Name: Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę obrazów do pomiaru kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki Cryptococcus neoformans. Ta metoda zwiększa dokładność badań nad wirulencją patogenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Anthony'emu Bowenowi, którego preparaty zostały użyte jako drugie ludzkie porównanie obok siebie, a także Sabrinie Nolan, której preparaty zostały użyte jako trzecie porównanie człowieka obok siebie i drugie porównanie mikroskopowe.

1. Przygotowanie indyjskiego preparatu atramentowego
<ol>
	<li>Pobrać pipetę 10 μl próbki kryptokokowej na szkiełko podstawowe wody. Każdy okrągły szczep drożdży będzie działał, ale w tym eksperymencie H99 był jedynym użytym szczepem. 
	UWAGA: Jeśli próbka pochodzi bezpośrednio z pożywki hodowlanej, rozcieńczenie w stosunku 1:2 PBS lub wodą może zapobiec zbrylaniu się atramentu indyjskiego.</li>
	<li>Odpipetuj 2 μl barwnika India Ink na próbkę i wymieszaj, fizycznie dociskając końcówkę pipety do próbki i poruszając ruchem okrężnym, aż atrament India Ink będzie wyglądał na równomiernie rozłożony.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce, przytrzymując lewą krawędź szkiełka nakrywkowego przy powierzchni szkiełka, a następnie delikatnie i równomiernie opuszczając przeciwną stronę szkiełka nakrywkowego na próbkę.</li>
	<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci na brzeg szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć uszczelnienie i zachować plamę z atramentu indyjskiego.</li>
</ol>
2. Slajd obrazowania
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w mikroskopie jasnego pola z nasadką do kamery i znaną konwersją pikseli na mikrony. Dostosuj filtry, obiektywy i kontrast tak, aby kapsułki komórkowe były czyste, a ciała komórek skupione, ciemne pasma. 
	UWAGA: Różne filtry, obiektywy i ustawienia kontrastu będą działać, ale zalecany jest obiektyw 20x, filtr Ph1 i binning 2x2.</li>
	<li>Upewnij się, że pole widzenia jest gęste, ale nie przeludnione komórkami kryptokokowymi, z wyraźnym kontrastem między torebką komórkową a tłem i odpowiednio ostre, z ciałem komórki zwizualizowanym jako ciemne pasmo. 
	UWAGA: Dokładna liczba komórek zapewniająca optymalny obraz będzie się różnić w zależności od użytej próbki i obiektywu. Ważne aspekty to upewnienie się, że komórki nie są zgrupowane ani nie nakładają się na siebie, że płaszczyzny ogniskowe komórek nie różnią się znacząco oraz że w tle jest wyraźnie widoczna znaczna plama atramentu indyjskiego (co najmniej 25% pola).</li>
	<li>Zapisuj obrazy w jednym katalogu z wyraźnymi tytułami, ponieważ algorytm pomiarowy zostanie uruchomiony na obrazach w jednym katalogu, a dane wyjściowe zostaną zorganizowane zgodnie z nazwami plików obrazów.</li>
</ol>
3. Konfiguracja algorytmu
<ol>
	<li>Zainstaluj język Python w wersji 2.7 z</li>
	<li>Zainstaluj dodatkowe biblioteki Pythona, uruchamiając polecenia "install pillow" i "install openpyxl".</li>
	<li>Zainstaluj program MATLAB, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie</li>
	<li>Skompiluj bibliotekę języka Python MATLAB, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>Pobierz trzy wymagane pliki zawarte w materiałach uzupełniających tego manuskryptu ("QCA.py", "Analysis2.m" i "TestRun.m"). 
	Uwaga: Te pliki można rozpakować do dowolnej lokalizacji, ale wszystkie trzy muszą znajdować się w tym samym katalogu.</li>
</ol>
4. Użycie algorytmu
<ol>
	<li>Uruchom aplikację, klikając dwukrotnie QCA.py. 
	UWAGA: Uruchomienie aplikacji może potrwać kilka minut. Plik "QCA.py" zawiera strukturę programu, która wywołuje pliki ".m" w celu uruchomienia rzeczywistego algorytmu.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w programie.
	<ol>
		<li>Wprowadź typ rozszerzenia plików obrazów poprzedzonych kropką i oddzielonych średnikami (np. ". TIF; jpeg"), a następnie kliknij w przycisk Enter.</li>
		<li>Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki obrazów, klikając przycisk Wybierz katalog i wybierając folder zawierający obrazy.</li>
		<li>Wygeneruj listę plików graficznych w katalogu, klikając przycisk Generuj listę obrazów. Obrazy zostaną wyświetlone w polu tekstowym po prawej stronie. Przejrzyj i upewnij się, że lista jest dokładna i kompletna.</li>
		<li>Wybierz losowy obraz z listy, który ma zostać użyty jako podgląd, klikając przycisk Wybierz losowy obraz. 
		UWAGA: Jeśli obrazu nie można otworzyć z powodu "błędu nieprawidłowego trybu obrazu", algorytm będzie nadal działał poprawnie, mimo że obraz nie zostanie wyświetlony. Po kroku 4.2.7 obraz testowy będzie nadal wyświetlany.</li>
		<li>Wprowadzanie ustawień obiektywu i kategoryzacji mikroskopu. Jeśli ustawienia domyślne nie pasują do używanego mikroskopu, wybierz opcję "Niestandardowa konwersja pikseli" i wprowadź konwersję pikseli na um dla plików obrazów. Po wybraniu kliknij przycisk Oblicz konwersję i upewnij się, że konwersja jest poprawna zgodnie z polem tekstowym po prawej stronie. 
		UWAGA: Reprezentatywne obrazy pokazane w <silnej klasie="xfig">Rysunek 1 zostały obliczone z 40-krotnym powiększeniem i wybranym binningiem 2x2.</li>
		<li>Parametry algorytmu wejściowego do wykrywania okręgu.
		<ol>
			<li>Wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania kapsuły zewnętrznej jako wpisy Min i Max Capsule Radius (Minimalny i Maksymalny promień kapsułki). Mniejszy zakres pozwoli na dokładniejsze wyniki.</li>
			<li>Wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania ciała komórki jako wpisy Min i Max Cell Body Radius (Minimalny i Maksymalny promień ciała komórki). 
			UWAGA: Wszystkie cztery wpisy powinny być liczbami reprezentującymi odpowiednie wartości w pikselach, zgodnie z obrazami źródłowymi.</li>
			<li>Przesuń suwaki Czułość kapsułki i Czułość ciała komórki, aby dostosować próg czułości algorytmu. Niska czułość będzie ścisła i zmniejszy wykrywanie fałszywych alarmów w kręgach, ale może również wykryć mniej rzeczywistych kręgów. I odwrotnie, wysoka czułość zwiększy współczynnik wykrywalności, ale może również spowodować fałszywe alarmy. 
			UWAGA: Reprezentatywne wyniki uzyskano przy minimalnym promieniu kapsułki wynoszącym 7, maksymalnym promieniu kapsułki wynoszącym 45, minimalnym promieniu ciała 4, maksymalnym promieniu ciała 30, czułości kapsułki 87 i wrażliwości ciała 87.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetestuj parametry na losowo wybranym obrazie, klikając przycisk Uruchom test. Wyniki zostaną wyświetlone w górnej środkowej części programu, zastępując oryginalny obraz. Jeśli wyniki wyglądają na dokładne, zaleca się wybranie dodatkowego losowego obrazu, aby upewnić się, że wybrane parametry będą pasować do wszystkich wybranych obrazów.
		<ol>
			<li>Zmaksymalizuj liczbę wykrytych ciał i kapsułek oraz sprawdź wzrokowo, czy okręgi wydają się pasować prawidłowo. Liczba wykrytych ciał w kapsułach zostanie wyświetlona w polu tekstowym po prawej stronie. W przeciwnym razie manipuluj parametrami algorytmu, aż wyniki będą dokładne. 
			UWAGA: Grube kolorowe koła służą jedynie do pomocy w wizualizacji. Rzeczywiste okręgi generowane do pomiaru to krzywa matematyczna obliczona przez algorytm HCT.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom algorytm wykrywania w całym katalogu plików obrazów, klikając przycisk Rozpocznij analizę. Każdy obraz zostanie przeanalizowany, a program wyświetli "gotowe" w polu tekstowym po prawej stronie, gdy wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane.</li>
		<li>Kliknij przycisk Dopasuj i oczyść. Spowoduje to dopasowanie wykrytych ciał komórek do wykrytych kapsułek, w których się znajdują, i obliczenie prawdziwego promienia kapsułki, odejmując ciało od kapsułki. 
		UWAGA: Jeśli algorytm jest używany do wykrywania fluorescencji lub innej sytuacji, w której wykrywany jest tylko jeden okrąg, ten krok jest zbędny. Zamiast tego kliknij przycisk Tylko ciała ciągnące lub Tylko kapsułki ciągnące, aby zebrać dane odpowiednio tylko dla niebieskich lub tylko zielonych kółek. Ważne jest, aby pamiętać, że jeśli zostaną pobrane tylko dane z kapsułki, promień będzie odnosił się do całkowitego promienia komórki, ponieważ promienia ciała komórki nie można odjąć.</li>
		<li>Zlokalizuj uzupełnione dane w pliku "CleanedOuput.csv" w katalogu obrazu. Jeśli wybrano tylko jeden fragment danych, plik zostanie oznaczony jako "CleanedBodies.csv" lub "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii%2C+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).</li>
<li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).</li>
<li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.neurology.org/content/80/7_Supplement/P04.007">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).</li>
<li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
<li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li>
<li>Araujo, G. deS., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561(2012).</li>
<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
<li>Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2891871/">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li>
<li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC219591/">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li>
<li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kluczowymi etapami tej techniki jest przygotowanie szkiełka atramentowego India Ink i uzyskanie obrazów mikroskopowych. Chociaż algorytm został pomyślnie przetestowany przy użyciu różnych technik slajdów i obrazów, zalecany protokół jest opisany w tym manuskrypcie. Kapsułka polisacharydowa jest wykrywana na podstawie wykluczenia cząstek atramentu indyjskiego z domeny kapsułki, ponieważ cząstki te są zbyt duże, aby przeniknąć przez sieć fibryli polisacharydowych. Wykluczenie atramentu India powoduje powstanie jasnego okrę...

Cryptococcus neoformans to chorobotwórcze drożdże występujące wszędzie na całym świecie, które są związane z chorobami ludzkimi, głównie w populacjach z obniżoną odpornością. C. neoformans jest w szczególności istotną przyczyną całkowitej rocznej liczby zgonów w Afryce Subsaharyjskiej z powodu chorób zakaźnych1. Głównym objawem klinicznym zakażenia kryptokokiem jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, które następuje po inwazji ośrodkowego układu nerwowego poprzez transport w zakażonych makrofagach (sposób konia trojańskiego) lub bezpośrednie przekroczenie bariery krew-mózg. C. neoformans wyraża kilka czynników wirulencji, w tym zdolność do replikacji w temperaturze ciała ludzkiego, aktywność ureazy, melanizację i tworzenie kapsułki polisacharydowej2. Kapsułka polisacharydowa składa się z powtarzających się polimerów glukuronoksylomannanu i glukoronoksylomannangalaaktu i działa jako bariera ochronna przed czynnikami takimi jak stres środowiskowy i odpowiedzi immunologiczne gospodarza2.
Chociaż rozmiar kapsułki z polisacharydem kryptokokowym nie był konsekwentnie kojarzony ze zjadliwością, istnieją dowody na to, że jest to czynnik patogenezy2,3,4,5,6,7. Rozmiar kapsułki jest związany z patologią zapalenia opon mózgowych6, może wpływać na zdolność makrofagów do kontrolowania infekcji Cryptococcus5 i może powodować utratę zjadliwości, jeśli jest nieobecny8. W związku z tym pomiary wielkości kapsuły są powszechne w badaniach kryptokokowych, ale nie ma ogólnopolowego standardu dla metody pomiaru kapsułki.
Obecnie, pomiar kapsułek polisacharydowych C. neoformans opiera się na ręcznych pomiarach obrazów mikroskopowych, a dokładne metody pozyskiwania obrazów i pomiarów różnią się w zależności od laboratorium9,10,11. Bezpośrednim problemem związanym z tą metodą jest to, że niektóre badania wymagają uzyskania tysięcy indywidualnych pomiarów, co utrudnia utrzymanie dokładności i wiarygodności. Co więcej, nawet gdy wyniki są publikowane, często brakuje odpowiedniego opisu metody pomiaru. Wiele publikacji nie wyjaśnia, w jaki sposób uzyskano ich pomiary, jaka płaszczyzna ogniskowa została użyta, w jaki sposób wyznaczono próg identyfikacji kapsuły, czy użyto promienia czy średnicy, czy użyto jednego pomiaru, czy uśredniono kilka, ani innych szczegółów. Niektóre publikacje podają tylko swoją metodę jako program, który został użyty, np. "Adobe Photoshop CS3 został użyty do pomiaru komórek"11. Ten brak standaryzacji i szczegółowości raportowania może utrudnić lub uniemożliwić odtwarzalność. Różnice w ludzkim wzroku, jasności komputera, ustawieniach mikroskopu, oświetleniu szkiełek i innych czynnikach mogą różnić się nie tylko między osobami, ale także między próbkami, podczas gdy obliczenia oparte na proporcjach wartości intensywności pikseli pozostaną stałe i będą miały zastosowanie między próbkami. Technika ta została opracowana w kontekście zapewnienia ustandaryzowanej, dokładnej, szybkiej i prostej techniki pomiaru rozmiarów kapsułek dla pola, w którym wcześniej ich nie było.
Jak wcześniej wspomniano, algorytm CHT jest już dawno sprawdzony, a skrypty do automatycznego wykrywania okręgów zostały już wcześniej napisane. Ta metoda poprawia się w dwóch obszarach, w których inne skrypty byłyby niewystarczające. Po pierwsze, samo wykrycie okręgów nie wystarczy, ponieważ w przypadku komórek kryptokokowych muszą zostać wykryte dwa odrębne okręgi względem siebie. Metoda ta w szczególności wykrywa ciała komórkowe w kapsułkach, rozróżnia je i wykonuje obliczenia tylko na odpowiednich parach ciało-kapsułka. Po drugie, nawet jeśli postępują zgodnie z tym samym protokołem, różni badacze uzyskają różne uzyskane obrazy. Umożliwiając badaczowi kontrolę nad każdym parametrem algorytmu, narzędzie to można dostosować tak, aby pasowało do szerokiego zakresu metod akwizycji. Nie ma potrzeby stosowania ustandaryzowanego zakresu, obiektywu, filtra i tak dalej.
Ta technika może być łatwo zastosowana w każdej sytuacji, w której badacz musi wykryć okręgi na obrazie, które kontrastują z ich tłem. Oba okręgi jaśniejsze i ciemniejsze niż ich tło można wykryć, policzyć i zmierzyć za pomocą tej techniki.

<table><tbody><tr><td>Indie</td><td>Atrament Becton, Dickinson i spółka</td><td></td><td></td>261194</tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe Fisherfinest Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Lakier do paznokci</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 niewidoczny</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>szczep H99</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>wycofany z produkcji ; Mikroskop jasnego pola</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A wycofany</td><td>; Przystawka do mikroskopu fotograficznego</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Zalecana najnowsza wersja</td></tr><tr><td>Język programowania Python</td><td></td><td>Nie dotyczy</td><td>wersja 2 wymagana; 2.7 zalecana</td></tr><tr>Microsoft<td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Zalecana najnowsza wersja</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Celem tej techniki jest zapewnienie spójnego, dokładnego i łatwego do opanowania procesu dla dużej liczby pomiarów kapsułek polisacharydowych.
Po pierwsze, obraz progowy jest generowany na podstawie wartości intensywności obliczanych dla każdego obrazu. Następnie okręgi są wykrywane na podstawie kontrastu między obiektem a tłem przy użyciu dobrze znanego algorytmu transformacji okręgu Hougha (CHT). Na koniec wykryte kapsułki i ciała komórek są dopasowywane zgodnie ze współrzędnymi środka i rozmiarem promienia, a dane są eksportowane do użytkownika w łatwym w zarządzaniu arkuszu kalkulacyjnym.
Zalety tej techniki są proste, ale znaczące. Po pierwsze, ponieważ obliczenia te są wykonywane przez algorytm, a nie przez człowieka, zwiększa się zarówno dokładność, jak i niezawodność. Nie ma spadku dokładności ani wiarygodności niezależnie od liczby analizowanych próbek. Po drugie, podejście to ustanawia potencjalną standardową procedurę operacyjną dla pola Cryptococcus zamiast obecnej sytuacji, w której pomiar kapsułek różni się w zależności od laboratorium. Po trzecie, biorąc pod uwagę, że ręczne pomiary kapsułek są powolne i monotonne, automatyzacja umożliwia szybkie pomiary na dużej liczbie komórek drożdży, co z kolei ułatwia analizę danych o wysokiej przepustowości i coraz bardziej zaawansowane statystyki.
Główne ograniczenia tej techniki wynikają z działania algorytmu. Po pierwsze, algorytm będzie generował tylko okręgi. Podczas gdy komórki Cryptococcus i ich kapsułki przyjmują morfologię kołową, trudno byłoby zastosować tę technikę do wykrywania obiektów niekołowych. Po drugie, ze względu na sposób, w jaki wykrywane są okręgi, algorytm CHT może wykrywać ogromne pseudo-okręgi na podstawie zewnętrznych krawędzi kilku zgrupowanych okręgów. Jednak wszelkie błędnie przedstawione ciała komórek złapane w pseudo-okręgu mogą być łatwo wykryte i usunięte z wynikowych zestawów danych.
Ta technika jest przeznaczona do pomiaru okrągłych kapsułek polisacharydowych gatunków Cryptococcus na podstawie mikroskopii jasnego pola India Ink; chociaż może być zastosowana do innych pomiarów okrągłych obiektów opartych na kontraście.

Obrazy są najpierw pozyskiwane poprzez mikroskopię preparatów barwionych tuszem chińskim przy użyciu mikroskopu w polu jasnym sprzężonego z kamerą (Rycina 1A). Ważne jest, aby komórki były odseparowane i występowały w dostatecznie niskiej gęstości, tak aby nie wypełniały nadmiernie pola widzenia, a także aby zastosować odpowiednią ilość barwnika w celu uzyskania kontrastu między komórkami a tłem. Jak wskazano w protokole, dokładna liczba komó...

Ta technika opisuje zautomatyzowany procesor obrazu wsadowego przeznaczony do pomiaru promieni kapsułki polisacharydowej i ciała. Chociaż początkowo został zaprojektowany do pomiarów kapsułek Cryptococcus neoformans, zautomatyzowany procesor obrazu może być również stosowany do innych opartych na kontraście detekcji okrągłych obiektów.

Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Ogólnym celem tej techniki jest automatyzacja żmudnych pomiarów ręcznych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kryptokoków, takie jak związek między wielkością kapsułki lub ciała komórki oraz różne aspekty zjadliwości. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę ogromnych objętości próbek bez zmęczenia.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii kryptokokozy, ponieważ wielkość kapsułki i komórki są ważnymi aspektami patogenu. Aby przygotować szkiełko z atramentem indyjskim, zacznij od pipetowania 10 mikrolitrów próbki kryptokoku na szkiełko. Każdy okrągły szczep yi z pracą, ale w tym eksperymencie H99 był jedynym użytym szczepem.Odpipetuj dwa mikrolitry barwnika z atramentu indyjskiego na próbkę i wymieszaj ją, fizycznie wciskając końcówkę pipety w próbkę i poruszając ruchem okrężnym, aż atrament indyjski będzie wyglądał na równomiernie rozłożony. Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce, przytrzymując lewą krawędź szkiełka nakrywkowego przy powierzchni szkiełka. Następnie delikatnie i równomiernie opuść przeciwną stronę szkiełka nakrywkowego na próbkę.Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Następnie nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci na obramowanie szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć uszczelnienie i zachować plamę z atramentu indyjskiego. Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko pod mikroskopem jasnego pola z nasadką kamery i znaną konwersją pikseli na mikrony.Dostosuj filtry, cele i kontrasty i upewnij się, że pole widzenia jest gęste, ale nie przeludnione, z komórkami kryptokokowymi z wyraźnym kontrastem między kapsułką komórkową a tłem i odpowiednio wyostrzone z ciałem komórki wizualizowanym jako ciemny pas. Po zrobieniu zdjęć zapisz je w jednym katalogu z jasnymi tytułami, ponieważ algorytm pomiarowy zostanie uruchomiony na obrazach w jednym katalogu, a dane wyjściowe zostaną zorganizowane zgodnie z nazwami plików graficznych. Po skonfigurowaniu algorytmu zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom aplikację, klikając dwukrotnie QCA.py.Postępując zgodnie z krokami opisanymi w programie, wprowadź typ rozszerzenia plików obrazów, poprzedzony kropką i oddzielony średnikami. Następnie kliknij przycisk Enter. Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki obrazów, klikając przycisk Wybierz katalog i wybierz folder zawierający obrazy.Wygeneruj listę plików graficznych w katalogu, klikając przycisk Generuj listę obrazów. Obrazy zostaną wyświetlone w polu tekstowym po prawej stronie. Przejrzyj i upewnij się, że lista jest dokładna i kompletna.Następnie wybierz losowy obraz z listy, który chcesz użyć jako podglądu, klikając przycisk Wybierz losowy obraz. Następnie wprowadź ustawienia obiektywu mikroskopu i binningu. Jeśli ustawienia domyślne nie są zgodne z używanym mikroskopem, wybierz opcję Niestandardowa konwersja pikseli i wprowadź konwersję pikseli na mikrometry dla plików obrazów.Po wybraniu kliknij przycisk Oblicz konwersję i upewnij się, że konwersja jest poprawna zgodnie z polem tekstowym po prawej stronie. Aby wprowadzić parametry algorytmu wykrywania okręgu, wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania kapsuły zewnętrznej, jako wpisy minimalnego i maksymalnego promienia kapsuły. Następnie wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny do wykrywania treści komórki jako wpisy minimalnego i maksymalnego promienia ciała komórki.Teraz przesuń suwaki czułości kapsułki i ciała komórki, aby dostosować próg czułości algorytmu. Niska czułość będzie ścisła i zmniejszy wykrywanie okręgów fałszywie dodatnich, ale może również wykryć mniej rzeczywistych kręgów. I odwrotnie, wysoka czułość zwiększy współczynnik wykrywalności, ale może również skutkować fałszywie dodatnimi kręgami.Zmaksymalizuj liczbę wykrytych ciał i kapsułek oraz sprawdź wzrokowo, czy okręgi wydają się pasować prawidłowo. Liczba wykrytych ciał w kapsułach zostanie wyświetlona w polu tekstowym po prawej stronie. W przeciwnym razie manipuluj parametrami algorytmu, aż wyniki będą dokładne.Uruchom algorytm wykrywania w całym katalogu plików obrazów, klikając przycisk Rozpocznij analizę. Każdy obraz zostanie przeanalizowany, a program wyświetli Zakończone w polu tekstowym po prawej stronie, gdy wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane. Następnie kliknij przycisk Dopasuj i oczyść.Spowoduje to dopasowanie wykrytych ciał komórkowych do wykrytych kapsułek, w których się znajdują, i obliczenie prawdziwego promienia kapsułki, odejmując ciało od kapsułki. W katalogu obrazów znajdź ukończone dane w pliku CleanedOutput. Plik csv.Jeśli wybrano tylko jeden fragment danych, plik zostanie oznaczony etykietą CleanedBodies. csv lub CleanedCapsules.csv. Jak widać na tym mikroskopowym obrazie szkiełka z tuszem indyjskim, komórki są oddzielone i mają wystarczająco niską gęstość, aby nie przytłaczać pola widzenia.Użyto również wystarczającej ilości plamy, aby stworzyć kontrast między komórkami a tłem. Algorytm określa próg unikalny dla każdego obrazu, biorąc średnią wartość intensywności i dodając odchylenie standardowe. Intensywności pikseli o intensywności wyższej niż próg są uważane za białe, a o niższej intensywności są uważane za czarne.Ciało komórki musi być wizualizowane jako solidny, okrąg na białym tle kapsułki. Najlepszą płaszczyzną ogniskową do użycia jest ta, w której ciało komórki pojawia się jako ciemne, skoncentrowane pasmo. Ta płaszczyzna ogniskowej jest akceptowalna jako standard, ponieważ prawidłowo skupia komórkę.To zostało potwierdzone przez wizualizację ściany komórkowej za pomocą UVITEX, rodzaju barwnika, który wyraźnie jest wyraźną, skupioną ścianą komórkową ze słabym sygnałem w środku. Gdy protokół jest dokładnie przestrzegany i uzyskuje się optymalne obrazy, algorytm jest dokładny i niezawodny. Jeśli jednak protokół jest przestrzegany nieprawidłowo i uzyskuje się nieoptymalne obrazy z powodu złego barwienia, przepełnienia lub innych wcześniej wymienionych parametrów, algorytm traci dokładność i nie może podsumować pomiarów dokonanych przez człowieka.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby z wyprzedzeniem zapoznać się z uzyskiwaniem optymalnych obrazów, aby być przygotowanym do pozyskiwania prawdziwych próbek. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad kryptokokami do badania rozmiarów kapsułek i ciał komórek w dowolnym systemie obrazowania, w którym oba te elementy są wyraźnie wizualizowane.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć kapsułki kryptokokowe i ciała komórkowe. Nie zapominaj, że praca z kryptokokami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak podstawowe bezpieczeństwo BSL2.

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test opsono-adherencji do badania interakcji między opsonizowanymi bakteriami a komórkami odpornościowymi. Bakterie znakowane fluorescencyjnie, potraktowane surowicą testową zawierającą przeciwciała antykapsułkowe, inkubuje się z makrofagami. Po zabarwieniu makrofagów fluorescencją, przyczepione bakterie na powierzchni makrofagów obserwuje się pod mikroskopem w celu wizualizacji.

Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Kapsułka polisacharydowa jest głównym czynnikiem wirulencji u Cryptococcus neoformans, a jej rozmiar koreluje ze zjadliwością szczepu. Pomiary średnicy kapsułki są wykorzystywane w testach fenotypowych i do oceny skuteczności terapeutycznej. Przedstawiono tutaj standardową metodę indukcji kapsułek, a także porównano dwie metody barwienia i pomiaru średnicy.

Rozmiar ma znaczenie: pomiar średnicy kapsułki u Cryptococcus neoformans

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj zautomatyzowaną analizę obrazów do pomiaru kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki Cryptococcus neoformans. Ta metoda zwiększa dokładność badań nad wirulencją patogenu.

Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

Przeglądaj więcej filmów