Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi
12 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.
Istnieje duże zapotrzebowanie na wygodne narzędzia do generowania cech i obiektów w skali nanometrowej, szczególnie w badaniu interakcji biologicznych z materiałami i powierzchniami nanostrukturalnymi. Protokół ten umożliwia szybką i jednorodną replikację macierzy białkowych w obszarach w skali centymetrowej z rozdzielczością nanoskali. To pozwala nam badać interakcje mezenchymalnych komórek macierzystych na tych powierzchniach.
Te powierzchnie modelu pozwalają nam badać kontrolowane interakcje między określonymi zmiennymi materiałowymi a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, dostarczając podstawowych kryteriów projektowania materiałów, które będą informować o przyszłych projektach biomateriałów. Aby rozpocząć procedurę, należy dokładnie wymieszać składniki prepolimeru PDMS w łódce wagowej. Odgazowywać mieszaninę w eksykatorze próżniowym przez 20 minut lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki gazu znikną.
Następnie umieść krzemowy wzorzec tablicy PPL na czterocentymetrowej szalce Petriego. Wlej odgazowaną mieszankę prepolimerów PDMS na wzorzec, aż zostanie całkowicie pokryta. Odgazuj PDMS, zakrywając mastera przez kolejne pięć minut.
Podczas odgazowywania należy traktować szklane szkiełko plazmą tlenową przez jedną minutę. Po odgazowaniu ostrożnie umieść szkiełko na PDMS stroną poddaną obróbce skierowaną w dół. Delikatnie dociśnij szkiełko do silikonowego wzorca, aby usunąć uwięzione powietrze i upewnić się, że jednolita warstwa PDMS jest umieszczona między wzorcem a szkiełkiem.
Przenieś umieszczoną w kanapce macierz PDMS na inną szalkę Petriego z krzemowym wzorcem na spodzie. Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Następnie wyjmij utwardzoną matrycę PPL z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia przez 15 minut.
Użyj żyletki, aby ostrożnie przyciąć nadmiar PDMS z tyłu i po bokach szklanego szkiełka. Zdmuchnij luźne zanieczyszczenia PDMS strumieniem suchego azotu gazowego. Ważne jest, aby przyciąć nadmiar PDMS z tyłu i krawędzi macierzy, aby umożliwić dokładne wyrównanie.
Pomaga to również użytkownikowi w lepszej obserwacji warunków panujących pod AFM podczas litografii. Wciśnij żyletkę w róg matrycy na głębokość jednego milimetra i ostrożnie podważ matrycę z krzemowego wzorca jednym, ciągłym ruchem podnoszenia. Następnie ostrożnie odetnij i zeskrob 0,5 milimetra PDMS na krawędziach tablicy za pomocą żyletki.
Użytkownicy powinni być bardzo ostrożni podczas podważania matryc od urządzenia głównego, aby zapewnić dobrą separację i uniknąć uszkodzenia sond. Powinno to być wykonane w jednym, płynnym działaniu, bez opadania matryc z powrotem na krzemowy master. Potraktuj matrycę PPL plazmidem tlenowym przez 30 sekund, a następnie upuść 20 mikrolitrów dejonizowanej wody na powierzchnię tablicy.
Jeśli woda nie rozprowadza się równomiernie po całej matrycy, należy powtórzyć zabieg plazmowy. Dokładnie wysusz matrycę poddaną obróbce plazmowej, a następnie użyj dwustronnej taśmy węglowej, aby przymocować matrycę do uchwytu sondy mikroskopowej sił atomowych. Zamontuj uchwyt sondy na uchwycie kinematycznym AFM.
Aby nanieśćmatrycę na matrycę, nałóż na nią 20-mikrolitrową kroplę jednomilimolowego roztworu MHA w etanolu, unikając kontaktu między końcówką pipety a powierzchnią matrycy. Poczekaj, aż roztwór MHA rozprzestrzeni się w całej tablicy. Poczekaj, aż etanol wyparuje.
Zamontuj uchwyt sondy z matrycą PPL na AFM, a następnie umieść złote podłoże na środku stolika na próbki AFM. Przymocuj podłoże na miejscu za pomocą taśmy klejącej. Aby rozpocząć wyrównywanie, uruchom stage program konfiguracyjny kontrolera, aby zresetować wszystkie osie i kąty do wstępnie skalibrowanego punktu zerowego.
Użyj konsoli sterowania osią X i osi Y pobierania próbek AFM, aby przesunąć podłoże do żądanej lokalizacji drukowania. Przełącz dźwignię zwalniającą stolik, aby zwolnić stolik na próbkę i aktywować czujniki siły. Pozwól czujnikom zrównoważyć się przez co najmniej 15 minut, a następnie użyj kontrolera osi Z, aby podnieść stolik próbki, aż układ znajdzie się wizualnie jak najbliżej podłoża.
Upewnij się, że tablica znajduje się w odległości nie większej niż jeden milimetr od podłoża. Następnie otwórz program automatycznego wyrównywania. Wypełnij stopień kąta, odstęp kroku zgrubnego i odstęp kroku drobnego.
Ustaw ścieżkę do pliku arkusza kalkulacyjnego i dołącz szablon arkusza kalkulacyjnego. Następnie otwórz oprogramowanie sterujące AFM i przejdź do sekcji spektroskopii. Skonfiguruj oscylację osi Z głowicy skanującej tak, aby rozszerzała się o 10 mikrometrów przez 100 milisekund, przytrzymywała przez 250 milisekund, cofała o 10 mikrometrów przez 100 milisekund i utrzymywała przez 250 milisekund.
Uruchom oscylację głowicy skanującej i uruchom automatyczne wyrównywanie. Gdy oprogramowanie wskaże, że wyrównanie zostało zakończone, zakończ proces wyrównywania. Sprawdź automatycznie wygenerowane dopasowanie liniowe danych osiowania, aby określić, czy wyrównanie się powiodło i określić ogólne optymalne kąty, a następnie podnieś stolik próbki w krokach co 500 nanometrów, aż do momentu zaobserwowania kontaktu między matrycą a podłożem za pomocą kamery AFM z widokiem z góry.
Kliknij przycisk Stop w oprogramowaniu sterującym AFM, aby cofnąć matrycę o 10 mikrometrów. Aby rozpocząć proces PPL, otwórz sekcję litografii w oprogramowaniu sterującym AFM. Wybierz tryb pracy modulacji Z i przejdź do wzorca litograficznego, który chcesz zaimportować.
Wpisz rozmiar wzoru, który ma zostać wygenerowany. Ustaw przesunięcie początku układu współrzędnych na 25 mikrometrów na obu osiach X i Y, a następnie wybierz pozycję Modulacja bezwzględna Z, ustaw przyrząd tak, aby uprościł na dwie warstwy i ustaw wartości czerni i bieli odpowiednio na pięć i minus pięć mikrometrów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować ustawienia i zamknąć okno.
Otwórz edytor warstw z okna litografii i ustaw czas pauzy. Następnie opuść komorę izolacji atmosferycznej na AFM i otwórz jego oprogramowanie sterujące. Ustaw wilgotność względną na 45%, temperaturę 25 stopni Celsjusza i natężenie przepływu wymiany atmosfery na 500 mililitrów.
Wprowadź ustawienia i poczekaj, aż zostanie osiągnięty żądany poziom wilgotności. Następnie rozpocznij sekwencję litograficzną. Po zakończeniu litografii cofnij stolik o 500 mikrometrów.
Wyjmij komorę izolacji atmosferycznej. Zablokuj stolik na próbkę, aby dezaktywować czujniki siły. Na koniec usuń podłoże ze sceny w celu wizualizacji lub dalszej obróbki.
PPL wykorzystano do wytworzenia wielkoskalowych jednorodnych wzorów drobnych siatek tablicowych lub szczegółowych obrazów. Wzory zostały uwidocznione do mikroskopii optycznej poprzez wytrawienie złota niechronionego przez osadzony tiol. Nieregularne wzory wskazywałyby na uszkodzone lub brakujące sondy.
Macierze MHA wydrukowane na złocie za pomocą PPL funkcjonalizowano fibronektyną i inkubowano z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Poszczególne komórki przylegały do układów funkcjonalizowanych fibronektyną, dostosowując swoją morfologię do wzorców, gdy było to konieczne. Ta technika PPL może być wykorzystana do deponowania szerokiej gamy wzorów białek do eksperymentów biologii komórki.
Doświadczony użytkownik może wygenerować wzorce, takie jak te pokazane, w ciągu około trzech godzin. Pamiętaj, że skrupulatne przygotowanie tablicy to klucz do sukcesu. Technika PPL jest dość ogólna i może być stosowana do osadzania związków, od małych cząsteczek po polimery i biomolekuły, torując drogę do różnorodnych badań w chemii, biologii i materiałoznawstwie.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół nanolitografii z wykorzystaniem sond skanujących na dużym obszarze, koncentrując się na iteracyjnym wyrównywaniu macierzy sond. Omówiono w nim również zastosowanie wzorów litograficznych do badania oddziaływań między komórkami a powierzchnią.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanotechnologia
- Biomateriały
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Istnieje znaczne zapotrzebowanie na narzędzia umożliwiające tworzenie struktur w skali nanometrycznej do badań biologicznych.
- Niniejszy protokół pozwala na szybką replikację macierzy białkowych na dużych powierzchniach.
- Ułatwia on badanie interakcji między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a powierzchniami nanostrukturalnymi.
- Zrozumienie tych interakcji może pomóc w projektowaniu przyszłych biomateriałów.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia powierzchni nanostrukturalnych do badań biologicznych.
- Zbadanie oddziaływań mezenchymalnych komórek macierzystych z tymi powierzchniami.
- Ustalenie kryteriów projektowania przyszłych biomateriałów w oparciu o kontrolowane oddziaływania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie prepolimeru PDMS do tworzenia macierzy sond.
- Odgazowanie i utwardzanie PDMS w celu uformowania stabilnej macierzy.
- Wykorzystanie mikroskopii sił atomowych (AFM) do wyrównania i litografii.
- Zastosowanie specyficznych roztworów w celu modyfikacji właściwości powierzchni do badań interakcji komórkowych.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne tworzenie jednorodnych powierzchni nanostrukturalnych.
- Interakcje mezenchymalnych komórek macierzystych mogą być efektywnie badane na tych powierzchniach.
- Kontrolowane warunki umożliwiają precyzyjny pomiar odpowiedzi biologicznych.
- Uzyskane dane mogą służyć do projektowania przyszłych biomateriałów.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi cenne narzędzie dla badaczy w dziedzinie nanotechnologii i biologii komórki.
- Ułatwia on zrozumienie oddziaływań powierzchni komórkowych w skali nano.
- Wyniki te przyczyniają się do opracowania zaawansowanych biomateriałów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wysokoprzepustową nanolitografię w celu tworzenia jednorodnych wzorów białkowych na obszarach o skali centymetrowej, co rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad biomateriałami. Dzięki usprawnieniu zautomatyzowanego wyrównywania macierzy sond, metoda ta pozwala na powtarzalną funkcjonalizację powierzchni do badania oddziaływań między komórkami a materiałem. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnym etapie projektowania biomateriałów, dostarczając kontrolowanych podłoży w skali nano do badań przesiewowych mechanizmów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu nanotopografii na adhezję i morfologię mezenchymalnych komórek macierzystych, co wspiera walidację celów w szlakach mechanobiologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, wielkopowierzchniowe macierze białkowe, które zmniejszają zmienność w wczesnych testach przesiewowych fenotypowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie mierzalnych, jednorodnych wzorów tiolowych na podłożach złotych funkcjonalizowanych fibronektyną, co zapewnia spójną prezentację ligandów w testach komórkowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalną produkcję wzorcowanych podłoży do wysokoprzepustowych badań (high-content screening) odpowiedzi komórek macierzystych na bodźce materiałowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Tworzy istotne dla chorób podłoża do badania interakcji mezenchymalnych komórek macierzystych, dostarczając informacji niezbędnych do projektowania biomateriałów w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne powierzchnie nanostrukturalne, które łączą odkrycia badawcze z przedkliniczną walidacją właściwości materiałów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów, poprzez opracowanie testów, aż po przygotowanie modelu przedklinicznego, w szczególności w przypadku biomateriałów ukierunkowanych na nisze komórek macierzystych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnej kontroli nad zmiennymi powierzchniowymi w nanoskali, co pozwala na izolację ich wpływu na zachowanie komórek.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymywanie gotowych do analiz substratów o wysokiej jednolitości i powtarzalności, co jest kluczowe dla wiarygodnego przesiewania związków lub materiałów.
- Analityka: Generuje przestrzennie zdefiniowane wzory białkowe, które umożliwiają ilościowy pomiar odpowiedzi komórkowych, takich jak adhezja, rozprzestrzenianie się i różnicowanie.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście z przesiewania in vitro do oceny przedklinicznej dzięki zapewnieniu regulowanych powierzchni, które naśladują sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Zastosowania wielokrotne w przedsiębiorstwie: Stanowi potencjał platformy do generowania różnorodnych wzorów biomolekularnych w wielu projektach z zakresu nauki o materiałach oraz rozwoju terapii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad oddziaływaniami na powierzchni komórek dzięki precyzyjnemu wzorcowaniu w nanoskali.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i skalowalność wytwarzania podłoży w różnych laboratoriach i projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu prac (go/no-go) w rozwoju biomateriałów, dostarczając danych prognostycznych na temat reakcji komórek na zdefiniowane nanostruktury.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na biomateriały z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną wydajność w kontrolowanych testach oddziaływań.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii sondy skaningowej oraz technik nanofabrykacji opartych na polimerach.
- Zależy od dostępu do systemów mikroskopii sił atomowych z oprogramowaniem do automatycznego wyrównywania oraz komorami kontroli środowiska.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowywania PDMS, fabrykacji macierzy sond oraz funkcjonalizacji powierzchni pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu techniki na różne typy komórek lub białka macierzy pozakomórkowej inne niż fibronektyna.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność skrupulatnego przygotowania macierzy w celu zapewnienia integralności sond i jednorodnego kontaktu podczas litografii, zgodnie z opisem w protokole.
