Name: Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę hybrydowej analizy strukturalnej białek z użyciem krystalografii rentgenowskiej i SAXS. Technika ta umożliwia modelowanie dynamicznych regionów Nsa1 z S. cerevisiae niewidocznych w krystalografii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dane dyfrakcyjne zostały zebrane na liniach badawczych Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID i 22-BM w Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Dane z projektu SAXS zostały zebrane na linii badawczej SIBYLS w Advance Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Serdecznie dziękujemy pracownikom linii badawczej SIBYLS za pomoc w zdalnym gromadzeniu i przetwarzaniu danych. Jesteśmy wdzięczni Grupie Badawczej i Wsparcia Spektrometrii Mas Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) za pomoc w określeniu granic domen białkowych. Prace te były wspierane przez amerykański National Institute of Health Intramural Research Program; Amerykański Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) (ZIA ES103247 do R. E. S.) oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR, 146626 do MCP). Wykorzystanie APS było wspierane przez Departament Energii USA, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych w ramach kontraktu nr W-31-109-Eng-38. Wykorzystanie Zaawansowanego Źródła Światła (ALS) było wspierane przez Dyrektora Biura Nauki Biura Podstawowych Nauk o Energii Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w ramach umowy nr 1. DE-AC02-05CH11231. Dodatkowe wsparcie dla linii badawczej SIBYLS SAXS pochodzi z projektu MINOS (R01GM105404) realizowanego przez Narodowy Instytut Zdrowia oraz S10OD018483 grantu High-End Instrumentation Grant. Chcielibyśmy również podziękować Andrei Moon i dr Sarze Andres za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

<ol><li>Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+biogenesis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).</li>
<li>Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Puzzle+of+Life%3A+Crafting+Ribosomal+Subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits.</a> Trends Biochem Sci. , (2017).</li>
<li>Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+preribosomal+RNA+processing+pathways+in+yeast%2C+plant+and+human+cells+-+focus+on+coordinated+action+of+endo-+and+exoribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases.</a> FEBS Lett. , (2017).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19879902">Driving ribosome assembly.</a> Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).</li>
<li>Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA+ATPase+Rix7+powers+progression+of+ribosome+biogenesis+by+stripping+Nsa1+from+pre-60S+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles.</a> J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).</li>
<li>Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA-ATPase+NVL2+acts+on+MTR4-exosome+complex+to+dissociate+the+nucleolar+protein+WDR74%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophy+Res+Co%22%5BJournal%5D)">AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74.</a> Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).</li>
<li>Maserati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr74+is+required+for+blastocyst+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse.</a> PLoS One. 6 (7), e22516(2011).</li>
<li>Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+noncoding+regulatory+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer.</a> Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).</li>
<li>Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+Reveals+Features+of+Ribosome+Assembly+Factor+Nsa1%2FWDR74+Important+for+Localization+and+Interaction+with+Rix7%2FNVL2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2.</a> Structure. 25 (5), 762-772 (2017).</li>
<li>Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+hybrid%3A+EM%2C+crystallography%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Go hybrid: EM, crystallography, and beyond.</a> Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).</li>
<li>Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+flexible+proteins+using+small-angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering.</a> J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).</li>
<li>Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+expression+and+purification+problems+of+RhoGDI+using+a+family+of+%22parallel%22+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres+Purif%22%5BJournal%5D)">Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors.</a> Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).</li>
<li>Doublie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+selenomethionyl+proteins+for+phase+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination.</a> Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallography+for+aspiring+crystallographers+or+how+to+avoid+pitfalls+and+traps+in+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination.</a> FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision-making+in+structure+solution+using+Bayesian+estimates+of+map+quality%3A+the+PHENIX+AutoSol+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>McCoy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+structures+of+protein+complexes+by+molecular+replacement+with+Phaser%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser.</a> Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Dyer, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SAXS+for+the+characterization+of+biomolecules+in+solution%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach.</a> Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).</li>
<li>Forster, S., Apostol, L., Bras, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?s0021889810008289">Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering.</a> J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).</li>
<li>Petoukhov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+the+ATSAS+program+package+for+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).</li>
<li>Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?ks5004">PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).</li>
<li>Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0087">Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria.</a> J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).</li>
<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+mass%2C+models+and+resolution+by+small-angle+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering.</a> Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+rigid+body+modeling+of+macromolecular+complexes+against+small-angle+scattering+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data.</a> Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).</li>
<li>Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889895007047">CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates.</a> J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).</li>
<li>Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://pymol.org">https://pymol.org</a> (2015).</li>
<li>Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26841758">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+in+proteins%3A+impact+of+the+crystal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment.</a> Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).</li>
<li>Shtykova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+influenza+A+virus+matrix+protein+M1+and+its+self-assemblies+at+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH.</a> PLoS One. 8 (12), e82431(2013).</li>
<li>Mallam, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structures+of+DEAD-box+RNA+chaperones+reveal+conformational+changes+and+nucleic+acid+tethering+by+a+basic+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).</li>
<li>Papaleo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Protein+Loops+and+Linkers+in+Conformational+Dynamics+and+Allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery.</a> Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).</li>
<li>Rozycki, B., Boura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large%2C+dynamic%2C+multi-protein+complexes%3A+a+challenge+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology.</a> J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).</li>
<li>Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+structural+biology+to+unravel+molecular+mechanisms+of+protein-RNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition.</a> Methods. 118, 119-136 (2017).</li>
<li>Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Functional+Dynamics+of+Modular+Multidomain+Proteins+by+SAXS+and+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR.</a> Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z tego protokołu, wygenerowano rekombinowany Nsa1 z S. cerevisiae do badań strukturalnych zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS. Nsa1 zachowywał się dobrze w roztworze i krystalizował w wielu formach krystalicznych. Podczas optymalizacji tych kryształów odkryto, że C-koniec Nsa1 jest wrażliwy na degradację proteazy. Rombowa forma kryształu o wysokiej rozdzielczości mogła być zduplikowana tylko z wariantami C-końca Nsa1, prawdopodobnie dlatego, że elastyczny C-koniec Nsa1 zapobie...

Rybosomy to duże maszyny rybonukleoproteinowe, które pełnią zasadniczą rolę translacji mRNA na białka we wszystkich żywych komórkach. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, które są wytwarzane w złożonym procesie zwanym biogenezą rybosomów1,2,3,4. Składanie rybosomów eukariotycznych opiera się na pomocy setek podstawowych czynników składania rybosomów2,3,5. Nsa1 (Nop7 associated 1) jest eukariotycznym czynnikiem składania rybosomów, który jest szczególnie wymagany do produkcji dużej podjednostki rybosomalnej6 i jest znany jako WD-repeat zawierający 74 (WDR74) w organizmach wyższych7. Wykazano, że WDR74 jest niezbędny do tworzenia blastocyst u myszy8, a promotor WDR74 jest często mutowany w komórkach rakowych9. Jednak funkcja i dokładne mechanizmy Nsa1/WDR74 w składaniu rybosomów są nadal w dużej mierze nieznane. Aby rozpocząć odkrywanie roli Nsa1/WDR74 podczas dojrzewania rybosomów eukariotycznych, przeprowadzono wiele analiz strukturalnych, w tym krystalografię rentgenowską i rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)10.
Krystalografia rentgenowska, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), mikroskopia elektronowa i SAXS są ważnymi technikami do badania struktury makromolekularnej. Rozmiar, kształt, dostępność i stabilność makrocząsteczek wpływa na metodę biologii strukturalnej, do której dana makrocząsteczka będzie najlepiej dopasowana, jednak łączenie wielu technik za pomocą tak zwanego podejścia "hybrydowego" staje się coraz bardziej korzystnym narzędziem11. W szczególności krystalografia rentgenowska i SAXS są potężnymi i uzupełniającymi się metodami oznaczania strukturalnego makrocząsteczek12.
Krystalografia dostarcza struktur atomowych o wysokiej rozdzielczości, począwszy od małych cząsteczek, a skończywszy na dużych maszyneriach komórkowych, takich jak rybosom, i doprowadziła do licznych przełomów w zrozumieniu biologicznych funkcji białek i innych makrocząsteczek13. Co więcej, projektowanie leków w oparciu o strukturę wykorzystuje moc struktur krystalicznych do dokowania molekularnego za pomocą metod obliczeniowych, dodając krytyczny wymiar do odkrywania i opracowywania leków14. Pomimo szerokiego zastosowania, elastyczne i nieuporządkowane systemy są trudne do oceny za pomocą krystalografii, ponieważ upakowanie kryształów może być utrudnione lub mapy gęstości elektronów mogą być niekompletne lub niskiej jakości. Z drugiej strony, SAXS jest podejściem strukturalnym opartym na rozwiązaniach i niskiej rozdzielczości, zdolnym do opisywania elastycznych systemów, od nieuporządkowanych pętli i końców po wewnętrznie nieuporządkowane białka12,15,16. Biorąc pod uwagę, że jest kompatybilny z szerokim zakresem rozmiarów cząstek12, SAXS może działać synergistycznie z krystalografią, aby rozszerzyć zakres zagadnień biologicznych, na które można odpowiedzieć za pomocą badań strukturalnych.
Nsa1 nadaje się do hybrydowego podejścia strukturalnego, ponieważ zawiera dobrze ustrukturyzowaną domenę WD40, po której następuje funkcjonalny, ale elastyczny C-koniec, który nie jest podatny na metody krystalografii rentgenowskiej. Poniżej znajduje się protokół klonowania, ekspresji i oczyszczania S. cerevisiae Nsa1 do hybrydowego oznaczania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej i SAXS. Protokół ten można dostosować do badania struktur innych białek, które składają się z kombinacji uporządkowanych i nieuporządkowanych regionów.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 parallel vector</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Użyliśmy zmodyfikowanej wersji pMBP2, która zawierała N-końcowy znacznik Hisa (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomic DNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers do klonowania Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Rekombinowana produkcja białek i oczyszczanie Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Komórki gwiazdowe</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 i różne skróty</td><td>Lo i wsp., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wymiary molekularne</td><td>selenometioniny</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Bez dioksanu</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Caledon Chemikalia laboratoryjne</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, 1 M pH 7,5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazol, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Affinity Resin</td> Filtr odśrodkowy <td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml (MWCO 10K)</td><td>Milipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Żel klasy przygotowawczej Kolumna filtracyjna</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>proteaza TEV</td><td>przygotowana przez NIEHS Plazmid Protein Expression Core</td><td>Expression dostarczony przez NCI (Tropea i wsp. Metody Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr> <tr><td>4-15% Prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Krystalizacja, przesiewowe badanie proteolityczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekran kryształowy</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Ekran kryształowy 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Sól Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Ekran indeksu</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Ekran PEG / jonowy</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>wymiary molekularne</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD15-PS-T Swissci</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe 3-kroplowe płytki opadowe UVP</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3-calowa krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniająca</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Proti-Ace</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/wodorotlenek sodu pH 7,5</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-011-Cytrynian</td><td></td></tr> <tr><td>sodu tribasic</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0,22 mm silikonowane szkiełka nakrywkowe</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki z uszczelniaczem (płyta VDX z Uszczelniacz)</td> <td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM Nylonowe pętle montowane (0,05 mm do 0,5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koralików nasiennych</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne nasadki kryształkowe</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczna różdżka kriogeniczna</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Pianka kriogeniczna Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Puck System</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>Mata uszczelniająca AxyMat</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop Lite</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Websites</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski i Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams i wsp., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley i wsp., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo i Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, wersja 1.8 Schr&ouml; dinger, Sp. z o.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov i Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun i wsp., 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev i wsp., 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria i wsp., 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów nsa1 z s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Określenie pełnej długości struktury czynnika składania rybosomów Nsa1 z Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) jest trudne ze względu na nieuporządkowany i proteazowo labilny C-koniec białka. W tym manuskrypcie opisano metody oczyszczania rekombinowanego Nsa1 z S. cerevisiae do analizy strukturalnej zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS. Krystalografia rentgenowska została wykorzystana do rozwiązania struktury dobrze uporządkowanej N-końcowej domeny WD40 Nsa1, a następnie SAXS wykorzystano do rozdzielenia struktury C-końca Nsa1 w roztworze. Dane dotyczące rozpraszania roztworu zebrano z pełnej długości Nsa1 w roztworze. Teoretyczne amplitudy rozpraszania obliczono na podstawie struktury krystalicznej domeny WD40 o wysokiej rozdzielczości, a następnie połączenie modelowania ciała sztywnego i ab initio ujawniło C-koniec Nsa1. Dzięki temu hybrydowemu podejściu zrekonstruowano czwartorzędową strukturę całego białka. Przedstawione tutaj metody powinny być ogólnie stosowane do hybrydowego oznaczania strukturalnego innych białek złożonych z mieszaniny domen strukturalnych i niestrukturalnych.

Nsa1 został amplifikowany metodą PCR z genomowego DNA S. cerevisiae i subklonowany do wektora zawierającego N-końcowy znacznik powinowactwa 6x-Histydyna, a następnie MBP i miejsce cięcia proteazy TEV. Nsa1 przetransformowano do komórek E. coli BL21(DE3), a wysoką wydajność ekspresji białka uzyskano po indukcji IPTG i hodowli przez noc w temperaturze 25 °C (Rycina 1A). Nsa1 oczyszczono metodą powinowactwa na unieruchomionej żywicy kobaltowej,...

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie rekombinowanego białka, które składa się z mieszaniny uporządkowanych i nieuporządkowanych domen do hybrydowej analizy strukturalnej zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii strukturalnej dotyczące umieszczania funkcji biologicznej w taki sposób, aby określenie wszystkich roztworów pozostało strukturą białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do modelowania dynamicznych regionów białka lub makrocząsteczki, których nie można rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą na początku miały trudności z nauczeniem się, jak prawidłowo ocenić jakość swoich danych SAXS. Aby rozpocząć procedurę, przekształć plazmid ekspresji Nsa1 w odpowiedni szczep ekspresyjny E. coli. Hoduj komórki, indukuj ekspresję Nsa1 i zbieraj komórki.Ponownie zawiesić komórki w 25 mililitrach buforu do lizy, wstępnie schłodzić do czterech stopni Celsjusza, zawierającego jedną tabletkę inhibitora proteazy bez EDTA. Sonikuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut, z cyklem dwóch sekund włączonym i dwiema sekundami wyłączonymi. Następnie odwiruj lizat w temperaturze 26 900 razy większej niż grawitacja przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Upewnij się, że mieszanina nie zamarznie podczas wirowania. Następnie zrównoważyć kolumnę grawitacyjną zawierającą 10 ml unieruchomionej żywicy kobaltowej z buforem do lizy. Załaduj oczyszczony lizat na kolumnę i pozwól mu przepłynąć przez żywicę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przemyj żywicę dwukrotnie porcjami 100 ml buforu do lizy. Elute Nsa1 z kolumny za pomocą 20 ml buforu elucyjnego. Uruchom 15mcl podwielokrotności eluere na żelu od czterech do 15% SDS-PAGE, aby potwierdzić elucję białka.Następnie dodać 1 ml roztworu podstawowego proteazy TEV o stężeniu 1 mg/ml do eluere. Inkubuj eluere w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby usunąć znacznik MBP. Następnie użyj 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego, aby stężyć Nsa1 z rozszczepionym MBP do około 5 ml, uważając, aby nie zagęścić nadmiernie.Oczyść skoncentrowane białko na żelowej kolumnie filtracyjnej wstępnie zrównoważonej buforem A. Jednym z krytycznych etapów tej procedury jest upewnienie się, że podczas oczyszczania usunięto wszystkie agregaty. Agregaty będą zakłócać krystalizację oraz akwizycję i analizę danych SAXS. Analizuj próbki 15mcl z każdej frakcji kolumny za pomocą SDS-PAGE, aby potwierdzić oddzielenie MBP od Nsa1.Połącz frakcje zawierające Nsa1. Użyj 10 kilodaltonowej jednostki filtra odśrodkowego, aby skoncentrować połączone frakcje do około 8 mg / ml. Zmierz absorbancję przy 289 nanometrach i oblicz stężenie białka.Natychmiast przystąp do proteolitycznych badań przesiewowych i prób krystalizacji. Aby rozpocząć proteolityczne badanie przesiewowe, przygotuj 1 mg/ml roztwory podstawowe alfa-komotrypsyny, trypsyny, elastazy, kapayiny, septylizyny i endoproteinazy GluC. Rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy buforem rozcieńczającym do proporcji 1:10, 1:100 i 1:1 000.Rozcieńczyć roztwór Nsa1 o stężeniu 8 mg/ml do 1 mg/ml buforem A. Następnie, dla każdego rozcieńczenia proteazy, połączyć 1 mcl rozcieńczenia proteazy z 9 mcl rozcieńczonego białka. Inkubować roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj 10mcl 2x SDS-PAGE sample do buforowania do każdego roztworu i podgrzewaj roztwory w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Uruchom roztwory na żelu SDS-PAGE od czterech do 15%, aby zidentyfikować domeny oporne na proteazy. Tworzenie obciętych konstrukcji wyrażeń, które wykluczają labilne regiony proteazy. Ekspresja i oczyszczanie tych białek w celu optymalizacji krystalizacji.Po uzyskaniu danych SAXS dla białka Nsa1 w zakresie stężeń, należy ustawić ścieżkę do pliku powłoki terminala na katalog zawierający dane. Następnie uruchom oprogramowanie do analizy. Załaduj krzywe rozproszenia do oprogramowania analitycznego.Użyj narzędzia auto RG, aby określić promień bezwładności i intensywność rozpraszania do przodu dla każdej krzywej. Następnie wygeneruj wykresy Kratky'ego dla każdej krzywej rozpraszania, aby określić stopień zwartości. Użyj narzędzia autonome, aby obliczyć funkcję rozkładu parami dla każdej krzywej, używając początkowego maksymalnego wymiaru 3x promienia bezwładności.Zoptymalizuj maksymalny wymiar, aby uzyskać gładką krzywą funkcji rozkładu parami, która jest zgodna z eksperymentalną krzywą rozpraszania. Porównaj parametry strukturalne w różnych stężeniach, aby sprawdzić, czy nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem lub skutków zależnych od stężenia. Kluczowe znaczenie ma porównanie kluczowych parametrów strukturalnych, w tym promienia bezwładności, masy cząsteczkowej, rozpraszania do przodu i funkcji rozkładu odległości par w szeregu stężeń.A to po to, aby upewnić się, że nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem ani skutków koncentracji. Następnie uruchom narzędzie metody optymalizacji zespołu, korzystając z początkowego pliku struktury krystalicznej białka, pliku sekwencji białka docelowego i eksperymentalnego pliku danych SAXS. Porównaj wartości chi kwadrat z początkowego pliku struktury krystalicznej z plikiem zespołu, aby określić, czy model zespołowy dobrze pasuje do danych eksperymentalnych.Użyj oprogramowania do wizualizacji molekularnej, aby nałożyć strukturę krystaliczną na wygenerowane konformery. Proszę zanotować całkowitą liczbę konformerów i ułamek zajętości dla każdego konformera przyczyniającego się do krzywej rozpraszania. Proteolityczne rozszczepienie proteazy labilnego końca C Nsa1 spowodowało powstanie rombowych kryształów.Świeżo oczyszczony Nsa1 utworzył sześcienne kryształy, ale strukturze krystalicznej nadal brakowało gęstości elektronowej dla labilnego końca c. N-końcowa siedmioma blaszowana domena śmigłowca beta WD-40 Nsa1 była dobrze rozdzielona w obu strukturach. Sama domena Nsa1 WD-40 nie była dobrym dopasowaniem do eksperymentalnych danych SAXS.Połączenie modelowania sztywnego ciała i abwstępnej rekonstrukcji końca C znacznie poprawiło jakość dopasowania. Modelowanie zespołowe zapewniło jeszcze większą poprawę w zakresie dobrego dopasowania, ujawniając potwierdzające próbkowanie ogona C-końcowego w roztworze. Chociaż SAXS jest techniką strukturalną o niskiej rozdzielczości, bardzo dobrze uzupełnia badania strukturalne o wysokiej rozdzielczości, takie jak krystalografia rentgenowska.Dzięki temu można modelować elastyczne i nieuporządkowane regiony. Zbierając i analizując dane SAXS makrocząsteczki, możesz zacząć rozumieć zmianę potwierdzającą, która nastąpiła po Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwiązać strukturę białka złożonego z uporządkowanych i nieuporządkowanych regionów zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS.

combining-x-ray-crystallography-with-small-angle-x-ray-scattering-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Prezentujemy użycie protokołu MeshAndCollect do uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, do wykorzystania w późniejszym określaniu struktury, składającego się z częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych zebranych z wielu małych kryształów fluorescencyjnego białka Cerulean.

Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.

Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

Krystalografia białek neutronowych to technika strukturalna, która pozwala na lokalizację atomów wodoru, dostarczając tym samym ważnych szczegółów mechanistycznych funkcji białek. Przedstawiamy tutaj przebieg pracy montażu kryształu białka, zbieranie danych dyfrakcji neutronów, udoskonalanie struktury i analizę map gęstości długości rozpraszania neutronów.

Gromadzenie i przetwarzanie danych krystalografii neutronowej do modelowania atomów wodoru w strukturach białkowych

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Poznaj metodę hybrydowej analizy strukturalnej białek z użyciem krystalografii rentgenowskiej i SAXS. Technika ta umożliwia modelowanie dynamicznych regionów Nsa1 z S. cerevisiae niewidocznych w krystalografii.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów