Name: Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj nanolitografię sondy skanującej o dużym obszarze z automatycznym wyrównaniem do tworzenia nanostruktur dla badań nad interakcjami komórek mezenchymalnych z powierzchnią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z różnych źródeł, w tym z Brytyjskiej Rady ds. Badań nad Inżynierią i Naukami Fizycznymi (nr ref. grantu. EP/K011685/1, EP/K024485/1) oraz stypendium podyplomowe dla JH; Leverhulme Trust (RPG-2014-292); Fundusz Instytucjonalnego Wsparcia Strategicznego Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); oraz Uniwersytetowi w Manchesterze za Instytut Badawczy Uniwersytetu w Manchesterze (fundusz zalewania pompy UMRI) oraz Prezydenckie Stypendium Doktoranckie dla SW. Podziękowania za pomoc techniczną ze strony dr Andreasa Lieba (Nanosurf AG) są również wyrażane wdzięcznością.

<ol><li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/73/3/036501/meta">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501(2010).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Approaches+to+Nanofabrication%3A+Molding%2C+Printing%2C+and+Other+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li>
<li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Scanning+Probe+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li>
<li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/283/5402/661">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.125120">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li>
<li>Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li>
<li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid%3A+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li>
<li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li>
<li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/321/5896/1658">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li>
<li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hard-Tip%2C+Soft-Spring+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li>
<li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Force-Feedback%22+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li>
<li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra11967g">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li>
<li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multipoint+Force+Feedback%22+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/tc/c5tc00186b">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li>
<li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li>
<li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li>
<li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible%2C+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li>
<li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li>
<li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+%22Dip+Pen+Nanolithography%22%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104(2002).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la034464x">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li>
<li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li>
<li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour%3A+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavey%2C+MR+%22Plant+Cell+Culture%3A+Essential+Methods%22">Plant Cell Culture: Essential Methods</a>. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).</li>
<li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li>
<li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li>
<li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li>
</ol>

Algorytm i oprogramowanie wyrównania zostały opracowane przez Uniwersytet w Manchesterze i są jego własnością. Jest on dostępny do pobrania pod adresem http://www.click2go.umip.com/.

Protokół ten służy do zapewnienia użytkownikom wygodnej metodologii szybkiego przeprowadzania wzorców nanolitograficznych o wysokiej jednorodności i kontrolowanym rozmiarze elementu na dużych (cm2) obszarach. Podłoża zawierające te wielkopowierzchniowe nanowzorce mogą być następnie dalej opracowywane pod kątem różnych zastosowań. Jednym z głównych zastosowań tej technologii jest wytwarzanie nanowytwarzanych powierzchni do badań interakcji komórka-powierzchnia. Niniejszy raport przedstawia kilka ilustracyjnych przykładów hodowli komórkowych na tych materiałach, demonstrując kontrolę morfologii hMSC za pomocą nanoprefabrykowanych substratów.
Kluczowym czynnikiem umożliwiającym ten protokół jest automatyzacja procedury dopasowywania (krok 4), która umożliwia wysoce jednorodne i wysokowydajne wytwarzanie cech na powierzchniach, aż do rozdzielczości w skali nano, co umożliwia szybki obrót eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Litografia pióra polimerowego przeprowadzona przy użyciu tego algorytmu wyrównywania jest w stanie wygenerować cechy w nanoskali w ciągu około 30 minut. Powtarzalność i dokładność automatycznego wyrównywania, a tym samym jednorodność cech wzoru, jest jednak krytycznie zależna od jakości wytwarzanych układów sond (kroki 1 i 2). Wszelkie wady w ich przygotowaniu, które skutkują, uszkodzonymi lub brakującymi sondami; takie jak uwięzione pęcherzyki powietrza (krok 1.5) lub niewłaściwe oddzielenie sond od urządzenia głównego (krok 1.8) mogą skutkować niedokładnym wyrównaniem i niską jakością litografii.
Ta zgłoszona metoda ma wspólne ograniczenie z innymi metodami wyrównywania, które opierają się na siłowym sprzężeniu zwrotnym. Dokładne określenie, kiedy sondy stykają się z powierzchnią, jest ograniczone przez konieczność uwzględnienia drgań tła spowodowanych środowiskiem otoczenia i ruchem stolika na próbkę. Ogólnie rzecz biorąc, czujniki mają czułość na siłę w reżimie μN (w tym przypadku 2 μN), ale algorytm wyrównywania jest zaprojektowany tak, aby rejestrować tylko siłę co najmniej 490 μN jako ostateczny kontakt między sondami a powierzchnią, aby uniknąć "fałszywych alarmów" wynikających z szumu tła. 13 W związku z tym metoda ta ma tendencję do wytwarzania dużych cech (1-2 μm), ponieważ sondy muszą wydłużyć dużą odległość na osi z (z wynikającą z tego większą siłą), aby zarejestrować kontakt. W celu kompensacji można uzyskać mniejsze elementy, zmniejszając odległość osi z przebytą na etapie litografii (np. wprowadzenie ustawienia "" w kroku 5.2.3.2 jako 3 μm zamiast 5 μm).
Niemniej jednak, nawet przy tym ograniczeniu, algorytm automatyzacji jest w stanie zająć się krytycznym aspektem stosowania metod litografii z równoległą sondą skanującą, ponieważ wyrównanie było wcześniej najbardziej czasochłonnym i nieprecyzyjnym krokiem we wdrażaniu tych technik. Ta automatyzacja przesuwa teraz etap ograniczania szybkości procesu produkcyjnego z wyrównania na sam zapis litograficzny. Chociaż protokół ten demonstruje zastosowanie tej procedury dostosowawczej do PPL, ramy te mogą być stosowane do wielu technik SPL, takich jak lipid-DPN26 i litografia wspomagana matrycą27 , a także do potencjalnych przyszłych systemów sond katalitycznych. 28

Postęp w nanotechnologii zależy od rozwoju technik zdolnych do wydajnego i niezawodnego wytwarzania nanoskalowych cech na powierzchniach. 1,2 Jednak generowanie takich cech na dużych obszarach (wiele cm2) niezawodnie i przy stosunkowo niskich kosztach jest nietrywialnym przedsięwzięciem. Większość istniejących technik, wywodzących się z przemysłu półprzewodników, opiera się na fotolitografii ablacyjnej do wytwarzania "twardych" materiałów. Ostatnio techniki litograficzne wywodzące się z mikroskopii z sondą skaningową (SPM) stały się wygodnym i wszechstronnym podejściem do szybkiego prototypowania projektów w nanoskali. 3 techniki oparte na SPM są w stanie wygodnie i szybko "zapisać" dowolny wzorzec zdefiniowany przez użytkownika. Najbardziej znaną z nich jest nanolitografia zanurzeniowa (DPN), zapoczątkowana przez Mirkina i wsp., 4, w której sonda skanująca jest używana jako "pióro" do przenoszenia molekularnego "atramentu" na powierzchnię, wytwarzając cechy w sposób analogiczny do pisania. W warunkach otoczenia, gdy sonda jest skanowana po powierzchni, cząsteczki "tuszu" są przenoszone na powierzchnię przez menisk wodny, który tworzy się między sondą a powierzchnią (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). DPN umożliwia zatem nanolitograficzne osadzanie szerokiej gamy materiałów, w tym materiałów "miękkich", takich jak polimery i biomolekuły. 5 Opisano również powiązane techniki wykorzystujące sondy wyposażone w kanały do dostarczania płynów, różnie określane jako 'nanopipety' i 'nano-pióra wieczne'. 6,7,8
Główną przeszkodą dla szerszego zastosowania litografii pochodzącej z SPM jest przepustowość, ponieważ wymaga zbyt dużo czasu, aby narysować obszary w skali centymetrowej za pomocą jednej sondy. Wczesne wysiłki mające na celu rozwiązanie tego problemu koncentrowały się na równoległości DPN opartych na wspornikach, przy czym zarówno "jednowymiarowe", jak i "dwuwymiarowe" (2D) matryce sond były zgłaszane do litografii obszarów o rozmiarach centymetrowych. 5,9 Jednak te tablice wspornikowe są produkowane przy użyciu stosunkowo skomplikowanych, wieloetapowych metod produkcji i są stosunkowo delikatne. Wynalezienie litografii pióra polimerowego (PPL) rozwiązało ten problem poprzez zastąpienie standardowych wsporników SPM układem 2D miękkich sond z elastomeru siloksanowego połączonych ze szkiełkiem szklanym. 10 Ta prosta konfiguracja sondy znacznie zmniejsza koszty i złożoność tworzenia wzorów na dużych obszarach, otwierając nanolitografię na szerszy zakres zastosowań. Ta bezwspornikowa architektura została również rozszerzona o litografię z miękką sprężyną z twardą końcówką, <klasa sup = "xref">11, która zapewnia hybrydę miękkiego podłoża elastomerowego z twardymi silikonowymi końcówkami, co zapewnia lepszą rozdzielczość w porównaniu z wzorami wykonanymi przy użyciu miękkich końcówek elastomerowych.
Kluczowym czynnikiem w realizacji tych technologii matryc 2D jest to, że układ sondy musi być dokładnie równoległy do podłoża powierzchniowego, tak aby podczas litografii wszystkie sondy stykały się z powierzchnią jednocześnie. Nawet niewielka niewspółosiowość może spowodować dużą różnicę w rozmiarze elementu z jednej strony macierzy na drugą, ponieważ niektóre sondy wejdą w kontakt z powierzchnią wcześniej podczas opadania matrycy, podczas gdy inne wejdą w kontakt później lub wcale. 12 Dokładne wyrównanie jest szczególnie ważne w przypadku PPL ze względu na odkształcalność miękkich sond elastomerowych, gdzie sondy stykające się wcześniej z powierzchnią zostaną ściśnięte, pozostawiając większy ślad na powierzchni.
Wczesne prace nad PPL wykorzystywały czysto wizualną inspekcję do kierowania procesem dopasowywania, używając kamery zamontowanej nad tablicą do obserwacji deformacji sond piramidalnych podczas ich kontaktu z powierzchnią. 10 Wyrównanie oceniano poprzez obserwację, która strona sondy jako pierwsza zetknęła się z powierzchnią, a następnie dostosowanie kąta i powtarzanie procedury w sposób iteracyjny, aż różnica w kontakcie po każdej stronie sondy stała się niezauważalna dla oka. Ponieważ ta procedura wyrównywania opiera się na subiektywnej kontroli wzrokowej przez operatora, odtwarzalność jest niska.
Następnie opracowano bardziej obiektywne podejście, polegające na czujniku siły zamontowanym pod podłożem w celu zmierzenia siły przyłożonej przy kontakcie sond z powierzchnią. 12 Wyrównanie zostało osiągnięte poprzez dostosowanie kątów nachylenia w celu maksymalizacji wywieranej siły, co wskazywało, że wszystkie sondy były jednocześnie w kontakcie. Metoda ta wykazała, że możliwe jest wyrównanie z dokładnością do 0,004° powierzchni równoległej. To "wyrównywanie siłowego sprzężenia zwrotnego" zostało teraz wdrożone do w pełni zautomatyzowanych systemów w dwóch niezależnych raportach. 13,14 Oba wykorzystują triadę czujników siły zamontowanych pod podłożem lub nad tablicą i mierzą siłę wywieraną przy kontakcie między matrycami sond a powierzchnią. Systemy te zapewniają wysoką precyzję, zgłaszając niewspółosiowość ≤0,001° w skali o długości 1 cm,14 lub ≤ 0,0003° ponad 1,4 cm.13 Te zautomatyzowane systemy wyrównywania zapewniają również znaczne oszczędności czasu operatora i całkowitego czasu potrzebnego na ukończenie procesu litografii.
Jednym z głównych zastosowań wysokowydajnego wytwarzania powierzchni możliwego przez tę technologię jest generowanie substratów do hodowli komórkowych. Obecnie wiadomo, że fenotypem komórki można manipulować poprzez kontrolowanie początkowej interakcji między komórkami a cechami powierzchni, i że można to poprawić w nanoskali. 15 W szczególności, metody litografii sondą skaningową okazały się łatwą metodą do wytwarzania różnych nanofabrykowanych powierzchni dla takich eksperymentów z hodowlą komórkową. 16 Na przykład, powierzchnie prezentujące nanoskalowe wzory samoorganizujących się monowarstw i białek macierzy zewnątrzkomórkowej szablonowych przez PPL i DPN zostały wykorzystane do zbadania potencjału materiałów nanomodyfikowanych w indukowanym materiałem różnicowaniu komórek macierzystych. 17
Ten protokół opisuje wykorzystanie zmodyfikowanego systemu mikroskopu sił atomowych (AFM), który umożliwia wykonywanie PPL na dużym obszarze. Szczegółowo opisujemy wykrywanie siły za pomocą wielu czujników siły jako sposobu określania kontaktu sonda-powierzchnia, wraz z algorytmem, który automatyzuje iteracyjny proces ustawiania. Opisano późniejszą funkcjonalizację tych wzorców za pomocą białka macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyny i hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), jako demonstrację powierzchni wytwarzanych przez PPL stosowanych do hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM zamontowany na 5-osiowym napędzie silnikowym (XYZ&Theta; &Phi;) stolik translacyjny i goniometryczny</td><td>Oprogramowanie</td> sterujące AFM NanoSurf <td>P40008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>Długopis do grawerowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick plazma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>Plazma</td><td>Harrick</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomiczna pompa serwisowa suchego tlenu</td><td>Plazma Harrick</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy</td><td>Eksykator</td> próżniowy Stuart <td>SB3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Milli-Q</td> Modułowy generator wilgotności <td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td></td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipeta 100-1000 i mikro; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>Silicon masters</td><td>NIL Technology</td><td>custom-made</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny migawkowy</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy mikroskopowe</td><td></td><td>Olympus 10x i 60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop jasnego pola</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonograf</td><td>Ultrawave Sp. z o.o.</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny do rejestrowania i analizowania wyników automatycznego wyrównywania</td><td></td><td>Microsoft Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reodczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td>ŁATWOPALNY</td></tr><tr><td>mikroskop Sildes, przezroczysty, mielony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% kopolimer winylometylosiloksanu)-dimetylosiloksanu, zakończony trimetylosiloksanem, zakończony trimetylosiloksanem</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-tetrametylo-1,3,5,7-tetrawinylocyklotetrasiloksan</td><td></td><td>Gelest SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kompleksu platyny(0)-1,3-diwinylo-1,1,3,3-tetrametylodiloksanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>(25&ndash; 35% kopolimer metylohydrosiloksanu)-dimetylosiloksanu, zakończony trimetylosiloksanem</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>Łódź wagowa 100 ml</td><td>Naukowe materiały laboratoryjne</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna taśma węglowa</td><td>Agar scientific</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 16-merkaptoheksadekanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>ŁATWOPALNY</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe pokryte złotem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>Po otwarciu złoto pozostanie reaktywne z tiolami przez co najmniej 1 miesiąc</td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Azotan żelaza(III) niewodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>(11-Merkaptoundecylo)heksa(glikol etylenowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Azotan kobaltu(II) sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Trypsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> <td>"Detergent" w rękopisie</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Środek montażowy zapobiegający blaknięciu z wektorem DAPI</td><td> Laboratoria</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało antyfibronektynowe</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Drugorzędowe, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka T75 kolba</td><td>hodowlana Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>wspornikowa</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Mikroskopia z sondą skaningową umożliwiła stworzenie różnorodnych metod konstruktywnego ("addytywnego") wytwarzania cech w skali nanometrowej od góry do dołu. Historycznie rzecz biorąc, główną wadą litografii z sondą skanującą była z natury niska przepustowość systemów z pojedynczą sondą. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu matryc wielu sond, aby umożliwić zwiększenie przepustowości nanolitografii. Aby wdrożyć taką równoległą nanolitografię, niezbędne jest dokładne wyrównanie matryc sond z powierzchnią podłoża, tak aby wszystkie sondy stykały się z powierzchnią jednocześnie, gdy rozpoczyna się tworzenie wzoru litograficznego. Protokół ten opisuje wykorzystanie litografii pióra polimerowego do tworzenia cech w skali nanometrowej na obszarach o rozmiarach centymetrowych, ułatwione dzięki zastosowaniu algorytmu do szybkiego, dokładnego i automatycznego wyrównywania matryc sond. W tym przypadku nanolitografia tioli na podłożach złotych wykazuje generowanie cech o wysokiej jednorodności. Wzorce te są następnie funkcjonalizowane fibronektyną do wykorzystania w kontekście badań morfologii komórek skierowanych powierzchniowo.

Aby sprawdzić, czy automatyczne wyrównanie zakończyło się sukcesem, przeanalizowano wykresy sporządzone na podstawie danych z wyrównania (znajdujących się w arkuszu z kroku 4.8). W przypadku pomyślnego procesu wyrównania oba wykresy, odpowiadające kątom nachylenia stolika z próbką wzdłuż osi θ i φ, wykazywały serię rosnących i malejących punktów danych. Na każdym z wykresów dwa dopasowania liniowe punktów danych wskazywały wyraźnie zdefiniowany „szczyt” przecięcia, oznaczający maksymalne wysunięcie w osi z oraz odpowiadający mu kąt, pod którym osiągnięto wyrównanie (Rycina 4A i 4B). Proces ten powtarza się czterokrotnie (tzn. dwukrotnie dla każdej osi) i nanosi jako zestaw czterech współrzędnych. Przecięcie każdej pary współrzędnych wskazuje zatem ogólne kąty optymalne (Rycina 4C).13 W przypadkach, gdy wyrównanie nie powiodło się, można zaobserwować, że odpowiadające im wykresy kątów θ i φ nie dają dopasowań liniowych dobrej jakości lub nie przecinają się (Rycina 5). Takie nieudane wyrównania wynikają zazwyczaj z niewłaściwego przycięcia matryc lub ich nieprawidłowego montażu w uchwycie sondy (kroki 1.7, 1.8 i 2.2). W takich sytuacjach matryce utylizowano, przygotowano i zamontowano nowe (kroki 1 i 2), a następnie powtórzono proces wyrównania (krok 4).
Po pomyślnym dopasowaniu i litografii z użyciem MHA za pomocą PPL, wzorowane podłoża złote obrazowano przy użyciu mikroskopii sił bocznych, aby sprawdzić, czy doszło do depozycji. Przeprowadzono również badanie większego obszaru nadrukowanych powierzchni za pomocą mikroskopii optycznej podłoży po trawieniu złota niechronionego przez zdeponowany tiol (Rycina 6 oraz Rycina 7). Jednakże wytrawione wzory nie mogą być wykorzystane do dalszej funkcjonalizacji i powinny służyć jedynie do potwierdzenia wzorowania na reprezentatywnych próbkach z partii podłoży powierzchniowych. Jeśli wytrawione wzory wykazują puste obszary odpowiadające poszczególnym piórom (Rycina 8), wynik ten wskazuje, że wytworzenie macierzy sond nie powiodło się i że niektóre sondy są uszkodzone lub brakujące. Ta niejednorodność sond może wynikać z użycia starej matrycy, w której powłoka perfluorowana uległa zużyciu (krok 1.3), co prowadzi do oderwania niektórych sond podczas oddzielania macierzy od matrycy. W takich przypadkach należy użyć nowej matrycy. Wynik ten może być również spowodowany obecnością pęcherzyków powietrza uwięzionych między szklaną podstawką a matrycą (krok 1.5) lub tym, że macierz sond nie została czysto oddzielona od matrycy po utwardzaniu (krok 1.8).
Wykonano również obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej hMSC inkubowanych na powierzchniach funkcjonalizowanych fibronektyną (Rysunek 9). Ogólnie wszystkie podłoża pozostały stabilne w środowisku hodowli in vitro, a komórki przylgnęły i dostosowały swoją morfologię do wydrukowanych wzorów w przypadku mniejszych, odizolowanych macierzy struktur o wymiarach 20 x 20.
<img alt="Elastomerowy zestaw sond do tworzenia menisku wodnego; schemat przedstawiający zestaw sond i podłoża." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie litografii za pomocą polimerowych piór, pokazujące transport tuszu molekularnego poprzez menisk wodny na końcówce sondy. (A) Widok z boku i (B) widok z góry zestawu polimerowych piór wskazują, że gdy zestaw sond i podłoże powierzchniowe są w pełni wyrównane, wszystkie sondy stykają się z powierzchnią jednocześnie, co prowadzi do zrównoleglenia procesu litografii. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu AFM z matrycą polimerowych piór, uchwytem sondy i 5-osiową platformą pochylną do nanofabrykacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat układu do litografii polimerowym piórem. (A) Powiększony widok boczny układu eksperymentalnego, w którym przygotowana matryca sond jest przymocowana do uchwytu sondy i zamontowana w skanerze AFM. Podłoże umieszczone jest na platformie, pod którą znajdują się trzy czujniki siły. (B) Przedstawienie zmontowanej aparatury, pokazujące głowicę skanującą AFM względem platformy z próbką. (C) Widok od dołu pokazujący położenie czujników siły. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres czas-przemieszczenie, 10μm, spadek/wzrost 0,1s, statyczny schemat procesu, użytek edukacyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schematyczne przedstawienie programu spektroskopowego dla procedury wyrównania. Skaner AFM jest ustawiony tak, aby przesuwać sondy w kierunku próbki o odległość 10 µm w czasie 100 ms, utrzymywać je w tej pozycji przez 250 ms, a następnie wycofać o 10 µm w czasie 100 ms i utrzymać w pozycji wycofanej przez 250 ms. Ruch ten jest powtarzany przez cały proces wyrównania. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza równowagi statycznej; wykresy pozycji kątowej; punkty przecięcia; pozycje zmierzone a dopasowane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wykresy ilustrujące prawidłowe wyrównanie. Wykresy pozycji z w funkcji kątów nachylenia (A) θ oraz (B) φ dla prawidłowego wyrównania, gdzie ● oznacza wartości zmierzone, a + oznacza najlepsze dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów. (C) Wykres dopasowanych kątów φ w funkcji θ z czterema punktami, w których osiągnięto maksymalną pozycję z. Zaznaczony punkt przecięcia to końcowy optymalny kąt nachylenia dla obu osi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający analizę przecięcia pozycji z w stosunku do kąta z wartościami R², danymi pomiarowymi i dopasowanymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wykresy ilustrujące nieudaną kalibrację osiowości. Wykresy pozycji z w funkcji kątów nachylenia (A) θ oraz (B) φ dla nieudanej kalibracji, gdzie ● oznacza wartości rzeczywiste pomiarowe, a + oznacza najlepsze dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów. (C) Wykres dopasowanych kątów φ w funkcji θ z czterema punktami, w których osiągnięto maksymalną pozycję z. Nie zaobserwowano wyraźnych optimów ani punktu przecięcia, w związku z czym nie udało się wyznaczyć optymalnych kątów kalibracji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikrografia optyczna okresowych nanowzorów; wstawka przedstawia większe powiększenie; metoda nanofabrykacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Ilustracyjne obrazy z mikroskopii optycznej i mikroskopii sił atomowych złotych podłoży, na których naniesiono wzory z MHA za pomocą wyrównanych macierzy PPL, a następnie poddano je trawieniu. (A) i (B) to sekwencyjnie powiększone obrazy z mikroskopii optycznej wytrawionych wzorów; (C) to obraz topografii AFM pojedynczej siatki wzorów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy nanostrukturyzacji, przedstawiający powtarzające się wzory kotów przy różnych powiększeniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Ilustracyjne obrazy z mikroskopii optycznej podłoży złota, które zostały ustrukturyzowane MHA za pomocą wyrównanych macierzy PPL, a następnie trawione. (A) i (B) to sekwencyjnie powiększone obrazy z mikroskopii optycznej wytrawionych wzorów, a (C) to obraz o mniejszym powiększeniu, ukazujący jednorodne wzory na dużym obszarze. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat powierzchni mikrostruktury z trawioną laserowo siatką, skala 5 µm, wskazane wysunięcie osi z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Ilustracyjny obraz mikroskopii optycznej podłoża złota, które zostało nierównomiernie wzorowane za pomocą MHA, a następnie trawione. Zamierzone wzory (pokazane na wstawce) stanowiły powtarzające się siatki złożone z 20 linii kropek rozmieszczonych w 20 liniach, przy czym co dwie linie wysunięcie osi z zwiększano o 1 µm (w zakresie od 5 do -5 µm). Widać, że w niektórych obszarach nie powstały żadne wzory ze względu na brak sond w tych lokalizacjach. W obszarach, w których powstały tylko dwie linie kropek, wynik ten wskazuje, że sonda jest obecna, ale nie ma tej samej wysokości co sondy w pełni sprawne, więc osadza materiał tylko wtedy, gdy macierz jest wysunięta na pełną odległość osi z. Na tym obrazie kontrast został celowo zmieniony, aby umożliwić obserwację obszarów częściowo nadrukowanych. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia komórkowa, obrazowanie fluorescencyjne, analiza mitozy, matryca wielokomórkowa, skala 20μm-50μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej hMSC hodowanych na matrycach fibronektyny uformowanych za pomocą PPL. (A) i (B) to obrazy w dużym powiększeniu przedstawiające pojedyncze komórki. (C) pokazuje przykładowy wzór matrycy fibronektyny bez przylegającej komórki, a (D) to obraz w szerokim polu komórek hodowanych w układzie siatki (na wstawce przedstawiono również schemat nadrukowanego wzoru). Komórki są barwione w celu wykazania fibronektyny (czerwony), F-aktyny (zielony) i jąder komórkowych (niebieski). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Istnieje duże zapotrzebowanie na wygodne narzędzia do generowania cech i obiektów w skali nanometrowej, szczególnie w badaniu interakcji biologicznych z materiałami i powierzchniami nanostrukturalnymi. Protokół ten umożliwia szybką i jednorodną replikację macierzy białkowych w obszarach w skali centymetrowej z rozdzielczością nanoskali. To pozwala nam badać interakcje mezenchymalnych komórek macierzystych na tych powierzchniach.Te powierzchnie modelu pozwalają nam badać kontrolowane interakcje między określonymi zmiennymi materiałowymi a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, dostarczając podstawowych kryteriów projektowania materiałów, które będą informować o przyszłych projektach biomateriałów. Aby rozpocząć procedurę, należy dokładnie wymieszać składniki prepolimeru PDMS w łódce wagowej. Odgazowywać mieszaninę w eksykatorze próżniowym przez 20 minut lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki gazu znikną.Następnie umieść krzemowy wzorzec tablicy PPL na czterocentymetrowej szalce Petriego. Wlej odgazowaną mieszankę prepolimerów PDMS na wzorzec, aż zostanie całkowicie pokryta. Odgazuj PDMS, zakrywając mastera przez kolejne pięć minut.Podczas odgazowywania należy traktować szklane szkiełko plazmą tlenową przez jedną minutę. Po odgazowaniu ostrożnie umieść szkiełko na PDMS stroną poddaną obróbce skierowaną w dół. Delikatnie dociśnij szkiełko do silikonowego wzorca, aby usunąć uwięzione powietrze i upewnić się, że jednolita warstwa PDMS jest umieszczona między wzorcem a szkiełkiem.Przenieś umieszczoną w kanapce macierz PDMS na inną szalkę Petriego z krzemowym wzorcem na spodzie. Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Następnie wyjmij utwardzoną matrycę PPL z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia przez 15 minut.Użyj żyletki, aby ostrożnie przyciąć nadmiar PDMS z tyłu i po bokach szklanego szkiełka. Zdmuchnij luźne zanieczyszczenia PDMS strumieniem suchego azotu gazowego. Ważne jest, aby przyciąć nadmiar PDMS z tyłu i krawędzi macierzy, aby umożliwić dokładne wyrównanie.Pomaga to również użytkownikowi w lepszej obserwacji warunków panujących pod AFM podczas litografii. Wciśnij żyletkę w róg matrycy na głębokość jednego milimetra i ostrożnie podważ matrycę z krzemowego wzorca jednym, ciągłym ruchem podnoszenia. Następnie ostrożnie odetnij i zeskrob 0,5 milimetra PDMS na krawędziach tablicy za pomocą żyletki.Użytkownicy powinni być bardzo ostrożni podczas podważania matryc od urządzenia głównego, aby zapewnić dobrą separację i uniknąć uszkodzenia sond. Powinno to być wykonane w jednym, płynnym działaniu, bez opadania matryc z powrotem na krzemowy master. Potraktuj matrycę PPL plazmidem tlenowym przez 30 sekund, a następnie upuść 20 mikrolitrów dejonizowanej wody na powierzchnię tablicy.Jeśli woda nie rozprowadza się równomiernie po całej matrycy, należy powtórzyć zabieg plazmowy. Dokładnie wysusz matrycę poddaną obróbce plazmowej, a następnie użyj dwustronnej taśmy węglowej, aby przymocować matrycę do uchwytu sondy mikroskopowej sił atomowych. Zamontuj uchwyt sondy na uchwycie kinematycznym AFM.Aby nanieść matrycę na matrycę, nałóż na nią 20-mikrolitrową kroplę jednomilimolowego roztworu MHA w etanolu, unikając kontaktu między końcówką pipety a powierzchnią matrycy. Poczekaj, aż roztwór MHA rozprzestrzeni się w całej tablicy. Poczekaj, aż etanol wyparuje.Zamontuj uchwyt sondy z matrycą PPL na AFM, a następnie umieść złote podłoże na środku stolika na próbki AFM. Przymocuj podłoże na miejscu za pomocą taśmy klejącej. Aby rozpocząć wyrównywanie, uruchom stage program konfiguracyjny kontrolera, aby zresetować wszystkie osie i kąty do wstępnie skalibrowanego punktu zerowego.Użyj konsoli sterowania osią X i osi Y pobierania próbek AFM, aby przesunąć podłoże do żądanej lokalizacji drukowania. Przełącz dźwignię zwalniającą stolik, aby zwolnić stolik na próbkę i aktywować czujniki siły. Pozwól czujnikom zrównoważyć się przez co najmniej 15 minut, a następnie użyj kontrolera osi Z, aby podnieść stolik próbki, aż układ znajdzie się wizualnie jak najbliżej podłoża.Upewnij się, że tablica znajduje się w odległości nie większej niż jeden milimetr od podłoża. Następnie otwórz program automatycznego wyrównywania. Wypełnij stopień kąta, odstęp kroku zgrubnego i odstęp kroku drobnego.Ustaw ścieżkę do pliku arkusza kalkulacyjnego i dołącz szablon arkusza kalkulacyjnego. Następnie otwórz oprogramowanie sterujące AFM i przejdź do sekcji spektroskopii. Skonfiguruj oscylację osi Z głowicy skanującej tak, aby rozszerzała się o 10 mikrometrów przez 100 milisekund, przytrzymywała przez 250 milisekund, cofała o 10 mikrometrów przez 100 milisekund i utrzymywała przez 250 milisekund.Uruchom oscylację głowicy skanującej i uruchom automatyczne wyrównywanie. Gdy oprogramowanie wskaże, że wyrównanie zostało zakończone, zakończ proces wyrównywania. Sprawdź automatycznie wygenerowane dopasowanie liniowe danych osiowania, aby określić, czy wyrównanie się powiodło i określić ogólne optymalne kąty, a następnie podnieś stolik próbki w krokach co 500 nanometrów, aż do momentu zaobserwowania kontaktu między matrycą a podłożem za pomocą kamery AFM z widokiem z góry.Kliknij przycisk Stop w oprogramowaniu sterującym AFM, aby cofnąć matrycę o 10 mikrometrów. Aby rozpocząć proces PPL, otwórz sekcję litografii w oprogramowaniu sterującym AFM. Wybierz tryb pracy modulacji Z i przejdź do wzorca litograficznego, który chcesz zaimportować.Wpisz rozmiar wzoru, który ma zostać wygenerowany. Ustaw przesunięcie początku układu współrzędnych na 25 mikrometrów na obu osiach X i Y, a następnie wybierz pozycję Modulacja bezwzględna Z, ustaw przyrząd tak, aby uprościł na dwie warstwy i ustaw wartości czerni i bieli odpowiednio na pięć i minus pięć mikrometrów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować ustawienia i zamknąć okno.Otwórz edytor warstw z okna litografii i ustaw czas pauzy. Następnie opuść komorę izolacji atmosferycznej na AFM i otwórz jego oprogramowanie sterujące. Ustaw wilgotność względną na 45%, temperaturę 25 stopni Celsjusza i natężenie przepływu wymiany atmosfery na 500 mililitrów.Wprowadź ustawienia i poczekaj, aż zostanie osiągnięty żądany poziom wilgotności. Następnie rozpocznij sekwencję litograficzną. Po zakończeniu litografii cofnij stolik o 500 mikrometrów.Wyjmij komorę izolacji atmosferycznej. Zablokuj stolik na próbkę, aby dezaktywować czujniki siły. Na koniec usuń podłoże ze sceny w celu wizualizacji lub dalszej obróbki.PPL wykorzystano do wytworzenia wielkoskalowych jednorodnych wzorów drobnych siatek tablicowych lub szczegółowych obrazów. Wzory zostały uwidocznione do mikroskopii optycznej poprzez wytrawienie złota niechronionego przez osadzony tiol. Nieregularne wzory wskazywałyby na uszkodzone lub brakujące sondy.Macierze MHA wydrukowane na złocie za pomocą PPL funkcjonalizowano fibronektyną i inkubowano z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Poszczególne komórki przylegały do układów funkcjonalizowanych fibronektyną, dostosowując swoją morfologię do wzorców, gdy było to konieczne. Ta technika PPL może być wykorzystana do deponowania szerokiej gamy wzorów białek do eksperymentów biologii komórki.Doświadczony użytkownik może wygenerować wzorce, takie jak te pokazane, w ciągu około trzech godzin. Pamiętaj, że skrupulatne przygotowanie tablicy to klucz do sukcesu. Technika PPL jest dość ogólna i może być stosowana do osadzania związków, od małych cząsteczek po polimery i biomolekuły, torując drogę do różnorodnych badań w chemii, biologii i materiałoznawstwie.

large-area-scanning-probe-nanolithography-facilitated-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Nanoskopia sondy koloidalnej może być używana w różnych dziedzinach, aby uzyskać wgląd w fizyczną stabilność i kinetykę krzepnięcia systemów koloidalnych oraz pomóc w odkrywaniu leków i naukach o recepturach przy użyciu systemów biologicznych. Opisana w nim metoda dostarcza ilościowych i jakościowych środków do badania takich systemów.

Ilościowe i jakościowe badanie oddziaływań cząstka-cząstka za pomocą nanoskopii sondy koloidalnej

Przedstawiamy protokół łączący metrologię atomową Skaningowego Mikroskopu Tunelowego do modelowania powierzchni z selektywnym osadzaniem warstw atomowych i reaktywnym trawieniem jonowym. Korzystając z solidnego procesu obejmującego liczne ekspozycje atmosferyczne i transport, wytwarzane są nanostruktury 3D z metrologią atomową.

Wytwarzanie nanostruktur identyfikowalnych atomowo

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Używamy skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego z korekcją aberracji, aby zdefiniować jednocyfrowe wzorce nanometrowe w dwóch powszechnie stosowanych rezystancjach wiązki elektronów: poli (metakrylan metylu) i silseskwioksan wodoru. Wzory rezystancji mogą być powielane w wybranych materiałach docelowych z jednocyfrową dokładnością nanometrową przy użyciu liftoffu, trawienia plazmowego i infiltracji odporności przez metaloorganiczne.

Litografia wiązką elektronów w jednocyfrowych nanometrach z skaningowym transmisyjnym mikroskopem elektronowym z korekcją aberracji

Wykazaliśmy, że wytrawianie nano-architektury w wewnątrzkorowych urządzeniach mikroelektrodowych może zmniejszyć reakcję zapalną i ma potencjał do poprawy zapisów elektrofizjologicznych. Opisane w niniejszym dokumencie metody nakreślają podejście do wytrawiania nanoarchitektur na powierzchni niefunkcjonalnych i funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem wewnątrzkorowym.

Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Wielkoskalowa kontrola próbek z rozdzielczością nanoskali ma szeroki zakres zastosowań, szczególnie dla nanofabrykowanych płytek półprzewodnikowych. Mikroskopy sił atomowych mogą być doskonałym narzędziem do tego celu, ale są ograniczone przez szybkość obrazowania. W tej pracy wykorzystuje się równoległe aktywne układy wspornikowe w AFM, aby umożliwić inspekcje o wysokiej przepustowości i na dużą skalę.

Mikroskopia sił atomowych z sondą aktywną z układami wspornikowymi Quattro-Parallel do wysokowydajnej kontroli próbek na dużą skalę

Poznaj nanolitografię sondy skanującej o dużym obszarze z automatycznym wyrównaniem do tworzenia nanostruktur dla badań nad interakcjami komórek mezenchymalnych z powierzchnią.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi (Wideo) | JoVE Journal

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Przeglądaj więcej filmów