Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

Ogólnym celem tej techniki jest automatyzacja żmudnych pomiarów ręcznych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kryptokoków, takie jak związek między wielkością kapsułki lub ciała komórki oraz różne aspekty zjadliwości. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę ogromnych objętości próbek bez zmęczenia.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii kryptokokozy, ponieważ wielkość kapsułki i komórki są ważnymi aspektami patogenu. Aby przygotować szkiełko z atramentem indyjskim, zacznij od pipetowania 10 mikrolitrów próbki kryptokoku na szkiełko. Każdy okrągły szczep yi z pracą, ale w tym eksperymencie H99 był jedynym użytym szczepem.

Odpipetuj dwa mikrolitry barwnika z atramentu indyjskiego na próbkę i wymieszaj ją, fizycznie wciskając końcówkę pipety w próbkę i poruszając ruchem okrężnym, aż atrament indyjski będzie wyglądał na równomiernie rozłożony. Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce, przytrzymując lewą krawędź szkiełka nakrywkowego przy powierzchni szkiełka. Następnie delikatnie i równomiernie opuść przeciwną stronę szkiełka nakrywkowego na próbkę.

Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Następnie nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci na obramowanie szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć uszczelnienie i zachować plamę z atramentu indyjskiego. Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko pod mikroskopem jasnego pola z nasadką kamery i znaną konwersją pikseli na mikrony.

Dostosuj filtry, cele i kontrasty i upewnij się, że pole widzenia jest gęste, ale nie przeludnione, z komórkami kryptokokowymi z wyraźnym kontrastem między kapsułką komórkową a tłem i odpowiednio wyostrzone z ciałem komórki wizualizowanym jako ciemny pas. Po zrobieniu zdjęć zapisz je w jednym katalogu z jasnymi tytułami, ponieważ algorytm pomiarowy zostanie uruchomiony na obrazach w jednym katalogu, a dane wyjściowe zostaną zorganizowane zgodnie z nazwami plików graficznych. Po skonfigurowaniu algorytmu zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom aplikację, klikając dwukrotnie QCA.py.

Postępując zgodnie z krokami opisanymi w programie, wprowadź typ rozszerzenia plików obrazów, poprzedzony kropką i oddzielony średnikami. Następnie kliknij przycisk Enter. Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki obrazów, klikając przycisk Wybierz katalog i wybierz folder zawierający obrazy.

Wygeneruj listę plików graficznych w katalogu, klikając przycisk Generuj listę obrazów. Obrazy zostaną wyświetlone w polu tekstowym po prawej stronie. Przejrzyj i upewnij się, że lista jest dokładna i kompletna.

Następnie wybierz losowy obraz z listy, który chcesz użyć jako podglądu, klikając przycisk Wybierz losowy obraz. Następnie wprowadź ustawienia obiektywu mikroskopu i binningu. Jeśli ustawienia domyślne nie są zgodne z używanym mikroskopem, wybierz opcję Niestandardowa konwersja pikseli i wprowadź konwersję pikseli na mikrometry dla plików obrazów.

Po wybraniu kliknij przycisk Oblicz konwersję i upewnij się, że konwersja jest poprawna zgodnie z polem tekstowym po prawej stronie. Aby wprowadzić parametry algorytmu wykrywania okręgu, wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny dla wykrywania kapsuły zewnętrznej, jako wpisy minimalnego i maksymalnego promienia kapsuły. Następnie wprowadź minimalny i maksymalny promień wykrywalny do wykrywania treści komórki jako wpisy minimalnego i maksymalnego promienia ciała komórki.

Teraz przesuń suwaki czułości kapsułki i ciała komórki, aby dostosować próg czułości algorytmu. Niska czułość będzie ścisła i zmniejszy wykrywanie okręgów fałszywie dodatnich, ale może również wykryć mniej rzeczywistych kręgów. I odwrotnie, wysoka czułość zwiększy współczynnik wykrywalności, ale może również skutkować fałszywie dodatnimi kręgami.

Zmaksymalizuj liczbę wykrytych ciał i kapsułek oraz sprawdź wzrokowo, czy okręgi wydają się pasować prawidłowo. Liczba wykrytych ciał w kapsułach zostanie wyświetlona w polu tekstowym po prawej stronie. W przeciwnym razie manipuluj parametrami algorytmu, aż wyniki będą dokładne.

Uruchom algorytm wykrywania w całym katalogu plików obrazów, klikając przycisk Rozpocznij analizę. Każdy obraz zostanie przeanalizowany, a program wyświetli Zakończone w polu tekstowym po prawej stronie, gdy wszystkie obrazy zostaną przeanalizowane. Następnie kliknij przycisk Dopasuj i oczyść.

Spowoduje to dopasowanie wykrytych ciał komórkowych do wykrytych kapsułek, w których się znajdują, i obliczenie prawdziwego promienia kapsułki, odejmując ciało od kapsułki. W katalogu obrazów znajdź ukończone dane w pliku CleanedOutput. Plik csv.

Jeśli wybrano tylko jeden fragment danych, plik zostanie oznaczony etykietą CleanedBodies. csv lub CleanedCapsules.csv. Jak widać na tym mikroskopowym obrazie szkiełka z tuszem indyjskim, komórki są oddzielone i mają wystarczająco niską gęstość, aby nie przytłaczać pola widzenia.

Użyto również wystarczającej ilości plamy, aby stworzyć kontrast między komórkami a tłem. Algorytm określa próg unikalny dla każdego obrazu, biorąc średnią wartość intensywności i dodając odchylenie standardowe. Intensywności pikseli o intensywności wyższej niż próg są uważane za białe, a o niższej intensywności są uważane za czarne.

Ciało komórki musi być wizualizowane jako solidny, okrąg na białym tle kapsułki. Najlepszą płaszczyzną ogniskową do użycia jest ta, w której ciało komórki pojawia się jako ciemne, skoncentrowane pasmo. Ta płaszczyzna ogniskowej jest akceptowalna jako standard, ponieważ prawidłowo skupia komórkę.

To zostało potwierdzone przez wizualizację ściany komórkowej za pomocą UVITEX, rodzaju barwnika, który wyraźnie jest wyraźną, skupioną ścianą komórkową ze słabym sygnałem w środku. Gdy protokół jest dokładnie przestrzegany i uzyskuje się optymalne obrazy, algorytm jest dokładny i niezawodny. Jeśli jednak protokół jest przestrzegany nieprawidłowo i uzyskuje się nieoptymalne obrazy z powodu złego barwienia, przepełnienia lub innych wcześniej wymienionych parametrów, algorytm traci dokładność i nie może podsumować pomiarów dokonanych przez człowieka.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby z wyprzedzeniem zapoznać się z uzyskiwaniem optymalnych obrazów, aby być przygotowanym do pozyskiwania prawdziwych próbek. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad kryptokokami do badania rozmiarów kapsułek i ciał komórek w dowolnym systemie obrazowania, w którym oba te elementy są wyraźnie wizualizowane.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć kapsułki kryptokokowe i ciała komórkowe. Nie zapominaj, że praca z kryptokokami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak podstawowe bezpieczeństwo BSL2.