Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gastroenterologii, takie jak to, w jaki sposób określone toksyny, produkty bakteryjne, a nawet leczenie farmakologiczne mogą zmienić przepuszczalność bariery nabłonkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona zarówno na wizualizację, jak i ilościowy pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym i z wykorzystaniem ludzkiej tkanki nabłonka jelitowego.

Przed mikroiniekcją organoidów jelitowych człowieka należy skonfigurować mikrowstrzykiwacz, a mikrokapilar przygotować, zainstalować i przetestować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wypełnić mikrokapilę materiałem do wstrzykiwań, zanurzyć końcówkę szklanej mikrokapilary w zawiesinie do wstrzykiwań FITC-dekstran, uważając, aby nie złamać końcówki mikrokapilary o bok lub dno probówki. Pociągnij strzykawkę z olejem mineralnym, aby pobrać około 10 mikrolitrów zawiesiny FITC-dekstranu do mikrokapilary.

Gdy zawiesina do mikroiniekcji wypełni 90% długości szklanej mikrokapilary, przestań wypełniać mikrokapila. Lekko wcisnąć strzykawkę przed wyjęciem mikrokapilary z roztworu do mikroiniekcji, aby upewnić się, że końcówka mikrokapilary nie zawiera kieszeni powietrza. Wyjąć płytkę z hodowli organoidów jelitowych ludzkich z inkubatora do hodowli komórkowych i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego z mikrowstrzykiwaczem.

Zdejmij pokrywkę z płytki hodowlanej i wyśrodkuj pierwszą studzienkę na stoliku mikroskopu tak, aby była wyraźnie widoczna przez okular lunety przy najniższym ustawieniu powiększenia. Obróć ramię mikromanipulatora tak, aby mikrokapila była skierowana w dół do studzienki hodowli pod kątem większym niż 45 stopni w stosunku do stolika mikroskopu. Umieścić końcówkę mikrokapilary nad pierwszą studzienką hodowlaną na wysokości około jednego centymetra nad powierzchnią pożywki.

Sprawdź, czy zarówno końcówka szklanego żarnika, jak i organoid jelitowy człowieka są widoczne przez okular. Kluczem do udanej mikroiniekcji jest staranne wyrównanie mikrokapilary z organoidem przed przystąpieniem do mikroiniekcji. I zawsze zalecam, aby nowi użytkownicy ćwiczyli z zapasową tkanką przed przystąpieniem do krytycznego eksperymentu.

Obracając pokrętło osi z zgodnie z ruchem wskazówek zegara, powoli przesuwaj mikrokapilę. Przebij organoid jelitowy człowieka końcówką mikrokapilarną. Zewnętrzna powierzchnia ludzkiego organoidu jelitowego lekko się obniży, gdy mikrokapilara zacznie wywierać nacisk, i powróci do kształtu, gdy końcówka wniknie w światło.

Jeśli występują trudności z dostrzeżeniem końcówki mikrokapilary w świetle światła, dostosuj ustawienia oświetlenia lub powiększenia mikroskopu preparacyjnego. Gdy mikrokapilara jest prawidłowo umieszczona z końcówką mikrokapilary w pobliżu środka ludzkiego organoidu jelitowego, zdejmij ręce z elementów sterujących mikromanipulatora. Lekko wciśnij strzykawkę wypełnioną olejem mineralnym, aby wypchnąć roztwór do mikroiniekcji z mikrokapilary do światła organoidu jelitowego człowieka.

Ludzki organoid jelitowy może się nieznacznie rozszerzyć, aby dostosować się do objętości wstrzyknięcia. Gdy mikrokapilara jest umieszczona nad podłożem, aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia organoidów jelitowych człowieka podczas manewrowania, przejdź do następnego celu organoidu jelitowego człowieka. Pomiędzy zabiegami lub w przypadku pęknięcia należy wymienić mikrokapilę.

Poluzuj zacisk na końcu ramienia mikromanipulatora i wyjmij mikrokapilę z uchwytu mikropipety. W celu zbadania związków dostarczonych do nabłonka wierzchołkowego, należy je ponownie zawiesić w sterylnym PBS zawierającym dwa miligramy na mililitr dekstranu FITC. W tym reprezentatywnym eksperymencie należy ponownie zawiesić toksynę Clostridium difficile TcdA, dodać 12,8 nanogramów na mikrolitr do PBS zawierającego FITC-dekstran przed mikrowstrzyknięciem.

Mikrowstrzyknąć związek do światła organoidu jelitowego człowieka, jak pokazano w poprzednim rozdziale. W celu zbadania związków dostarczonych do podstawnego przedziału bocznego, po mikrowstrzyknięciu dekstranu FITC, należy zastąpić zewnętrzne podłoże hodowlane nową pożywką zawierającą dwa milimolowe EGTA jako kontrolę pozytywną, sam nośnik PBS jako kontrolę ujemną lub inny związek doświadczalny. Obrazowanie na żywo należy rozpocząć natychmiast po mikrowstrzyknięciu.

Ten reprezentatywny obraz jasnego pola pokazuje organoid jelitowy ludzki pochodzenia tkankowego po mikrowstrzyknięciu dekstranu FITC. Sygnał fluorescencyjny jest widoczny nawet bez użycia specjalnego zestawu filtrów. Organoidy jelitowe ludzkie pochodzące z komórek macierzystych zostały poddane mikroiniekcji czterokilodaltonowego dekstranu sprzężonego z FITC zawieszonego w PBS lub PBS zawierającego toksynę Clostridium difficile TcdA.

Jako kontrolę pozytywną, EGTA dodano do pożywki do hodowli organoidów jelitowych w podgrupie organoidów jelitowych ludzkich, którym wstrzyknięto PBS i dekstran FITC. Ludzkie organoidy jelitowe były obrazowane przez 20 godzin. Jak pokazano na tych obrazach, ludzkie organoidy jelitowe, którym wstrzyknięto PBS, zachowały prawie cały sygnał fluorescencyjny obecny w temperaturze T zero.

Jednak ludzkie organoidy jelitowe, którym również wstrzyknięto TcdA lub poddano działaniu EGTA, wykazywały znaczny spadek intensywności fluorescencji w ciągu ośmiu godzin po mikrowstrzyknięciu. Dane obrazowe określono ilościowo dla wszystkich organoidów jelitowych człowieka we wszystkich punktach czasowych, aby wygenerować zestaw danych o wysokiej rozdzielczości reprezentujący względną zmianę intensywności fluorescencji w czasie w każdych warunkach eksperymentalnych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 30 minut do jednej godziny, w zależności od liczby warunków eksperymentalnych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o cierpliwości i nie spieszyć się z ustawianiem organoidów jelitowych człowieka z mikrokapilarą przed mikroiniekcją. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak PCR, western blot i wyszukiwanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiedzi ludzkiego organoidu jelitowego na wstrzyknięty materiał. Opracowanie tej techniki pozwoliło nam na zbadanie wpływu toksyn bakteryjnych, środków farmakologicznych, cytokin, a nawet żywych mikroorganizmów na funkcję bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikrowstrzykiwać fluorescencyjnie znakowany dekstran i inne materiały eksperymentalne do światła ludzkiego organoidu jelitowego. Nie zapominaj, że praca z toksynami bakteryjnymi lub żywymi organizmami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej. I wreszcie, należy szczególnie uważać, aby uniknąć ran kłutych, ponieważ mikronaczynia włosowate są niezwykle ostre.