Name: Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w ludzkich organoidach jelitowych w czasie rzeczywistym. Technika mikroinjekcji FITC-dextranu umożliwia wizualizację i ilościową analizę zmian permeabilności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Stephanie Spohn i Basel Abuaita za wiele użytecznych dyskusji na temat mikroiniekcji organoidów. JRS jest wspierany przez Intestinal Stem Cell Consortium (U01DK103141), wspólny projekt badawczy finansowany przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) oraz National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). JRS i VBY są wspierane przez konsorcjum NIAID Novel, Alternative Model Systems for Enteric Diseases (NAMSED) (U19AI116482). DRH jest wspierany grantem szkoleniowym w zakresie mechanizmów patogenezy drobnoustrojów z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID, T32AI007528) oraz nagrodą Clinical and Translational Science dla Michigan Institute for Clinical and Health Research (UL1TR000433).
Pełne pliki danych i kod analizy danych użyte w tym manuskrypcie są dostępne na stronie https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol><li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStandring%2C+S+%22Gray%27s+anatomy%3A+The+anatomical+basis+of+clinical+practice%22">Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice</a>. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+defense%3A+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+A+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li>
<li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li>
<li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+measurements%3A+General+aspects+and+possible+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Hosp%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
<li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line%3A+T84+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li>
<li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability%3A+A+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li>
<li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li>
<li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+new+ball+game%3A+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2FColonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+clostridium+difficile+infection%3A+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li>
<li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=Dhn2KispfdQC">Theory and practice of histological techniques</a>. , Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization%3A+The+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization: The essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKurien%2C+B+%22Western+blotting%3A+Methods+and+protocols%22">Western blotting: Methods and protocols</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+W+%22Microsoft+excel+data+analysis+and+business+modeling%22">Microsoft excel data analysis and business modeling</a>. , Pearson Education. (2016).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R Foundation for Statistical Computing</a>. , (2017).</li>
<li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenbaum%2C+S+%22Basic+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+An+integrated+textbook+and+computer+simulations%22">Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+assessment+of+intestinal+permeability%2C+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Ther+Health+Med%22%5BJournal%5D)">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Protokół ten ustanawia metodę ogólnego przeznaczenia do mikroiniekcji HIO pochodzących z hPSC i organoidów jelitowych pochodzenia tkankowego oraz pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym. Zademonstrowaliśmy również nasze podejście do analizy i interpretacji danych generowanych tymi metodami. Biorąc pod uwagę rosnące zastosowanie systemów modelowych organoidów jelitowych 16,20,21,28 oraz długotrwałe zainteresowanie przepuszczalnością bariery jelitowej jako fizjologicznie istotnym wynikiem funkcjonalnym 3,4,5,6, przewidujemy, że inni pracujący w tej dziedzinie będą w stanie zastosować i rozwijać te metody.
Istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla zastosowania tej techniki. Dostęp do wysokiej jakości hPSC lub tkankowej tkanki HIO powinien być zapewniony przed szeroko zakrojonymi eksperymentami z mikroiniekcją. Makrostruktura HIO może być niejednorodna, z różnicami zarówno pod względem wielkości, jak i kształtu, chociaż tożsamość tkanki i morfologia komórkowa są wysoce powtarzalne przy użyciu ustalonej metodologii do generowania HIO24. Sferyczne HIO składające się z pojedynczego półprzezroczystego strumienia świetlnego o średnicy około 1 mm są idealne do mikroiniekcji i pomiaru fluorescencji światła w czasie rzeczywistym. W niektórych przypadkach mikroiniekcja zakończy się niepowodzeniem, co spowoduje zapadnięcie się HIO lub oczywisty wyciek wstrzykniętego materiału. Uszkodzone HIO można usunąć z hodowli według uznania użytkownika za pomocą standardowej mikropipety. Przy wyborze soczewek obiektywowych do mikroiniekcji i obrazowania należy wziąć pod uwagę soczewki obiektywowe dostępne na platformie obrazowania. Ogólnie rzecz biorąc, soczewki obiektywowe 2-4X są idealne do przechwytywania pełnego sygnału fluorescencyjnego HIO, chociaż obiektyw 10X może być używany, jeśli soczewki o małej mocy nie są dostępne lub jeśli dostępne HIO mają średnicę <1 mm. Oprogramowanie do obrazowania musi umożliwiać automatyczne rejestrowanie obrazów fluorescencyjnych w określonych punktach w czasie.
Możliwe jest kilka modyfikacji tego protokołu w celu dostosowania go do wymagań eksperymentalnych. Na przykład wyniki badań funkcji bariery mogą zależeć od wielkości cząsteczkowej stosowanych związków43 i właściwe może być badanie preparatów dekstranu o różnej masie cząsteczkowej. Ponadto obrazowanie w jasnym polu może być wykonywane jako dodatek do obrazowania fluorescencyjnego jako wskaźnik ogólnej integralności strukturalnej tkanki25. Podczas wykonywania mikroiniekcji żywych bakterii 25,28,31,32,33,44 może być konieczne dodanie penicyliny i streptomycyny lub gentamycyny do pożywki hodowlanej HIO przed lub po mikroiniekcji. Zewnętrzna strona mikrokapilary zostanie zanieczyszczona podczas napełniania zawiesiną kultur bakteryjnych, która może zostać przeniesiona do pożywki HIO. Alternatywnie, mikroiniekcję można wykonać na HIO zawieszonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Matrigel) bez pożywki, dodając pożywkę po zakończeniu mikroiniekcji. Może to ograniczyć zanieczyszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej i zewnętrznej powierzchni HIO. Planując testy wzrostu drobnoustrojów, może być konieczne usunięcie antybiotyków z pożywki po 1 - 2 godzinach, aby uniknąć spowolnienia lub zapobieżenia wzrostowi mikroiniekcji organizmów.
Wreszcie, uznając, że nie wszyscy badacze będą mieli dostęp do sprzętu mikroskopowego przystosowanego do obrazowania in vitro , należy podkreślić, że opisane w niniejszym protokole procedury zbierania danych fluorescencyjnych mogą być stosowane do obrazów wykonanych w ustalonych punktach czasowych przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej bez automatycznego przechwytywania obrazów lub kontroli środowiska. Przykłady takiego podejścia można znaleźć w raportach Leslie i Huang i wsp.25, którzy badali aktywność toksyny C. difficile w organoidach jelitowych pochodzących z hPSC, oraz Karve i Pradan i wsp.44, którzy badali przepuszczalność bariery nabłonkowej w podobnych organoidach jelitowych pochodzących z hPSC, którym mikrowstrzyknięto żywą E. coli. Ręczna obsługa sprzętu do obrazowania może powodować większą zmienność i trudności w normalizacji sygnału fluorescencyjnego. Podczas wykonywania ręcznego obrazowania HIO z wstrzyknięciem FITC-dekstranu ważne jest utrzymanie stałego powiększenia, intensywności wzbudzenia fluorescencyjnego i czasów ekspozycji przez cały czas trwania eksperymentu, aby uniknąć zniekształcenia pomiarów intensywności fluorescencji.

Nabłonek jelitowy tworzy selektywną barierę, która pośredniczy w kierunkowym transporcie składników odżywczych,H2O, jonów i produktów przemiany materii, jednocześnie minimalizując niespecyficzną wymianę innych cząstek za pośrednictwem dyfuzji między światłem a tkanką mezenchymalną lub dopływem krwi1,2. Niespecyficzna przepuszczalność bariery nabłonka jelitowego od dawna jest uważana za kluczowy parametr funkcjonalny zarówno w zdrowiu, jak i chorobie3,4,5,6, który odzwierciedla szybkość dyfuzji małych cząsteczek przez nabłonek przez przestrzeń parakomórkową. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej można przeprowadzić na modelach zwierzęcych7 oraz u ludzi8 poprzez spożycie laktulozy, która nie ma specyficznego transportera w przewodzie pokarmowym, a następnie pobranie i pomiar stężenia laktulozy we krwi obwodowej. Dostępne są również alternatywnie spożyte markery funkcji barierowej, takie jak fluorescencyjnie znakowane węglowodany9,10. Podejście to zostało zaadaptowane do hodowli komórek nabłonka jelitowego hodowanych na Transwell supports11, uproszczone podejście, które pozwala na większą kontrolę eksperymentalną, ale zostało również skrytykowane jako słaby predyktor przepuszczalności in vivo ze względu na brak zróżnicowanych podtypów nabłonka i struktury tkanki12. Wykorzystanie komór stanowi jeszcze inne podejście i pozwala na pomiar funkcji bariery nabłonkowej w całej błonie śluzowej jelita ex vivo13. Zastosowanie tej techniki jest często ograniczone dostępnością i stanem tkanek13,14. W związku z tym potrzebne są nowe metody, które równoważą odtwarzalność i przepustowość z znaczeniem fizjologicznym.
Ostatnie osiągnięcia w organogenezie in vitro doprowadziły do przyjęcia systemów modelowania 3D kultur tkankowych jako zaawansowanej platformy do rekapitulacji dynamiki złożonych tkanek15,16,17,18,19,20,21,22,23. W szczególności ludzkie pluripotencjalne organoidy jelitowe (HIO) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)19,24 pojawiły się jako powtarzalny i eksperymentalnie wykonalny system modelowy do badania interakcji gospodarz-mikroorganizmy i dynamiki bariery nabłonkowej25,26,27,28. Podobnie, organoidy pochodzące z tkanek ludzkich (znane również jako enteroidy) mogą pochodzić z prostej procedury biopsji i mogą być używane jako system do badania fizjologii i chorób człowieka15,29,30. Mikroiniekcja organoidów jelitowych człowieka pozwala na dostarczanie eksperymentalnych związków25 lub żywych mikroorganizmów25,31,32,33 do wierzchołkowej powierzchni nabłonka światła organoidu. Leslie i Huang i wsp.25 ostatnio zaadaptował tę technikę do pomiaru przepuszczalności bariery w mikroiniekcjach HIO z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) znakowanym dekstranem po ekspozycji na toksyny bakteryjne.
Ten protokół ma służyć jako przewodnik do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w HIO pochodzących z hPSC i HIO pochodzących z tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przy niewielkich modyfikacjach może również służyć jako ogólny podkład do mikroiniekcji HIO ze związkami eksperymentalnymi. Użytkownicy mogą uzupełnić ten protokół o dodatkowe lub alternatywne aplikacje końcowe po mikroiniekcji.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M sterylne (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do pomiaru matryc komórkowych (Matrigel)</td>System obrazowania żywych komórek <td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT</td><td></td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Camera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>W zestawie z oprogramowaniem</td></tr><tr><td>do obrazowania softWoRx</td> systemu Deltavision <td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>W zestawie z systemem Deltavision</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM-F12</td><td>Life Technologie</td><td>12634-010</td><td>Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 suplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Składnik podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24Bufor </td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Składnik pożywek ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternatywa dla uchwytu na pipety Xenoworks</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Luneta prosektoryjna Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Zalecana luneta, chociaż inne modele są prawdopodobnie kompatybilne</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Olympus IX71</td><td></td><td></td><td>W zestawie z systemem Deltavision</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometria</td><td>29065728</td><td>W zestawie z systemem Deltavision</td></tr><tr><td>Rekombinowany C. difficile Toksyna A/TcdA Białko</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>Komponent podłoża ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Komponent nośników ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Składnik mediów ENR; patrz McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dekstran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice komorowe Nunc Lab-Tek II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Filamenty szklane</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do mikropipet</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Preferowane urządzenie</td></tr><tr><td>Zestaw przewodów analogowych</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 w przezroczystej tulejce</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm O-ring</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Postępy w hodowli 3D tkanek jelitowych uzyskanych za pomocą biopsji lub wygenerowanych z pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez ukierunkowane różnicowanie, zaowocowały zaawansowanymi modelami in vitro błony śluzowej jelit. Wykorzystanie tych powstających systemów modelowych będzie wymagało adaptacji narzędzi i technik opracowanych dla systemów hodowli 2D i zwierząt. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez mikrowstrzyknięcie znakowanego fluorescencyjnie dekstranu i obrazowanie w mikroskopie odwróconym wyposażonym w filtry epifluorescencyjne. Pomiar przepuszczalności bariery w organoidach jelitowych w czasie rzeczywistym ułatwia generowanie danych czasowych o wysokiej rozdzielczości w tkance nabłonka jelitowego człowieka, chociaż technika ta może być również stosowana do obrazowania w ustalonym punkcie czasowym. Protokół ten można łatwo dostosować do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej po ekspozycji na czynniki farmakologiczne, produkty bakteryjne lub toksyny lub żywe mikroorganizmy. Przy niewielkich modyfikacjach protokół ten może również służyć jako ogólny wstęp do mikroiniekcji organoidów jelitowych, a użytkownicy mogą zdecydować się na uzupełnienie tego protokołu o dodatkowe lub alternatywne dalsze zastosowania po mikroiniekcji.

HIO zostały zróżnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i hodowane w roztworze macierzy komórkowej, zgodnie z wcześniejszymi opisami19,24. Po 4 tygodniach hodowli HIO uległy wystarczającemu powiększeniu, aby umożliwić mikroiniekcję. Do HIO wstrzyknięto za pomocą mikroiniekcji dekstran sprzężony z FITC o masie 4 kDa zawieszony w PBS lub w PBS zawierającym toksynę TcdA Clostridium difficile. C. difficile jest oportunistycznym patogenem przewodu pokarmowego, który wykazuje toksynowo indukowaną toksyczność nabłonkową w HIO25. Jako kontrolę pozytywną do pożywek hodowlanych w podgrupie HIO wstrzykniętych PBS i dekstranem-FITC dodano EGTA. EGTA jest chelatorem wapnia, który powoduje szybką depolimeryzację cytoszkieletu aktynowego42. Fluorescencję FITC monitorowano w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopu do obrazowania żywych komórek w kontrolowanej komorze środowiskowej, a obrazy rejestrowano w odstępach 10-minutowych.
Analiza post-hoc danych obrazowych wykazała istotne różnice w retencji fluorescencji FITC (Rysunek 5). HIO wstrzyknięte z PBS zachowały niemal cały sygnał fluorescencyjny obecny w czasie t = 0, natomiast HIO wstrzyknięte również z TcdA lub traktowane EGTA wykazały znaczny spadek intensywności fluorescencji do 8 godzin po mikrowstrzyknięciu (Rysunek 5A). Dane obrazowe dla wszystkich HIO we wszystkich punktach czasowych zostały poddane kwantyfikacji w celu stworzenia wysokorozdzielczego zestawu danych reprezentującego względną zmianę intensywności fluorescencji w czasie dla każdego warunku eksperymentalnego (Rysunek 5B). Różnice w przepuszczalności nabłonka oceniano poprzez obliczenie średniego czasu eliminacji (t1/2 ) FITC dla każdej grupy traktowanej (Tabela 1) i porównanie różnic w t t1/2 między grupami za pomocą testu t Studenta. HIO z grupy kontrolnej zachowały większość sygnału fluorescencyjnego FITC przez ponad 16 godzin (t1/2 = 17 ± 0.3 h). Traktowanie EGTA znacząco skróciło czas eliminacji FITC-dekstranu w stosunku do kontrolnych HIO (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h; P = 1.3 x 10-8). Zgodnie z wcześniej opublikowanymi wynikami25, mikrowstrzyknięcie TcdA znacząco zwiększyło przepuszczalność bariery nabłonkowej w stosunku do traktowania kontrolnego (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). Zatem zarówno związki podane zewnętrznie (EGTA), jak i wstrzyknięte (TcdA) są w stanie wywołać istotne zmiany w przepuszczalności bariery nabłonkowej w HIO. Wyniki te sugerują, że za pomocą tego podejścia można oceniać wpływ szerokiej gamy czynników farmakologicznych, metabolitów, produktów bakteryjnych, cytokin, czynników wzrostu i innych związków na funkcję bariery nabłonkowej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leczenie</td>
			<td>Okres półtrwania (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Dolna granica 95% CI (h)</td>
			<td>Górna granica 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Średni czas eliminacji (t1/2) dla FITC-dekstranu w HIO traktowanych EGTA lub TcdA. Jednostki to godziny po mikroiniekcji.
<img alt="Układ do mikromanipulacji z mikroskopem, mikroinjektorem i strzykawką z olejem mineralnym; badanie wstrzykiwania do komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podstawowy układ mikroinjektora i mikromanipulatora do mikroiniekcji HIO.Ten obraz przedstawia pełny zestaw sprzętu wykorzystywanego do przeprowadzania mikroiniekcji w HIO. Kluczowe komponenty są opisane, a informacje o zamawianiu znajdują się w tabeli Materiały. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat zestawu wyciągacza elektrod do precyzyjnego wytwarzania mikropipet, obejmujący regulacje mechaniczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyciągacz mikropipet. Strzałkami wskazano miedzianą cewkę grzejną hc, górny zacisk c1, dolny zacisk (c2), ramię wyciągacza (pa) oraz przełącznik wyboru grzania (ht). Prawidłowe ustawienia dla HEAT 1 oraz PULL są zaznaczone czerwonym tekstem. Wstawka przedstawia prawidłowo zamocowany szklany włókno gotowe do podgrzania. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Formowanie ciał embrioidalnych, transfer mikropipetą (A) i obraz mikroskopowy (B), pasek skali 100 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy pochodzącego z tkanki HIO po wstrzyknięciu FITC-dekstranu. (A) Obraz demonstrujący pozycjonowanie szklanej mikrokapiilary bezpośrednio przed wprowadzeniem do HIO i mikroiniekcją. (B) Obraz w polu jasnym pochodzących z tkanki ludzkich organoidów jelitowych po mikroiniekcji FITC-dekstranu. Należy zauważyć, że sygnał fluorescencyjny jest widoczny nawet bez użycia specyficznego zestawu filtrów. Zabarwienie to ułatwia precyzję mikroiniekcji. Powiększenie 3X <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy konfiguracji mikroskopowej; wzbudzenie/emisja, przechwytywanie obrazów, proces eksportu do formatu TIFF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przepływ pracy obrazowania na żywo. (A) Zrzut ekranu ilustrujący kroki niezbędne do ustawienia parametrów mikroskopu, zlokalizowania HIO na szkiełku oraz zapisania pozycji stolika dla każdego HIO przeznaczonego do obrazowania. (B) Ustawienia przed obrazowaniem w celu przechwytywania kanału FITC w regularnych odstępach czasu w każdej z pozycji określonych w punkcie A. (C) Eksport plików danych w formacie DV po obrazowaniu do postaci obrazów TIFF, z jednym obrazem TIFF na HIO w każdym punkcie czasowym. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu przepuszczalności FITC-dekstranu; obrazy mikroskopowe i wykres intensywności w czasie; EGTA, TcdA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki. (A) Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) pochodzące z komórek macierzystych, do których wstrzyknięto mikrostrzykawką 2 mg/mL FITC-dekstranu (4 kDa), obrazowane przez 20 godzin. Do HIO wstrzyknięto również PBS (kontrola), toksynę TcdA z Clostridium difficile (12,8 ng/µL) lub potraktowano je 2 mM EGTA dodanym do zewnętrznej pożywki hodowlanej. Powiększenie 4X. (B) Wykres średniej znormalizowanej intensywności FITC w czasie w HIO traktowanych PBS (kontrola), TcdA lub EGTA. Słupki błędu reprezentują S.E.M. i n = 11 HIO (kontrola), 3 HIO (EGTA), 6 HIO (TcdA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gastroenterologii, takie jak to, w jaki sposób określone toksyny, produkty bakteryjne, a nawet leczenie farmakologiczne mogą zmienić przepuszczalność bariery nabłonkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona zarówno na wizualizację, jak i ilościowy pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym i z wykorzystaniem ludzkiej tkanki nabłonka jelitowego.Przed mikroiniekcją organoidów jelitowych człowieka należy skonfigurować mikrowstrzykiwacz, a mikrokapilar przygotować, zainstalować i przetestować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wypełnić mikrokapilę materiałem do wstrzykiwań, zanurzyć końcówkę szklanej mikrokapilary w zawiesinie do wstrzykiwań FITC-dekstran, uważając, aby nie złamać końcówki mikrokapilary o bok lub dno probówki. Pociągnij strzykawkę z olejem mineralnym, aby pobrać około 10 mikrolitrów zawiesiny FITC-dekstranu do mikrokapilary.Gdy zawiesina do mikroiniekcji wypełni 90% długości szklanej mikrokapilary, przestań wypełniać mikrokapila. Lekko wcisnąć strzykawkę przed wyjęciem mikrokapilary z roztworu do mikroiniekcji, aby upewnić się, że końcówka mikrokapilary nie zawiera kieszeni powietrza. Wyjąć płytkę z hodowli organoidów jelitowych ludzkich z inkubatora do hodowli komórkowych i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego z mikrowstrzykiwaczem.Zdejmij pokrywkę z płytki hodowlanej i wyśrodkuj pierwszą studzienkę na stoliku mikroskopu tak, aby była wyraźnie widoczna przez okular lunety przy najniższym ustawieniu powiększenia. Obróć ramię mikromanipulatora tak, aby mikrokapila była skierowana w dół do studzienki hodowli pod kątem większym niż 45 stopni w stosunku do stolika mikroskopu. Umieścić końcówkę mikrokapilary nad pierwszą studzienką hodowlaną na wysokości około jednego centymetra nad powierzchnią pożywki.Sprawdź, czy zarówno końcówka szklanego żarnika, jak i organoid jelitowy człowieka są widoczne przez okular. Kluczem do udanej mikroiniekcji jest staranne wyrównanie mikrokapilary z organoidem przed przystąpieniem do mikroiniekcji. I zawsze zalecam, aby nowi użytkownicy ćwiczyli z zapasową tkanką przed przystąpieniem do krytycznego eksperymentu.Obracając pokrętło osi z zgodnie z ruchem wskazówek zegara, powoli przesuwaj mikrokapilę. Przebij organoid jelitowy człowieka końcówką mikrokapilarną. Zewnętrzna powierzchnia ludzkiego organoidu jelitowego lekko się obniży, gdy mikrokapilara zacznie wywierać nacisk, i powróci do kształtu, gdy końcówka wniknie w światło.Jeśli występują trudności z dostrzeżeniem końcówki mikrokapilary w świetle światła, dostosuj ustawienia oświetlenia lub powiększenia mikroskopu preparacyjnego. Gdy mikrokapilara jest prawidłowo umieszczona z końcówką mikrokapilary w pobliżu środka ludzkiego organoidu jelitowego, zdejmij ręce z elementów sterujących mikromanipulatora. Lekko wciśnij strzykawkę wypełnioną olejem mineralnym, aby wypchnąć roztwór do mikroiniekcji z mikrokapilary do światła organoidu jelitowego człowieka.Ludzki organoid jelitowy może się nieznacznie rozszerzyć, aby dostosować się do objętości wstrzyknięcia. Gdy mikrokapilara jest umieszczona nad podłożem, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia organoidów jelitowych człowieka podczas manewrowania, przejdź do następnego celu organoidu jelitowego człowieka. Pomiędzy zabiegami lub w przypadku pęknięcia należy wymienić mikrokapilę.Poluzuj zacisk na końcu ramienia mikromanipulatora i wyjmij mikrokapilę z uchwytu mikropipety. W celu zbadania związków dostarczonych do nabłonka wierzchołkowego, należy je ponownie zawiesić w sterylnym PBS zawierającym dwa miligramy na mililitr dekstranu FITC. W tym reprezentatywnym eksperymencie należy ponownie zawiesić toksynę Clostridium difficile TcdA, dodać 12,8 nanogramów na mikrolitr do PBS zawierającego FITC-dekstran przed mikrowstrzyknięciem.Mikrowstrzyknąć związek do światła organoidu jelitowego człowieka, jak pokazano w poprzednim rozdziale. W celu zbadania związków dostarczonych do podstawnego przedziału bocznego, po mikrowstrzyknięciu dekstranu FITC, należy zastąpić zewnętrzne podłoże hodowlane nową pożywką zawierającą dwa milimolowe EGTA jako kontrolę pozytywną, sam nośnik PBS jako kontrolę ujemną lub inny związek doświadczalny. Obrazowanie na żywo należy rozpocząć natychmiast po mikrowstrzyknięciu.Ten reprezentatywny obraz jasnego pola pokazuje organoid jelitowy ludzki pochodzenia tkankowego po mikrowstrzyknięciu dekstranu FITC. Sygnał fluorescencyjny jest widoczny nawet bez użycia specjalnego zestawu filtrów. Organoidy jelitowe ludzkie pochodzące z komórek macierzystych zostały poddane mikroiniekcji czterokilodaltonowego dekstranu sprzężonego z FITC zawieszonego w PBS lub PBS zawierającego toksynę Clostridium difficile TcdA.Jako kontrolę pozytywną, EGTA dodano do pożywki do hodowli organoidów jelitowych w podgrupie organoidów jelitowych ludzkich, którym wstrzyknięto PBS i dekstran FITC. Ludzkie organoidy jelitowe były obrazowane przez 20 godzin. Jak pokazano na tych obrazach, ludzkie organoidy jelitowe, którym wstrzyknięto PBS, zachowały prawie cały sygnał fluorescencyjny obecny w temperaturze T zero.Jednak ludzkie organoidy jelitowe, którym również wstrzyknięto TcdA lub poddano działaniu EGTA, wykazywały znaczny spadek intensywności fluorescencji w ciągu ośmiu godzin po mikrowstrzyknięciu. Dane obrazowe określono ilościowo dla wszystkich organoidów jelitowych człowieka we wszystkich punktach czasowych, aby wygenerować zestaw danych o wysokiej rozdzielczości reprezentujący względną zmianę intensywności fluorescencji w czasie w każdych warunkach eksperymentalnych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 30 minut do jednej godziny, w zależności od liczby warunków eksperymentalnych.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o cierpliwości i nie spieszyć się z ustawianiem organoidów jelitowych człowieka z mikrokapilarą przed mikroiniekcją. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak PCR, western blot i wyszukiwanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiedzi ludzkiego organoidu jelitowego na wstrzyknięty materiał. Opracowanie tej techniki pozwoliło nam na zbadanie wpływu toksyn bakteryjnych, środków farmakologicznych, cytokin, a nawet żywych mikroorganizmów na funkcję bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikrowstrzykiwać fluorescencyjnie znakowany dekstran i inne materiały eksperymentalne do światła ludzkiego organoidu jelitowego. Nie zapominaj, że praca z toksynami bakteryjnymi lub żywymi organizmami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej. I wreszcie, należy szczególnie uważać, aby uniknąć ran kłutych, ponieważ mikronaczynia włosowate są niezwykle ostre.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej w ludzkich organoidach jelitowych w czasie rzeczywistym. Technika mikroinjekcji FITC-dextranu umożliwia wizualizację i ilościową analizę zmian permeabilności.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów