Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie rekombinowanego białka, które składa się z mieszaniny uporządkowanych i nieuporządkowanych domen do hybrydowej analizy strukturalnej zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii strukturalnej dotyczące umieszczania funkcji biologicznej w taki sposób, aby określenie wszystkich roztworów pozostało strukturą białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do modelowania dynamicznych regionów białka lub makrocząsteczki, których nie można rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą na początku miały trudności z nauczeniem się, jak prawidłowo ocenić jakość swoich danych SAXS. Aby rozpocząć procedurę, przekształć plazmid ekspresji Nsa1 w odpowiedni szczep ekspresyjny E. coli. Hoduj komórki, indukuj ekspresję Nsa1 i zbieraj komórki.

Ponownie zawiesić komórki w 25 mililitrach buforu do lizy, wstępnie schłodzić do czterech stopni Celsjusza, zawierającego jedną tabletkę inhibitora proteazy bez EDTA. Sonikuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut, z cyklem dwóch sekund włączonym i dwiema sekundami wyłączonymi. Następnie odwiruj lizat w temperaturze 26 900 razy większej niż grawitacja przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Upewnij się, że mieszanina nie zamarznie podczas wirowania. Następnie zrównoważyć kolumnę grawitacyjną zawierającą 10 ml unieruchomionej żywicy kobaltowej z buforem do lizy. Załaduj oczyszczony lizat na kolumnę i pozwól mu przepłynąć przez żywicę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przemyj żywicę dwukrotnie porcjami 100 ml buforu do lizy. Elute Nsa1 z kolumny za pomocą 20 ml buforu elucyjnego. Uruchom 15mcl podwielokrotności eluere na żelu od czterech do 15% SDS-PAGE, aby potwierdzić elucję białka.

Następnie dodać 1 ml roztworu podstawowego proteazy TEV o stężeniu 1 mg/ml do eluere. Inkubuj eluere w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby usunąć znacznik MBP. Następnie użyj 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego, aby stężyć Nsa1 z rozszczepionym MBP do około 5 ml, uważając, aby nie zagęścić nadmiernie.

Oczyść skoncentrowane białko na żelowej kolumnie filtracyjnej wstępnie zrównoważonej buforem A. Jednym z krytycznych etapów tej procedury jest upewnienie się, że podczas oczyszczania usunięto wszystkie agregaty. Agregaty będą zakłócać krystalizację oraz akwizycję i analizę danych SAXS. Analizuj próbki 15mcl z każdej frakcji kolumny za pomocą SDS-PAGE, aby potwierdzić oddzielenie MBP od Nsa1.

Połącz frakcje zawierające Nsa1. Użyj 10 kilodaltonowej jednostki filtra odśrodkowego, aby skoncentrować połączone frakcje do około 8 mg / ml. Zmierz absorbancję przy 289 nanometrach i oblicz stężenie białka.

Natychmiast przystąp do proteolitycznych badań przesiewowych i prób krystalizacji. Aby rozpocząć proteolityczne badanie przesiewowe, przygotuj 1 mg/ml roztwory podstawowe alfa-komotrypsyny, trypsyny, elastazy, kapayiny, septylizyny i endoproteinazy GluC. Rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy buforem rozcieńczającym do proporcji 1:10, 1:100 i 1:1 000.

Rozcieńczyć roztwór Nsa1 o stężeniu 8 mg/ml do 1 mg/ml buforem A. Następnie, dla każdego rozcieńczenia proteazy, połączyć 1 mcl rozcieńczenia proteazy z 9 mcl rozcieńczonego białka. Inkubować roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj 10mcl 2x SDS-PAGE sample do buforowania do każdego roztworu i podgrzewaj roztwory w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Uruchom roztwory na żelu SDS-PAGE od czterech do 15%, aby zidentyfikować domeny oporne na proteazy. Tworzenie obciętych konstrukcji wyrażeń, które wykluczają labilne regiony proteazy. Ekspresja i oczyszczanie tych białek w celu optymalizacji krystalizacji.

Po uzyskaniu danych SAXS dla białka Nsa1 w zakresie stężeń, należy ustawić ścieżkę do pliku powłoki terminala na katalog zawierający dane. Następnie uruchom oprogramowanie do analizy. Załaduj krzywe rozproszenia do oprogramowania analitycznego.

Użyj narzędzia auto RG, aby określić promień bezwładności i intensywność rozpraszania do przodu dla każdej krzywej. Następnie wygeneruj wykresy Kratky'ego dla każdej krzywej rozpraszania, aby określić stopień zwartości. Użyj narzędzia autonome, aby obliczyć funkcję rozkładu parami dla każdej krzywej, używając początkowego maksymalnego wymiaru 3x promienia bezwładności.

Zoptymalizuj maksymalny wymiar, aby uzyskać gładką krzywą funkcji rozkładu parami, która jest zgodna z eksperymentalną krzywą rozpraszania. Porównaj parametry strukturalne w różnych stężeniach, aby sprawdzić, czy nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem lub skutków zależnych od stężenia. Kluczowe znaczenie ma porównanie kluczowych parametrów strukturalnych, w tym promienia bezwładności, masy cząsteczkowej, rozpraszania do przodu i funkcji rozkładu odległości par w szeregu stężeń.

A to po to, aby upewnić się, że nie ma uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem ani skutków koncentracji. Następnie uruchom narzędzie metody optymalizacji zespołu, korzystając z początkowego pliku struktury krystalicznej białka, pliku sekwencji białka docelowego i eksperymentalnego pliku danych SAXS. Porównaj wartości chi kwadrat z początkowego pliku struktury krystalicznej z plikiem zespołu, aby określić, czy model zespołowy dobrze pasuje do danych eksperymentalnych.

Użyj oprogramowania do wizualizacji molekularnej, aby nałożyć strukturę krystaliczną na wygenerowane konformery. Proszę zanotować całkowitą liczbę konformerów i ułamek zajętości dla każdego konformera przyczyniającego się do krzywej rozpraszania. Proteolityczne rozszczepienie proteazy labilnego końca C Nsa1 spowodowało powstanie rombowych kryształów.

Świeżo oczyszczony Nsa1 utworzył sześcienne kryształy, ale strukturze krystalicznej nadal brakowało gęstości elektronowej dla labilnego końca c. N-końcowa siedmioma blaszowana domena śmigłowca beta WD-40 Nsa1 była dobrze rozdzielona w obu strukturach. Sama domena Nsa1 WD-40 nie była dobrym dopasowaniem do eksperymentalnych danych SAXS.

Połączenie modelowania sztywnego ciała i abwstępnej rekonstrukcji końca C znacznie poprawiło jakość dopasowania. Modelowanie zespołowe zapewniło jeszcze większą poprawę w zakresie dobrego dopasowania, ujawniając potwierdzające próbkowanie ogona C-końcowego w roztworze. Chociaż SAXS jest techniką strukturalną o niskiej rozdzielczości, bardzo dobrze uzupełnia badania strukturalne o wysokiej rozdzielczości, takie jak krystalografia rentgenowska.

Dzięki temu można modelować elastyczne i nieuporządkowane regiony. Zbierając i analizując dane SAXS makrocząsteczki, możesz zacząć rozumieć zmianę potwierdzającą, która nastąpiła po Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwiązać strukturę białka złożonego z uporządkowanych i nieuporządkowanych regionów zarówno za pomocą krystalografii rentgenowskiej, jak i SAXS.