Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Ogólnym celem tej metody jest identyfikacja właściwości fenotypowych i potencjału wszczepienia klonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych lub prekursorów HSC podczas rozwoju embrionalnego myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoezy rozwojowej dotyczące unikalnego wkładu liniowego prekursorów klonalnych HSC podczas rozwoju embrionalnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że prekursory hemogenne są analizowane na poziomie pojedynczej komórki.

Pozwala to na identyfikację unikalnych właściwości fenotypowych, które odróżniają rzadkie prekursory HSC. Zacznij od dodania Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, tkanek wypreparowanych z zarodków między 9,5 a 11,5 dnia po stosunku do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów PBS uzupełnionych 10% FBS na lodzie. Gdy tkanki osiądą na dnie probówki, odessać supernatant i natychmiast dodać jeden mililitr 0,25% kolagenazy do próbek.

Po 25 minutach w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję za pomocą jednego mililitra PBS plus FBS i użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozcierać tkanki od 20 do 30 razy, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie rozcieńczyć komórki dodatkowymi ośmioma mililitrami PBS plus FBS i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu blokującego na pięć minut na lodzie.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów interesującego nas koktajlu przeciwciał. Po 15 do 20 minutowej inkubacji na lodzie, umyj komórki w ośmiu mililitrach PBS plus FBS i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżego PBS plus FBS. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 35 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki, myjąc sitko dodatkowymi trzema mililitrami PBS plus FBS, aby zebrać wszystkie komórki i ponownie odwirować komórki.

Następnie ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach PBS plus FBS i umieść komórki na lodzie. Aby ustawić bramki do sortowania w trybie sortowania pojedynczej komórki i sortowania indeksowego, załaduj małą porcję komórek do cytometru przepływowego i ustaw akwizycję na najniższe natężenie przepływu. Otwórz wykres obszaru punktowego z przodu i bocznego obszaru punktowego i ustaw bramkę tak, aby zawierała komórki o różnych rozmiarach.

Otwórz wykres szerokości punktowej obszaru punktowego do przodu i wykresu szerokości punktowego obszaru punktowego z boku i ustaw bramę na każdym wykresie, aby wykluczyć dublety. Ustaw obszar rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem DAPI, aby zabramować żywe komórki. Następnie utwórz wykres kadheryny śródbłonka przeciw receptorowi białka C przeciw śródbłonkowi i zabramuj komórki dodatnie kadheryny śródbłonka naczyniowego i komórki o wysokiej ekspresji receptora białka C śródbłonka.

Aby posortować indeksowo komórki aorty-gonad-śródnercza, umieść 96-dołkową płytkę wstępnie wyhodowaną z komórkami śródbłonka AGM w pożywce bez surowicy AGM z cytokinami do bloku płytki cytometru przepływowego i załaduj próbkę eksperymentalną. Rozpocznij pobieranie próbki i upewnij się, że tryb sortowania pojedynczej komórki z indeksem jest wybrany do sortowania pojedynczej komórki do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Po posortowaniu jednej komórki do każdego dołka płytki, umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na okres do siedmiu dni.

Pod koniec okresu kohodowli kolonie krwiotwórcze o różnych rozmiarach i morfologiach można uwidocznić za pomocą mikroskopu odwróconego w 100-krotnym powiększeniu. Aby przeanalizować klony za pomocą cytometrii przepływowej, użyj wielokanałowej pipety, aby oddzielić komórki krwiotwórcze od warstw śródbłonka bez odłączania komórek śródbłonka. Następnie przenieś 100 mikrolitrów komórek do indywidualnych studzienek nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i zwróć oryginalną 96-dołkową płytkę zawierającą pozostałe 100 mikrolitrów komórek do inkubatora do hodowli tkankowej.

Osadzać komórki na dolnej płytce w kształcie litery V przez odwirowanie i usuwać supernatant, odwracając i przesuwając płytkę jednym szybkim ruchem. Zawiesić granulki w każdej studzience z 50 mikrolitrami buforu blokującego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj interesujący koktajl przeciwciał do każdej studzienki na 20-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami PBS plus FBS, przesuwając płytkę na końcu wirowania, aby odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach PBS plus FBS i przeanalizować komórki zgodnie ze standardowymi protokołami analizy przepływu w celu wykrycia kolonii zawierających potencjał hematopoetycznych komórek macierzystych. Wybierając studzienki, które zawierają komórki z fenotypem hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą analizy przepływu, użyj pipety wielokanałowej, aby zawiesić pozostałe 100 mikrolitrów komórek z oryginalnej kohodowli i dodaj pięć razy 10 do czwartego ratowania komórek szpiku kostnego w 100 mikrolitrach PBS plus 2% FBS do każdej studzienki.

Po adopcyjnym przeniesieniu każdego klonu do pojedynczych, śmiertelnie napromieniowanych kongenicznych zwierząt biorców, należy pobrać próbki krwi obwodowej od wszczepionych zwierząt w regularnych odstępach czasu po przeszczepie. Aby zidentyfikować klony z długotrwałym wszczepieniem, należy przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami analizy przepływu. Właściwości fenotypowe każdego klonu można następnie skorelować z jego właściwościami wszczepienia.

Prehematopoetyczne komórki macierzyste mogą być wzbogacone o dodatnią kadherynę śródbłonka naczyniowego i wysoki poziom ekspresji receptora C białka śródbłonka. Barwienie innymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem pozwala na retrospektywną analizę dodatkowych parametrów fenotypowych, które można zarejestrować dla każdej komórki podczas sortowania indeksu. Po posortowaniu indeksu na kohodowle komórek śródbłonka aorty-gonad-mesonephros, poszczególne klony integrują się z warstwą komórek śródbłonka aorty-gonad-mesonenerki, zanim klony zaczną się zaokrąglać i tworzyć klastry krwiotwórcze.

Po pięciu do siedmiu dniach wspólnej hodowli można wykryć kolonie o różnych rozmiarach i morfologii. Tutaj pokazano cztery różne kolonie uzyskane w wyniku kohodowli, z trzema koloniami wykazującymi różne proporcje fenotypowych hematopoetycznych komórek macierzystych wraz z innymi, bardziej zróżnicowanymi typami komórek, a czwarta kolonia nie ma komórek z ekspresją markera hematopoetycznych komórek macierzystych. Adoptywny transfer potomstwa komórek klonu umożliwia ocenę długoterminowej zdolności do wszczepienia w wielu liniach każdego klonu po wkładzie dawcy do przedziałów mieloidalnych komórek B i T krwi obwodowej biorcy w czasie.

Chociaż większość kolonii zawierających komórki o fenotypie hematopoetycznych komórek macierzystych osiągnęła długotrwałe wszczepienie, przeszczep jest konieczny do potwierdzenia funkcjonalnego wszczepienia wieloliniowego, ponieważ niektóre klony tracą wszczepienie z czasem. Funkcjonalny potencjał hematopoetycznych komórek macierzystych każdego klonu można następnie skorelować z powrotem z oryginalnymi parametrami sortowania indeksu tego klonu, aby zidentyfikować jego dokładne cechy fenotypowe. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wtórna hodowla krwiotwórczego potomstwa na zrębie wspierającym rozwój komórek B i T in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące potencjałów limfocytów poszczególnych prekursorów hemogennych.