Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Ogólnym celem tego protokołu jest scharakteryzowanie metabolitów w żywych komórkach rozwijających się zarodków za pomocą elektroforezy kapilarnej in situ z elektroforezą kapilarną i spektrometrią mas. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i rozwoju, ponieważ umożliwia analizę metabolizmu w pojedynczych komórkach bezpośrednio w żywych, rozwijających się zarodkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, skalowalna do różnych rozmiarów komórek i umożliwia minimalnie inwazyjne pobieranie próbek pojedynczych komórek w żywych zarodkach.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia, ponieważ zarodek rozwija się stosunkowo szybko i stosuje się specjalnie zbudowany przyrząd do jonizacji elektrorozpylania elektroforezy kapilarnej. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 2% agarozy w jednym 1X roztworze Steinberga. Będąc jeszcze płynnym, pokryj dno 60-milimetrowych szalek Petriego roztworem.

Gdy żel agarozowy ostygnie i zestali się, podpal koniec sześciocalowej pipety Pasteura, aż utworzy kulę. Następnie delikatnie dotknij rozgrzanego końca, aby wdrukować od pięciu do 10 dołków na głębokość około jednego milimetra w agarozę. Aby wyprodukować mikropipety ze stożkową końcówką, najpierw należy wyciągnąć kapilary borokrzemianowe w ściągaczu kapilarnym typu Flaming/Brown, korzystając z ustawień znajdujących się w protokole tekstowym.

Następnie odłamać końcówkę wyciągniętej mikropipety za pomocą cienkich, ostrych kleszczy, aby uzyskać zewnętrzną średnicę końcówki kapilarnej około 20 mikronów. Wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym, aby zwiększyć precyzję i odtwarzalność. Pozyskanie zarodków poprzez naturalne krycie dorosłych osobników xenopus laevis wywołane gonadotropinami lub poprzez zapłodnienie in vitro, jak wskazano w protokole tekstowym.

Usuń galaretki otaczające zarodki, gdy zaczynają się rozszczepiać do stadium dwukomórkowego, najpierw pozwalając zarodkom odpocząć w roztworze dejellying przez dwie minuty. Następnie delikatnie obracaj je przez dodatkowe dwie minuty, aby zapobiec przywieraniu zarodków do powierzchni naczynia zbiorczego. Delikatnie wlej zawartość naczynia do czystej zlewki i szybko zdekantuj z niej roztwór dejellingowy.

Natychmiast przykryj jajka 0,1X roztworem Steinberga, aby spłukać pozostały roztwór dejellingowy. Delikatnie zamieszaj, a następnie zdekantuj roztwór. Powtórz ten krok cztery razy, aby dokładnie umyć zarodki.

Przenieś dejellied zarodki do 1X roztworu Steinberga na szalce Petriego. Aby zminimalizować stłoczenie na płytkach, umieść około 100 zarodków na 100-milimetrowym naczyniu. Posortuj rozszczepione zarodki w stadium dwukomórkowym do osobnego naczynia, w którym stereotypowa pigmentacja pewnie zaznacza grzbietowy dostęp brzuszny w odniesieniu do ustalenia map siarczanowych.

Zidentyfikuj prawidłowo rozszczepione zarodki, upewniając się, że pierwsza bruzda rozszczepienia, która wyznacza płaszczyznę strzałkową, przecina na pół ciemno zabarwione przyciąganie zwierzęce i lekko zabarwione przyciąganie zwierzęce tak, że dwie połówki są odbiciami lustrzanymi. Następnie zamontuj prefabrykowaną mikropipetę na wieloosiowym mikromanipulatorze. Podłączyć mikropipetę do mikrowstrzykiwacza.

Użyj plastikowej pipety transferowej, aby zaaspirować około pięciu z ośmiokomórkowych zarodków i przenieść je do naczynia do pobierania próbek zawierającego 0,5-krotny roztwór Steinberga. Za pomocą pętli do włosów umieść zarodek, z którego chcesz pobrać próbkę, w indywidualnym dołku i upewnij się, że prawidłowo zidentyfikowana komórka będąca przedmiotem zainteresowania jest skierowana w stronę mikrosondy pod kątem około 90 stopni. Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym należy wprowadzić końcówkę mikropipety do zidentyfikowanej pojedynczej komórki w żywym zarodku.

Pobrać żądaną część zawartości komórki, przykładając impulsy podciśnienia do mikrokapilary za pomocą mikrowtryskiwacza. Delikatnie wyjąć mikrosondę z komórki i przenieść jej końcówkę do czterech mikrolitrów rozpuszczalnika do ekstrakcji metabolitów schłodzonego w mikrofiolce. Następnie przyłożyć skok ciśnienia dodatniego 80 psi na jedną sekundę do kapilary za pomocą mikrowtryskiwacza, aby usunąć aspirat do rozpuszczalnika.

Szczelnie zamknąć fiolkę, aby zapobiec parowaniu, i umieścić fiolkę z powrotem na lodzie do czasu zakończenia pobierania próbek. Po zakończeniu pobierania próbek należy mieszać wirowo próbkę zawierającą fiolki do mikrowirówek przez około jedną minutę, aby przyspieszyć ekstrakcję metabolitów. Następnie odwirować fiolki w temperaturze 8 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozdrobnić resztki komórkowe i inne cząstki stałe.

Przechowywać ekstrakty komórkowe razem z resztkami komórek i wytrącać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez jeden dzień lub w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca, aż do pomiaru za pomocą CE-ESI-MS. Skonstruować platformę do wstrzykiwań CE zdolną do szybkiego pionowego przesunięcia stolika zawierającego fiolkę z elektrolitem tła i mikrofiolkę z próbką ładującą próbkę, zgodnie z odniesieniem w protokole tekstowym. Zamontuj interfejs CE-ESI, najpierw montując metalowy emiter elektronatrysku w trzyportowym złączu T.

Następnie przeprowadź kapilarę separacji CE przez emiter elektrorozpylania, pozwalając mu wystawać około 40 do 100 mikronów poza końcówkę emitera. Pracuj pod mikroskopem stereoskopowym, aby zwiększyć dokładność. Podłącz kapilarę roztworu arkuszowego do pozostałego portu, aby dostarczyć roztwór elektrorozpylania.

Stosować odpowiednie tuleje i połączenia dokręcane palcami, aby zapewnić szczelną pracę interfejsu CE-ESI. Za pomocą uchwytu na płytkę zamontuj interfejs CE-ESI na trzyosiowym stoliku translacyjnym i umieść końcówkę emitera elektrorozpylania około dwóch milimetrów od otworu spektrometru mas. Aby oczyścić elementy interfejsu, należy najpierw dostarczyć roztwór arkusza elektrorozpylania przez emiter elektrorozpylania w ilości jednego mikrolitra na minutę, a BGE przez kapilarnę separacji CE.

Używaj pompek strzykawkowych, aby podawać rozpuszczalniki ze stałą prędkością. Następnie przepłucz kapilarnę separacyjną CE przed każdym pomiarem, podłączając strzykawkę do końca wlotu kapilary. Używaj wydajnych dużych strzykawek, aby zminimalizować konieczność ponownego napełniania i zalewania przewodów doprowadzających rozpuszczalnik

Po przepłukaniu kapilary separacyjnej przez około pięć minut, przenieść jej wlot do roztworu BGE znajdującego się w fiolce ze stali nierdzewnej. Umieść końcówkę emitera elektrorozpylania około dwóch milimetrów od otworu spektrometru mas. Precyzyjnie wyreguluj tę odległość za pomocą etapu translacyjnego, aby wytworzyć elektrospray w stabilnym reżimie strumienia stożka, jednocześnie monitorując rozpylanie za pomocą mikroskopu stereoskopowego.

Monitoruj stabilność całkowitego prądu jonowego lub TIC przez około 30 do 45 minut, aby zapewnić stabilną pracę. Zastosuj 21 plus minus dwa kilowolty do fiolki BGE, stopniowo zwiększając potencjał przez około 15 sekund, zwykle generując około 7,5 mikroampera prądu przez kapilarnę separacyjną przy użyciu 1% procentowego kwasu mrówkowego jako BGE. Przed każdym pomiarem należy upewnić się, że system jest stabilny, monitorując profil TIC przez około pięć do 10 minut, a następnie stopniowo obniżać potencjał separacji do zera woltów.

Odpipetować jeden mikrolitr wzorcowego roztworu acetylu chłodzącego do fiolki do wstrzykiwań i przenieść kapilar separacyjny z fiolki BGE do fiolki do wstrzykiwań. Podnieś stopień iniekcji CE o 15 centymetrów w ciągu jednej sekundy. Po 60 sekundach hydrodynamicznie wstrzyknij sześć nanolitrów próbki do kapilary separacyjnej.

Następnie przenieś stolik z powrotem do poziomów początkowych i delikatnie przesuń końcówkę wlotu kapilary do BGE. Natychmiast po tym zwiększ napięcie CE, aby rozpocząć separację elektroforetyczną i akwizycję stanu EMA. Po wykryciu wzorca przerwij akwizycję danych i stopniowo obniżaj napięcie separacji do zera woltów.

Następnie odzyskaj emiter na dwa centymetry od kryzy. Przepłukuj kapilar separacyjny przez pięć minut przed analizą ekstraktu komórkowego. Zmierz 10 nanolitrów ekstraktu z pojedynczej komórki, powtarzając te kroki, używając 90 sekund do hydrodynamicznego wstrzyknięcia próbki.

Przedstawiono tutaj reprezentatywny elektroferogram ekstraktu komórkowego, w którym pokazane jest rozdzielenie szeregu zidentyfikowanych metabolitów. 70 różnych sygnałów zidentyfikowano z dużą pewnością jako małe metabolity polarne w oparciu o czas migracji i wzorce fragmentacji MS/MS sygnałów ekstrakcji komórek w porównaniu z tymi ze standardu lub z tandemowych bibliotek widm masowych. Identyfikację metabolitów przeprowadza się poprzez porównanie dokładnej masy, czasu migracji i zachowania fragmentacji nieznanego sygnału z próbki ze standardem metabolitu lub danymi dostępnymi w bazie danych metabolitów.

Ten krok jest pokazany dla histydyny. W tym przypadku poszczególne komórki grzbietowe, które zostały zidentyfikowane i pobrane za pomocą mikrosondy CE-ESI-MS, są pokazane w ośmiokomórkowych, 16-komórkowych i 32-komórkowych stadiach embrionalnych. Wielowariantowa analiza zidentyfikowanych metabolitów w trzech różnych typach komórek ujawniła różne profile metaboliczne i złożone trendy metaboliczne na różnych etapach komórkowych.

Analiza głównych składowych metadanych ilościowych ujawniła zmiany metaboliczne w postaci zidentyfikowanej komórki progenitorowej ośmiokomórkowego zarodka podzielonej w celu utworzenia klonu komórkowego w zarodku 16- i 32-komórkowym. Przedstawiono reprezentatywne tendencje dla wybranych metabolitów. Metabolity, takie jak acetylocholina, zmniejszały się wraz z podziałem komórki, podczas gdy trolamina i seryna/arginina wykazywały przeciwstawne tendencje w tych typach komórek.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać bardzo szybko, zwykle w mniej niż 10 sekund dla każdej komórki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy rozpoczęliśmy mapowanie heterogeniczności komórek metabolicznych we wczesnym zarodku xenopus laevis. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać elektroforezy kapilarnej z mikrosondą i spektrometrią mas do analizy metabolitów w pojedynczych komórkach embrionalnych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy, ponieważ metabolom jest dynamiczny, a komórki szybko się dzielą w rozwijającym się zarodku. Zbadaj również szczegóły analityczne, aby upewnić się, że zbierane są dane o wysokiej wierności jakościowej dotyczące metabolizmu komórkowego. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę żywych próbek, ponieważ nasze podejście oparte na spektrometrii mas z mikrosondą działa szybko, jest minimalnie inwazyjne i kompatybilne z małymi próbkami.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie siarczanów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ metabolitów na specyfikację tkanek. Nie zapominaj, że praca z zasilaczami wysokiego napięcia może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak elektryczna izolacja naelektryzowanych interfejsów.