo niską moc lasera dla lasera 405 nm, aby umożliwić umiarkowanie stałe stochastyczne fotokonwersje. W tym przypadku laser 405-nanometrowy działa z prędkością 0,09%podczas gdy laser 561-nanometrowy działa z prędkością 50%W opcjach kąta TIRF w oprogramowaniu lekko przesuń kąt krytyczny TIRF. Ustaw czas naświetlania na 30 milisekund.

Uzyskaj serię czasową obrazów połączenia nerwowo-mięśniowego. W tym przypadku uzyskano film o długości 15 000 klatek. Zapisz film jako plik w formacie czi.

analiza danych. Analizuj pozyskane filmy za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego do śledzenia pojedynczych molekular. Zlokalizuj współrzędne x i y każdej lokalizacji białka fluorescencyjnego za pomocą dopasowania Gaussa funkcji rozrzutu punktu intensywności.

Aby prześledzić trajektorię każdej lokalizacji, należy ustawić próg co najmniej ośmiu ciągłych różnych wyglądów klatek dla każdej lokalizacji i maksymalnie trzy piksele mobilności między każdą klatką. Uzyskaj obraz trajektorii, średnie przemieszczenie kwadratowe, a także współczynnik dyfuzji wszystkich śledzonych lokalizacji. Reprezentatywne wyniki.

Wykreślono średnie kwadratowe przemieszczenie poszczególnych trajektorii Syntaxin-1A-eMos2 z wielu połączeń nerwowo-mięśniowych u trzech różnych larw, jako średnią plus minus błąd standardowy średniej. Wykreślono również obszar pod krzywą przemieszczenia średniokwadratowego. Współczynnik dyfuzji Syntaksyny-1A-mEos2 został podobnie uzyskany z wielu połączeń nerwowo-mięśniowych i wykreślony jako histogram względnego rozkładu częstości.

Próg współczynnika dyfuzji ujawnił dwie populacje Syntaksyny-1A, populację ruchomą i populację nieruchliwą. Obliczono stosunek populacji ruchomych do nieruchomych Syntaxin-1A-mEos2. Konkluzja. Ten film powinien dostarczyć informacji, w jaki sposób można śledzić pojedyncze białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila.

Technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się komunikacją neuronalną wizualizację i obserwację ruchliwości i organizacji pojedynczych białek w wysokich rozdzielczościach in vivo.