Name: Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy klonalnej prekursorów komórek macierzystych krwi podczas embriogenezy myszy przy użyciu sortowania indeksu pojedynczych komórek z kohodowlą komórek śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Andrew Bergerowi, Stacey Dozono i Brianowi Radenowi z Fred Hutchinson Flow Cytometry Core za pomoc w FACS. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health NHLBI UO1 grant #HL100395, Ancillary Collaborative Grant #HL099997 oraz NIDDK grant #RC2DK114777. Brandon Hadland jest wspierany przez Fundację Alex's Lemonade Stand i Fundację Hyundai Hope on Wheels.

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells%2Flong-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent%2C+IL-3-independent+CD43%28-%29+embryonic+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li>
<li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
<li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis%3A+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).</li>
<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
<li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li>
<li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis%3A+emergence+of+erythroid%2C+megakaryocyte%2C+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie genezy HSC podczas rozwoju embrionalnego wymaga środków do wykrywania potencjału HSC w prekursorach hemogennych, ale brakuje im kompetencji do zapewnienia długotrwałej wieloliniowej rekonstytucji krwiotwórczej u przeszczepionych dorosłych biorców. W tym protokole przedstawiamy test klonalny embrionalnych prekursorów hemogennych metodą kohodowli zrębu na niszowych EC naczyniowych z AGM, który wspomaga dojrzewanie prekursorów do HSC, z późniejszą analizą funkcjonalną w testach transplantacyjnych. Włączenie sortowan...

Badania klonalne wykazały niejednorodność długoterminowych właściwości wszczepiania dorosłych HSC, dostarczając nowych informacji na temat podtypów HSC i zmian w zachowaniu HSC podczas starzenia1. Jednak podobne badania nad embrionalnymi HSC i ich prekursorami były bardziej wymagające. Podczas wczesnego rozwoju embrionalnego HSC powstają z populacji prekursorów znanych jako śródbłonek hemogenny w przejściowym procesie zwanym przejściem śródbłonka do układu krwiotwórczego2. Pierwszy HSC, zdefiniowany przez ich zdolność do zapewnienia solidnego, długoterminowego wszczepienia wieloliniowego po przeszczepieniu do uwarunkowanych dorosłych biorców, nie jest wykrywany aż do 10,5 dnia embrionalnego (E10,5) w zarodku mysim, z bardzo niską częstotliwością3. W trakcie swojego rozwoju prekursory HSC (pre-HSC) powstające z hemogennego śródbłonka muszą przejść proces dojrzewania przed uzyskaniem właściwości dorosłego HSC, które pozwalają na skuteczne wszczepienie w testach transplantacyjnych4,5,6. Przesłaniając badania nad rzadkim pochodzeniem HSC, wiele krwiotwórczych komórek progenitorowych o potencjale erytroidalnym, szpikowym i limfoidalnym zostało wykrytych jeszcze przed pojawieniem się HSC z klasy pre-HSC<sup="xref">7,8. W związku z tym odróżnienie pre-HSC od innych hematopoetycznych komórek progenitorowych wymaga metod klonalnej izolacji komórek i dostarczenia im sygnałów wystarczających do ich dojrzewania do HSC, aby wykryć ich właściwości wszczepienia w testach transplantacyjnych.
Opisano wiele podejść, które pozwalają na wykrycie pre-HSC poprzez dojrzewanie do HSC ex vivo lub in vivo. Metody ex vivo zależały od hodowli tkanek embrionalnych, takich jak region AGM, w którym pierwsze HSC są wykrywane w develop9. Opierając się na tych metodach, protokoły, które obejmują dysocjację, sortowanie i ponowną agregację tkanek AGM, pozwoliły na scharakteryzowanie posortowanych populacji zawierających prekursory HSC podczas rozwoju od E9.5 do E11.5 w regionach przyaaortalnej splanchnopleury (P-Sp)/AGM4,5,10; Jednak podejścia te nie są podatne na wysokoprzepustową analizę prekursorów na poziomie pojedynczej komórki wymaganą do analizy klonalnej. Podobnie, dojrzewanie in vivo przez przeszczepienie nowonarodzonym myszom, gdzie zakłada się, że mikrośrodowisko jest bardziej odpowiednie do wspierania wcześniejszych stadiów prekursorów HSC, umożliwiło również badania posortowanych populacji z woreczka żółtkowego i AGM/P-Sp (P-Sp jest regionem prekursorowym AGM) z cechami pre-HSC, ale metody te również nie zapewniają solidnej platformy do analizy pojedynczych komórek11, 12.
Badania przeprowadzone przez Rafii et al. wykazały, że zrąb komórek śródbłonka (EC) aktywowany Aktem może stanowić niszowy substrat do wspierania samoodnawiania się dorosłych HSC in vitro13,14,15. Niedawno ustaliliśmy, że EC aktywowany Aktem pochodzący z regionu AGM (AGM-EC) zapewnia odpowiednią niszę in vitro do dojrzewania prekursorów hemogennych, wyizolowanych już w fazie rozwoju E9, do wszczepienia HSC w wieku dorosłym, a także późniejszej samoodnowy wygenerowanej klasy HSC16. Biorąc pod uwagę, że system ten wykorzystuje prostą dwuwymiarową kokulturę, można go łatwo przystosować do analizy klonalnej potencjału HSC indywidualnie izolowanych prekursorów hemogennych.
Niedawno opisaliśmy podejście do badania potencjału HSC klonalnych prekursorów hemogenicznych poprzez połączenie sortowania indeksowego poszczególnych prekursorów hemogennych z mysich zarodków z kokulturą AGM-EC i późniejszą analizę funkcjonalną w testach transplantacyjnych17. Sortowanie indeksowe to tryb sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), który rejestruje (indeksuje) wszystkie parametry fenotypowe (tj. rozproszenie do przodu (FSC-A), rozproszenie boczne (SSC-A), parametry fluorescencji) każdej indywidualnie posortowanej komórki, tak aby cechy te można retrospektywnie skorelować z późniejszą analizą funkcjonalną po sortowaniu. Oprogramowanie FACS rejestruje zarówno informacje fenotypowe dla każdej komórki, jak i pozycję/dołek 96-dołkowej płytki, w której została umieszczona. Technika ta była wcześniej elegancko stosowana do identyfikacji heterogeniczności w dorosłym HSC, określania parametrów fenotypowych, które dodatkowo wzbogacają długoterminowy podzbiór HSC do wszczepiania, oraz korelowania parametrów fenotypowych HSC z właściwościami transkrypcyjnymi na poziomie pojedynczej komórki18,19. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię tego podejścia, która umożliwia identyfikację unikalnych parametrów fenotypowych i wkładu liniowego pre-HSC we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego.

<table><tbody><tr><td>AGM-EC podłoża hodowlane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały do hodowli komórek śródbłonka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Służy do dysocjacji monowarstw AGM-EC</td></tr><tr><td>Żelatyna 0,1% w wodzie</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Służy do przyklejania monowarstw AGM-EC do tworzywa sztucznego</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Służy do wspólnej hodowli monowarstw AGM-EC i klonów sortowanych indeksowo</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Służy do rozwarstwiania i barwienia FACS</td></tr><tr><td>Butelki filtracyjne 500 ml</td><td>Fisher Scientific 9741202</td><td></td><td>Służy do sterylnego filtrowania Pożywki śródbłonkowe</td></tr><tr><td>AGM-EC podłoża hodowlane (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Hyclone Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg rozpuszczona w 10 ml pożywki</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Mitogen śródbłonka (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Dodaj 10 ml pożywki do rozpuszczenia i dodaj</td></tr><tr><td>Materiały do sortowania indeksu AGM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenaza (0,25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Zastosowanie do dysocjacji tkanek embrionalnych</td></tr><tr><td>Strzykawka 3ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Służy do sterylnego filtrowania roztworów przeciwciał dla FACS</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; Filtr napędzany strzykawką</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Służy do sterylnego filtrowania roztworów przeciwciał do probówki polistyrenowej FACS</td></tr><tr><td>5 ml z nasadką sitową</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Służy do usuwania grudek komórek przed FACS</td></tr><tr><td>DAPI (przygotowany jako 1 mg/ml zapasu w H2O)</td><td>Milipore</td><td>268298</td><td>Służy do wykluczania martwych komórek z sortowania</td></tr><tr><td>anty-mysie CD16/CD32 (blok FcR)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Służy do blokowania niespecyficznego barwienia receptorów Fc</td></tr><tr><td>Przeciwciała do sortowania indeksu AGM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysz CD144 PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG1 kappa Kontrola izotypu, PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Kontrola izotypu dla CD144 PE-cyjanina7</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Kontrola izotypu dla CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anty-mysi CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG1 kappa Kontrola izotypu, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>Kontrola izotypu dla CD41 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Kontrola izotypu dla pożywki wolnej od surowicy CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>rekombinowany czynnik mysich komórek macierzystych (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki ligand FLT3 (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 20 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinowana mysia interleukina-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (zapas 100 mg/ml) Stężenie końcowe 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Materiały do barwienia współhodowanych komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 dołk, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Zastosowanie do analizy FACS</td></tr> <tr><td>Przeciwciała do analizy klonów sortowanych indeksowo współhodowanych z komórkami śródbłonka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-cyjanina5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PE-cyjaninina5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Kontrola izotypu dla CD45 PerCP-Cyjanina5.5</td></tr><tr><td>Anty-mysi CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2b kappa Kontrola izotypu, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Kontrola izotypu dla CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td> Kontrola izotypu szczura <td>barwiącego</td></tr><tr><td>IgG2a kappa, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Kontrola izotypu Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG2a kappa Staining Rat, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Kontrola izotypu dla F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-mysz Ly-6G/C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczurów IgG2b kappa Kontrola izotypu, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Kontrola izotypu dla Ly-6G/C i CD3 FITC</td></tr><tr><td>Materiały do iniekcji żyły ogonowej do przeszczepu</td><td></td><td></td><td></td></tr>1<tr><td>/2 ml strzykawki insulinowe z igłami 29G 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>Służy do wstrzykiwania żyły ogonowej do przeszczepu</td></tr><tr><td>Przeciwciała do analizy krwi obwodowej po translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysim Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie Kontrola izotypu szczura IgG2b kappa, Kontrola izotypu PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>dla Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu szczura IgG2a kappa, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>Kontrola izotypu dla F4/80 PE</td></tr><tr><td>Anty-mysie CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>anty-mysie CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2a kappa Kontrola izotypu, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Kontrola izotypu dla CD19 APC</td></tr><tr><td>Anti-mysz CD45.1 (A20) PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>szczura IgG2a kappa Kontrola izotypu, PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>Kontrola izotypu dla CD45.1 PE-cyjaniny7</td></tr><tr><td>Anty-mysia CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG2a kappa Staining Rat IgG2a, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>Kontrola izotypu dla CD45.2 APC-eFluor780</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II z oprogramowaniem DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II z czytnikiem płytek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>Do Oprogramowanie do analizy FACS komórek dozujących</td></tr><tr><td></td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Możliwość badania genezy hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) podczas rozwoju embrionalnego została ograniczona przez rzadkość prekursorów HSC we wczesnym stadium zarodka i brak testów, które funkcjonalnie identyfikują długoterminowy potencjał wszczepienia wieloliniowego poszczególnych domniemanych prekursorów HSC. W tym miejscu opisujemy metodologię, która umożliwia izolację i charakterystykę funkcjonalnie zwalidowanych prekursorów HSC na poziomie pojedynczej komórki. Po pierwsze, wykorzystujemy sortowanie indeksowe do skatalogowania dokładnego parametru fenotypowego każdej indywidualnie posortowanej komórki, wykorzystując kombinację markerów fenotypowych w celu wzbogacenia prekursorów HSC o dodatkowe markery do analizy eksperymentalnej. Po drugie, każda komórka posortowana indeksem jest hodowana wspólnie ze zrębem niszy naczyniowej z regionu aorta-gonad-mesonephros (AGM), co wspiera dojrzewanie niewszczepialnych prekursorów HSC do funkcjonalnego HSC z wieloliniowym, długoterminowym potencjałem wszczepienia w testach transplantacyjnych. Metodologia ta umożliwia korelację właściwości fenotypowych klonalnych prekursorów hemogennych z ich funkcjonalnym potencjałem wszczepienia lub innymi właściwościami, takimi jak profil transkrypcyjny, zapewniając środki do szczegółowej analizy rozwoju prekursorów HSC na poziomie pojedynczej komórki.

Rysunek 1A przedstawia schemat planu eksperymentalnego. Po wycięciu, połączniu i dysocjacji tkanek P-Sp/AGM w kolagenazie, barwi się je przeciwciałami przeciwko VE-Cadherin i EPCR w celu przeprowadzenia sortowania indeksowanego. Pre-HSC są wzbogacone w komórkach sortowanych jako VE-Cadherin+EPCRhigh (Rysunek 1B). Można zastosować inne przeciwciała sprzężone z fluorochromami, aby retrospektywnie przeanalizowa...

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Ogólnym celem tej metody jest identyfikacja właściwości fenotypowych i potencjału wszczepienia klonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych lub prekursorów HSC podczas rozwoju embrionalnego myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoezy rozwojowej dotyczące unikalnego wkładu liniowego prekursorów klonalnych HSC podczas rozwoju embrionalnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że prekursory hemogenne są analizowane na poziomie pojedynczej komórki.Pozwala to na identyfikację unikalnych właściwości fenotypowych, które odróżniają rzadkie prekursory HSC. Zacznij od dodania Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, tkanek wypreparowanych z zarodków między 9,5 a 11,5 dnia po stosunku do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów PBS uzupełnionych 10% FBS na lodzie. Gdy tkanki osiądą na dnie probówki, odessać supernatant i natychmiast dodać jeden mililitr 0,25% kolagenazy do próbek.Po 25 minutach w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję za pomocą jednego mililitra PBS plus FBS i użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozcierać tkanki od 20 do 30 razy, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następni

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film opisuje protokół izolowania HSPC ze szpiku kostnego i sortowania ich za pomocą techniki fluorescencyjnie aktywowanego sortowania komórek, która jest metodą uzyskiwania pojedynczo sortowanych HSPC. Hodujemy te posortowane komórki, aby uzyskać klony HSPC.

Hodowla i zbiór klonów HSPC: metoda uzyskiwania pojedynczo sortowanych klonów HSPC

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Poznaj metodę analizy klonalnej prekursorów komórek macierzystych krwi podczas embriogenezy myszy przy użyciu sortowania indeksu pojedynczych komórek z kohodowlą komórek śródbłonka.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów