Name: Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj metodę mikropróbkowania in situ pojedynczych komórek w żywych zarodkach Xenopus laevis przy użyciu kapilarnej elektroforezy ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia szybką i minimalnie inwazyjną analizę metabolitów podczas rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants GM114854 (dla P.N.) i CA211635 (dla P.N.), grant Fundacji Arnolda i Mabel Beckman dla Beckmana dla Młodego Badacza (dla P.N.), nagrodę DuPont Young Professor (dla P.N.), Nagrodę Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Spektrometrią Mas (dla P.N.) oraz stypendia Fundacji COSMOS Club (dla R.M.O. i E.P.P.). Opinie i wnioski wyrażone w niniejszej publikacji są wyłącznie opiniami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy źródeł finansowania.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikrosonda CE-ESI-MS umożliwia bezpośrednią charakterystykę metabolitów w pojedynczych komórkach żywych, swobodnie rozwijających się zarodków. U podstaw tego podejścia leżą dwa podkomponenty techniczne, a mianowicie mikropróbkowanie kapilarne in situ oraz CE-ESI-MS o wysokiej czułości. W porównaniu z rozwarstwianiem całych komórek, mikropróbkowanie kapilarne ma tę zaletę, że działa szybko (kilka sekund w porównaniu z 5 minutami/komórkę podczas sekcji), kompatybilnością ze złożoną trójwymiarową morfologią zarodkó...

Kompleksowe zrozumienie rozwoju embrionalnego wymaga scharakteryzowania wszystkich zmian molekularnych, które zachodzą w każdej komórce rozwijającego się organizmu. Podczas gdy sekwencjonowanie nowej generacji z amplifikacją molekularną umożliwia dogłębny pomiar transkryptomów pojedynczych komórek1 w systemach rozwijających się2,3, znacznie mniej wiadomo o zestawie mniejszych cząsteczek wytwarzanych w pojedynczych komórkach embrionalnych, w tym białek, a zwłaszcza metabolitów (masa cząsteczkowa <~1,500 Da). Dzięki szybkiej i dynamicznej reakcji na zdarzenia wewnętrzne i zewnętrzne, metabolom służy jako potężny deskryptor stanu molekularnego komórki. Metabolom jednokomórkowy zwiększa zatem potencjał do śledzenia przestrzennego i czasowego rozwoju heterogeniczności komórek we wczesnym zarodku oraz do identyfikacji nowych cząsteczek do badań funkcjonalnych. Jednak bez dostępnej amplifikacji molekularnej dla tych cząsteczek, wykrywanie metabolomu wymaga wyjątkowej czułości przy użyciu spektrometrii mas (MS), która jest technologią z wyboru do analizy metabolitów.
Jednokomórkowy MS to zbiór technologii o wystarczającej czułości do pomiaru metabolitów w pojedynczych komórkach (zobacz recenzje 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15). Powtarzalne pobieranie próbek z komórek i skuteczna ekstrakcja metabolitów mają zasadnicze znaczenie dla skutecznego wykrywania metabolitów w pojedynczych komórkach. Analiza całokomórkowa zidentyfikowanych komórek z zarodków Xenopus umożliwiła scharakteryzowanie małych cząsteczek i peptydów16. Inne podejścia wykorzystują mikropipety do pobierania próbek z pojedynczych żywych komórek, a następnie detekcję za pomocą elektrorozpylania jonizacji (ESI) MS. Na przykład, metabolity mierzono w komórkach roślinnych lub ssaków za pomocą jednokomórkowego wideo MS17, pressure probe18, single probe19 i hydroic force microscopy20, między innymi21,22,23,24. Dodatkowo, włączenie separacji chemicznej przed jonizacją do przepływu pracy SM w pojedynczej komórce skutecznie upraszcza metabolom, łagodząc w ten sposób potencjalne zakłócenia podczas wytwarzania jonów przed wykryciem. Co ważne, separacja dostarcza również informacji specyficznych dla związku, które pomagają w identyfikacji molekularnej. Elektroforeza kapilarna (CE) została wykorzystana do wykrywania metabolitów w pojedynczych neuronach dissected25,26 lub microsampled27neuronów, rejestrując różnice między małymi cząsteczkami między fenotypami neuronów. Niedawno dostosowaliśmy CE do ESI tandem MS, aby umożliwić wykrywanie śladowych ilości setek metabolitów w pojedynczych komórkach, które zostały wypreparowane z wczesnych zarodków Xenopus laevis16,28. Badania te ujawniły zaskakujące różnice metaboliczne między komórkami embrionalnymi na wczesnym etapie rozwoju i doprowadziły do odkrycia metabolitów o nieznanym wcześniej wpływie na rozwój16.
Tutaj udostępniamy protokół, który umożliwił wykrywanie metabolitów w pojedynczych komórkach bezpośrednio w żywym zarodku kręgowców za pomocą mikrosondy jednokomórkowej CE-ESI-MS29,30. Wybrany organizm modelowy to zarodek X. laevis składający się z 8 do 32 komórek, chociaż podejście to ma również zastosowanie do późniejszych etapów rozwoju i innych typów organizmów modelowych. Protokół ten wykorzystuje zaostrzone naczynia włosowate z wieloosiową kontrolą translacyjną pod kierunkiem systemu obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu odessania ~10 nL części zidentyfikowanych komórek in situ w morfologicznie rozwijającym się zarodku. Ta mikrosonda jest skalowalna do mniejszych komórek i działa w ciągu kilku sekund, co jest wystarczająco szybkie, aby śledzić linie komórkowe w zarodku. Po wyekstrahowaniu polarnych lub apolarnych małych cząsteczek, takich jak metabolity i peptydy, z pobranej próbki w ~4-5 μL roztworu ekstrakcyjnego, ~10 nL otrzymanego ekstraktu jest analizowane na specjalnie zbudowanej platformie CE z łącznikiem do spektrometru mas ESI. Budowa i eksploatacja platformy CE-ESI-MS opiera się na protokołach opisanych w innym miejscu. 31,32 Współosiowy interfejs CE-ESI jest skonstruowany tak, jak opisano w innym miejscu. 31 Ta platforma jest utrzymywana w reżimie natryskiwania stożkowym, aby osiągnąć czułość na poziomie śladowym z możliwością kwantyfikacji w zakresie dynamiki 4-5 log-order (relative28,29,30 lub absolute16). Platforma CE-ESI-MS oferuje dolną granicę wykrywalności 60-amolową z 8% względnym odchyleniem standardowym (RSD) w ocenie ilościowej w badanym zakresie od 10 nM do 1 μM dla małych cząsteczek16, które są wystarczające do scharakteryzowania endogennych metabolitów w komórkach X. laevis. Mikrosondowane komórki kontynuują podział w miarę postępu zarodka w procesie rozwoju30, co pozwala na czasową i przestrzenną analizę metabolizmu komórkowego. Rzeczywiście, jednokomórkowy CE-ESI-MS może być używany do znajdowania różnic metabolicznych między komórkami, które zajmują grzbietowo-brzuszne16,29, animal-vegetal16, and left-right28 osi rozwojowych, a także komórek, które tworzą linię grzbietową przeznaczoną na tkankę nerwową od wspólnej komórki progenitorowej w X. laevis30. Oprócz badania różnic metabolicznych między poszczególnymi komórkami embrionalnymi na różnych etapach rozwoju X. laevis embryo30, przewidujemy, że opisane tutaj protokoły mają zastosowanie do szerokiej gamy biomolekuł i pojedynczych komórek mikropróbkowanych z różnych etapów rozwoju embrionalnego, a także innych typów komórek i organizmów modelowych. Ponadto mikrosonda może być wykorzystana do mikropróbkowania, podczas gdy inna platforma kompatybilna z małymi próbkami może być wykorzystana do separacji i/lub charakterystyki biomolekuł.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do hodowli zarodków Podłoża</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Azotan wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma chlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Metabolit Rozpuszczalniki ekstrakcyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (klasa LC-MS)</td><td>Metanol Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>(klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Rozpuszczalniki i normy dla CE-ESI-MS</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek acetylocholiny</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Konfiguracja produkcji mikrosondy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie, ostre kleszcze: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Odporny na korozję i autoklawowalny</td></tr>.<tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Microprobe Sampling Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Powinien być izolowany wibracyjnie.</td></tr><tr><td>Oświetlacz, np. Gęsia szyja</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe (plastikowe, jednorazowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 mm i 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura (borokrzemianowe, jednorazowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Konfiguracja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz wysokiego napięcia</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>HVPS może być sterowany zdalnie za pomocą niskonapięciowego programu generowanego przez komputer osobisty. Ostrzeżenie: Wysokie napięcie stwarza ryzyko porażenia prądem; Wszystkie części łączące muszą być uziemione lub starannie ekranowane, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu użytkowników.</td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe (2)</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Mikroskop stereoskopowy o powiększeniu 4,5 raza, wyposażony w oświetlacz do monitorowania trybu natryskiwania interfejsu CE-ESI.</td></tr><tr><td>Etap translacji XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>Etap translacji XYZ</td><td>Zbudowany</td><td></td><td>na zamówienie Ta platforma jest w stanie załadować nanolitrowe ilości próbki do kapilary separacyjnej poprzez wtrysk hydrodynamiczny i dostarczyć BGE do CE. Oba interfejsy opisane w tej pracy były w stanie wstrzyknąć 6&ndash; 10 nL próbki w ciągu 1 minuty do kapilary separacyjnej o długości 1 m</td></tr><tr><td>Fiolki na próbki ze stali nierdzewnej</td><td>Wykonana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>na zamówienie fiolka BGE ze stali nierdzewnej</td><td>Wykonana</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>kapilara z topionej krzemionki (40 &mikro; M/105 &MIKRO; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Technologie Polymicro</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze stopionej krzemionki (75 &mikro; M/360 i mikro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Technologie Polymicro</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Emiter ze stali nierdzewnej z końcówkami (130/260 i mikro; m ID/OD)</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>Aby uzyskać lepszą wydajność, rozetnij laserowo i dokładnie wypoleruj końcówkę emitera.</td></tr><tr><td>Strzykawki (gazoszczelne): 500 - 1000 i mikro; L</td><td>Hamilton Co.</td><td>Multimetr cyfrowy 1750TTL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td> Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości <td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>Bruker</td><td>Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>Tandemowy spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości wyposażony w interfejs atmosferyczno-ciśnieniowy skonfigurowany do ESI</td></tr><tr><td>Mieszanka tuningowa do kalibracji spektrometru mas</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Analiza danych wersja 4.3 oprogramowanie</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Wyposażenie pomocnicze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator podciśnienia zdolny do pracy na 4&ndash; 10&stopni; C</td><td>Mikrowaga</td><td></td> analityczna Labconco 7310022 <td></td></tr><tr><td>(XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-20 &deg; C)</td> <td>Zamrażarka Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>(-80 &deg; C)</td> <td>Inkubator</td> z chłodzeniem Fisher Scientific <td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroforeza kapilarna z mikrosondą spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (xenopus laevis)

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Kwantyfikacja małych cząsteczek w pojedynczych komórkach stwarza nowe możliwości dla lepszego zrozumienia podstawowych procesów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego. Aby umożliwić badania pojedynczych komórek bezpośrednio w żywych zarodkach, potrzebne są nowe podejścia analityczne, w szczególności te, które są czułe, selektywne, ilościowe, solidne i skalowalne do różnych rozmiarów komórek. W tym artykule przedstawiamy protokół, który umożliwia analizę in situ metabolizmu w pojedynczych komórkach w swobodnie rozwijających się zarodkach południowoafrykańskiej żaby szponiastej (Xenopus laevis), która jest potężnym modelem w biologii komórki i rozwoju. Podejście to wykorzystuje mikrosondę kapilarną do odsysania określonej części z pojedynczych zidentyfikowanych komórek w zarodku, pozostawiając sąsiednie komórki nienaruszone do późniejszej analizy. Zebrana zawartość komórek jest analizowana za pomocą interfejsu jonizacji elektrorozpylania elektroforezy kapilarnej w mikroskali (CE-ESI) sprzężonego z tandemowym spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości. Podejście to jest skalowalne do różnych rozmiarów komórek i kompatybilne ze złożoną trójwymiarową strukturą rozwijającego się zarodka. Jako przykład pokazujemy, że jednokomórkowa mikrosonda CE-ESI-MS umożliwia wyjaśnienie heterogeniczności metabolicznej komórek, która rozwija się, gdy komórka progenitorowa daje początek potomstwu podczas rozwoju zarodka. Oprócz biologii komórkowej i rozwojowej, opisane tutaj protokoły analizy pojedynczych komórek są podatne na inne rozmiary komórek, typy komórek lub modele zwierzęce.

Niedawno zastosowaliśmy mikroprobową analizę pojedynczych komórek metodą CE-ESI-MS w celu charakterystyki metabolitów w poszczególnych zidentyfikowanych komórkach swobodnie rozwijających się embrionów Xenopus laevis29,30. Mikroproba umożliwia szybką (~5 s/komórkę), in situ aspirację ~10 nL z pojedynczej komórki, wielokrotne aspiracje z tej samej komórki lub z kilku różnych komórek w tym samym lub późniejszych sta...

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Ogólnym celem tego protokołu jest scharakteryzowanie metabolitów w żywych komórkach rozwijających się zarodków za pomocą elektroforezy kapilarnej in situ z elektroforezą kapilarną i spektrometrią mas. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i rozwoju, ponieważ umożliwia analizę metabolizmu w pojedynczych komórkach bezpośrednio w żywych, rozwijających się zarodkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, skalowalna do różnych rozmiarów komórek i umożliwia minimalnie inwazyjne pobieranie próbek pojedynczych komórek w żywych zarodkach.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia, ponieważ zarodek rozwija się stosunkowo szybko i stosuje się specjalnie zbudowany przyrząd do jonizacji elektrorozpylania elektroforezy kapilarnej. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 2% agarozy w jednym 1X roztworze Steinberga. Będąc jeszcze płynnym, pokryj dno 60-milimetrowych szalek Petriego roztworem.Gdy żel agarozowy ostygnie i zestali się, podpal koniec sześciocalowej pipety Pasteura, aż utworzy kulę. Następnie delikatnie dotknij rozgrzanego końca, aby wdrukować od pięciu do 10 dołków

microprobe-capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-for-single

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Elektroforeza kapilarna bez roztworu jest szybką, tanią i solidną metodą analityczną, która umożliwia ilościowe monitorowanie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Jego przydatność do szybkiej, wygodnej i precyzyjnej analizy została tutaj zademonstrowana poprzez analizę szczepienia peptydów kowalencyjnych na foliach chitozanu w celu poprawy adhezji komórek.

Elektroforeza kapilarna do monitorowania szczepienia peptydów na warstwach chitozanu w czasie rzeczywistym

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Poznaj metodę mikropróbkowania in situ pojedynczych komórek w żywych zarodkach Xenopus laevis przy użyciu kapilarnej elektroforezy ze spektrometrią mas. Technika ta umożliwia szybką i minimalnie inwazyjną analizę metabolitów podczas rozwoju.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis) (Wideo) | JoVE Journal

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Przeglądaj więcej filmów