Name: Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj półautomatyczną metodę sekwencjonowania 16S rRNA z mleka kobiecego i innych próbek o niskiej biomie. Protokół ułatwia badanie mikrobiomu człowieka w kontekście zdrowia i chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Helty Adisetiyo i dr Shangxin Yang za opracowanie protokołu. Ogólne wsparcie dla Międzynarodowej Grupy ds. Badań Klinicznych AIDS u Młodzieży Matki (IMPAACT) zostało udzielone przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) w ramach nagród o numerach UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) i UM1AI106716 (IMPAACT LC), przy współfinansowaniu ze strony Eunice Kennedy Shriver Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka (NICHD) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (NIMH). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental%2C+tongue%2C+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).</li>
<li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).</li>
<li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects%3A+Tools%2C+techniques%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li>
<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52(2017).</li>
<li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing%3A+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561(2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li>
<li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatr+Scand%22%5BJournal%5D)">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li>
<li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li>
<li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li>
<li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Lact%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li>
<li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li>
<li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+DNA%2FRNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588(2016).</li>
<li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).</li>
<li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li>
<li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29(2016).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26(2015).</li>
<li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24(2016).</li>
<li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+human+lower+airways%3A+a+next+generation+sequencing+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).</li>
<li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li>
<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
<li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genetics+and+Gut+Microbiome%3A+Challenges+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li>
<li>ATCC. Mock microbial communities. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ukierunkowane sekwencjonowanie 16S rRNA nowej generacji jest szeroko stosowaną, szybką techniką charakteryzacji mikrobiomu18. Jednak wiele czynników, w tym wpływ partii, zanieczyszczenie środowiska, zanieczyszczenie krzyżowe próbki, czułość i odtwarzalność, może niekorzystnie wpływać na wyniki eksperymentalne i zakłócać ich interpretację 7,19,20. Aby jak najlepiej ułatwić solidne analizy 16S, przepływy pr...

Uważa się, że społeczności mikrobiologiczne, które kolonizują ludzi, są niezwykle ważne dla ludzkiego zdrowia i chorób, wpływając na metabolizm, rozwój immunologiczny, podatność na choroby oraz reakcje na szczepienia i terapię lekową1,2. Wysiłki mające na celu zrozumienie wpływu mikrobioty na zdrowie człowieka kładą obecnie nacisk na identyfikację drobnoustrojów związanych ze zdefiniowanymi przedziałami anatomicznymi (tj. skórą, jelitami, jamą ustną itp.), a także zlokalizowanymi miejscami w tych przedziałach3,4. U podstaw tych wysiłków badawczych leży szybkie pojawienie się i zwiększona dostępność technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), które zapewniają masowo równoległą platformę do analizy zawartości genetycznej drobnoustrojów (mikrobiomu) w próbce. W przypadku wielu próbek fizjologicznych powiązany mikrobiom jest zarówno złożony, jak i obfity (tj. kał), ale w przypadku niektórych próbek mikrobiom jest reprezentowany przez niską biomasę mikrobiologiczną (tj. mleko ludzkie, dolne drogi oddechowe), gdzie wrażliwość, artefakty eksperymentalne i możliwe zanieczyszczenie stają się głównymi problemami. Typowe wyzwania związane z badaniami mikrobiomu i odpowiednim projektem eksperymentalnym były przedmiotem wielu artykułów przeglądowych5,6,7,8.
Prezentowany tutaj jest solidny eksperymentalny pipeline NGS oparty na ukierunkowanym sekwencjonowaniu regionu rRNA 16S V49 w celu scharakteryzowania mikrobiomu mleka ludzkiego. Analizę mikrobiomu mleka kobiecego komplikuje nie tylko z natury niska biomasa mikrobiologiczna10, ale także wysoki poziom tła ludzkiego DNA11,12,13,14 i potencjalne przeniesienie inhibitorów PCR15,16 w wyekstrahowanym kwasie nukleinowym. Protokół ten opiera się na dostępnych na rynku zestawach do ekstrakcji i półautomatycznych platformach, które mogą pomóc zminimalizować zmienność między partiami przygotowania próbek. Obejmuje dobrze zdefiniowaną społeczność makiet bakteryjnych, która jest przetwarzana wraz z próbkami jako kontrola jakości w celu walidacji każdego kroku w protokole i zapewnienia niezależnej metryki niezawodności rurociągu. Chociaż opisany protokół jest specyficzny dla próbek mleka ludzkiego, można go łatwo dostosować do innych typów próbek, w tym wymazów ze stolca, odbytu, pochwy, skóry, otoczek i jamy ustnej10,17 i może służyć jako punkt wyjścia dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić analizy mikrobiomu.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNazy, DNazy, dekontaminacja DNA</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>z kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>Bufor wirowy RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>bufor do lizy tiocyjanianu guanidyny/ Część zestawu</td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME to środek redukujący, który nieodwracalnie denaturuje RNazy poprzez redukcję wiązań dwusiarczkowych</td></tr><tr><td>Koraliki LME MP</td><td>Biomedicals</td><td>116914050</td><td>rurka z kulkami</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>zautomatyzowany zestaw adapterów zakłócających próbki</td></tr><tr><td>Kolumna QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Probówka do mikrowirówek producenta</td>QIAgen RB <td></td><td></td> w zestawie</tr><tr><td>QIAcube i powiązane wyroby z tworzyw sztucznych</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>zautomatyzowany instrument do oczyszczania DNA/RNA</td></tr><tr><td>Wyjście DNA plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>nieenzymatyczny roztwór do dekontaminacji</td></tr> EB <tr><td>Bufor</td><td>elucyjny Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>QIAgility i pokrewne tworzywa sztuczne</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>zrobotyzowana maszyna do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>PCR woda</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócone podkłady z kodami kreskowymi</td><td>Eurofin</td><td>Nr katalogu #</td><td>zaprojektowali i zamówili</td></tr><tr><td>96-dołkową płytkę PCR</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 i powiązane wyroby</td> <td>z tworzyw sztucznychAutomatyczny</td><td>analizator fragmentów DNA/RNA</td>Agilent <td>G2964AA</td></tr><tr><td>odczynniki D1000 do Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Bufor i drabinka do próbek są częścią tego zestawu</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania inhibitorów PCR OneStep</td> Research <td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>usuwanie inhibitora PCR odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestaw</td> do oczyszczania DNA <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: oczyszczanie produktów PCR na podstawie membrany krzemionkowej</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS Bufor</td><td>rozcieńczający na bazie dimetylosulfotlenku Thermo</td> <td>Fisher</td><td>Q32854</td> i barwnik są częścią tego zestawu.</tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MiSeq 300 V2</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>Brak katalogu #</td><td>sekwencer nowej generacji</td></tr></tbody></table>

metoda celowanego sekwencjonowania 16s próbek mleka kobiecego

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Badania społeczności mikroorganizmów stały się powszechne dzięki rozwojowi stosunkowo taniego, szybkiego i wysokoprzepustowego sekwencjonowania. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich tych technologii, powtarzalne wyniki zależą od przepływu pracy w laboratorium, który obejmuje odpowiednie środki ostrożności i kontrole. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek o niskiej biomasie, w przypadku których zanieczyszczenie bakteryjnego DNA może generować mylące wyniki. Ten artykuł szczegółowo opisuje półautomatyczny przepływ pracy w celu identyfikacji drobnoustrojów w próbkach mleka kobiecego przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania regionu 16S rybosomalnego RNA (rRNA) V4 w skali od niskiej do średniej przepustowości. Protokół opisuje przygotowanie próbki z mleka pełnego, w tym: lizę próbki, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację regionu V4 genu 16S rRNA oraz przygotowanie biblioteki ze środkami kontroli jakości. Co ważne, w protokole i dyskusji uwzględniono kwestie, które są istotne dla przygotowania i analizy próbek o niskiej biomasie, w tym odpowiednie kontrole dodatnie i negatywne, usuwanie inhibitorów PCR, zanieczyszczenie próbki przez środowisko, odczynniki lub źródła eksperymentalne oraz najlepsze praktyki eksperymentalne mające na celu zapewnienie odtwarzalności. Chociaż opisany protokół jest specyficzny dla próbek mleka ludzkiego, można go dostosować do wielu rodzajów próbek o niskiej i wysokiej biomasie, w tym próbek pobranych na wymazach, zamrożonych w czystej postaci lub ustabilizowanych w buforze konserwującym.

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje istotne etapy kontroli jakości (QC), aby zapewnić, że wygenerowane dane spełniają normy w zakresie czułości protokołu, swoistości oraz kontroli zanieczyszczeń. Pierwszy etap QC protokołu następuje po amplifikacji PCR regionu 16S V4 (Rycina 2). 1 µL produktu PCR z każdej próbki poddano analizie elektroforetycznej, aby potwierdzić, że mieści się on w oczekiwanym zakresie wielkości 315 - 450 bp (Rycina 2...

Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Ogólnym celem tej metody jest amplifikacja 16 SRRNA z mleka ludzkiego i innych próbek o niskiej biomasie przy użyciu protokołu półautomatycznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i zaburzeń ludzkiego mikrobiomu w odniesieniu zarówno do zdrowia, jak i choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona częściowo automatyczna, stosunkowo łatwa do wykonania i można ją dostosować do wielu rodzajów próbek, w tym wydzieliny, wymazów i kału.Po rozmrożeniu i stopikacji pełnego mleka zgodnie z protokołem tekstowym, wiruj próbki w temperaturze 5000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać komórki. Użyj plastikowej szpatułki lub końcówki do pipety o dużym otworze, aby usunąć górną warstwę tłuszczu. Następnie, nie naruszając osadu, usuń cały supernatant, z wyjątkiem 100 mikrolitrów.Z jednym mililitrem PBS ponownie zawiesić i umyć granulki. Następnie przygotuj kontrolę ujemną, dodając jeden mililitr sterylnego PBS do pięciomililitrowej probówki. Przenieść zawiesinę do czystej, jednopunktowej, pięciomililitrowej probówki wirówkowej i wirować ją z prędkością 5000 razy G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.Następnie użyj sterylnej końcówki pipety z filtrem o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć całą warstwę tłuszczową sklarowanego osadu. Aby rozbić i homogenizować próbkę, dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta merkaptoetanol do osadu i przenieś zawiesinę do probówki z kulkami. Przygotować jedną kontrolę pozytywną z buforem do lizy i 20 mikrolitrami próbki próbnej bakteryjnej.Energicznie obracaj wszystkie rurki z koralikami przez 15 sekund. Następnie podgrzej próbki w wirówce o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od 700 do 800 obr./min przez 10 minut. Załaduj probówki do zestawu adaptera do automatycznego zakłócania próbek.Następnie koralik ubijał próbki z częstotliwością 30 Hz przez jedną minutę. Zdemontuj zestaw adapterów i ręcznie przełącz go z płytkami próbkowymi z lewego ramienia robota na prawe ramię robota urządzenia. Ubijaj probówki z częstotliwością 30 herców przez kolejną minutę, a następnie odwiruj probówki w temperaturze 17, 200 razy G i 25 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usunąć cały sklarowany szwadron, uważając, aby nie pobrać żadnej warstwy tłuszczowej na górze ani pozostałości kulek na dole próbki. Nałożyć supernatant na kolumny homogenizatora. Następnie odwiruj kolumny z maksymalną prędkością i 25 stopniami Celsjusza przez trzy minuty.Przenieś 350 mikrolitrów eluidu do dwumililitrowej probówki wirówkowej producenta. W celu wyizolowania DNA zgodnie z protokołem tekstowym należy odciąć pokrywki i wygładzić krawędzie poszczególnych kolumn wirowych dla DNA i RNA. Włóż kolumnę wirującą DNA bez rurki zbiorczej do adaptera wirnika.Następnie wyrzuć probówkę zbiorczą. Następnie włóż wirowane dwumililitrowe probówki do shakera, postępując zgodnie z tabelą ładowania automatycznego instrumentu do oczyszczania DNA/RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznacz jednopunktowe pięciomililitrowe probówki zbiorcze i włóż je do adapterów wirnika.Następnie umieść adaptery wirnika w wirówce, postępując zgodnie z tabelą ładowania automatycznego przyrządu do oczyszczania DNA/RNA. Po włożeniu końcówek filtra, wody wolnej od RNaz i odczynników do bloku odczynników instrumentu, zamknij pokrywę instrumentu i uruchom niestandardowy program oczyszczania DNA na instrumencie. Po zakończeniu reakcji pobrać próbkę zawierającą probówki z wytrząsarki, a jeśli pozostała jakakolwiek próbka, przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub minus 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania.Po przygotowaniu obszaru roboczego i głównej mieszanki PCR, zgodnie z protokołem tekstowym, załaduj od 50 do 100 mikrolitrów próbek DNA do 32-dołkowego adaptera próbek instrumentu, postępując zgodnie z 96-dołkową mapą płytki. Dla każdej płytki PCR należy ustawić dwie kontrole ujemne, pipetując 30 mikrolitrów wody do PCR w czystej, jednopunktowej probówce o pojemności pięciu mililitrów. Następnie umieść wszystkie próbki na 32-dołkowym adapterze do próbek instrumentu z nasadkami zablokowanymi w pozycji otwartej.Zdejmij nasadkę z każdego odwróconego startera z określonymi numerami kodów kreskowych pojedynczo. Aby załadować zrobotyzowaną ładowarkę do cieczy, umieść adapter odczynnika w odpowiedniej pozycji, B1.In aby uniknąć efektu krawędzi, ostrożnie przyłóż jedną krawędź adaptera do strony uchwytu i powoli opuść drugą krawędź. Upewnij się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów.Umieść sample adapter w pozycji C1, upewniając się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów. Następnie zwiruj pięciomililitrową mieszankę główną. Otwórz nasadkę i umieść ją w pozycji A na bloku miksu głównego i odczynnika instrumentu.Umieść płytkę PCR na adapterze 96-dołkowego, który jest przeznaczony do przechowywania płytek PCR z półspódniczką. Następnie uruchom przebieg i zapisz go jako nowy plik. Po zakończeniu przebiegu sprawdź, czy nie wystąpiły żadne błędy.Następnie użyj 12 lub ośmiu nasadek paskowych, aby uszczelnić płytkę. Energicznie wiruj i użyj 96-dołkowej wirówki do płytek, aby wirować płytki przez jedną minutę. Na koniec umieść płytkę na lodzie, aż zostanie przeniesiona do pomieszczenia po amplifikacji i załadowana do termocyklera.Po amplifikacji PCR należy przeprowadzić kontrolę jakości i przygotować bibliotekę zgodnie z protokołem tekstowym. Pierwszy etap kontroli jakości protokołu następuje po amplifikacji PCR regionu 16SV4. Jak pokazano tutaj, jeden mikrolitr produktu PCR z każdej próbki został przeanalizowany za pomocą elektroforezy, aby potwierdzić, że mieści się on w oczekiwanym zakresie wielkości od 350 do 450 par zasad.Niektóre próbki mleka kobiecego generowały mniejsze ilości określonego produktu, co sugeruje albo niski poziom wyekstrahowanego DNA drobnoustrojów w tych próbkach, albo przeniesienie inhibitorów PCR podczas ekstrakcji. Oznaczanie ilościowe określonego produktu dla każdej próbki miało zasadnicze znaczenie dla określenia jego wymaganej objętości dla równego łączenia molowych próbek do sekwencjonowania. Zbiorcza biblioteka do sekwencjonowania celowanego jest zwykle zdominowana przez określony produkt PCR.Jeśli w bibliotece znajduje się znaczna ilość niespecyficznego produktu, do przepływu pracy należy dodać etap oczyszczania żelu. Wyniki sekwencjonowania wskazują na dużą różnorodność taksonów związanych z mikrobiomem mleka kobiecego oraz zmienność liczby sekwencjonowanych liczb trzciny dla każdej próbki. W przeciwieństwie do tego, skład taksonów i liczba trzciny w makiecie bakteryjnej były porównywalne z wynikami uzyskanymi dla makiety w poprzednich przebiegach przepływu pracy, co sugeruje, że obserwowana zmienność próbek mleka kobiecego jest autentycznym wynikiem eksperymentalnym, a nie funkcją wewnętrznej zmienności przepływu pracy.W przypadku pozostawienia sekwenatora włączonego na noc, technikę tę można wykonać w ciągu dwóch dni, dla 12 do 24 próbek, jeśli wszystkie próbki amplifikują się do początkowego przebiegu PCR. Jeśli nie, potrzebny jest kolejny dzień muszli. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby podróżować tylko z obszaru przed PCR do obszaru po PCR, aby uniknąć zakażenia.Bardzo ważna jest również częsta zmiana rękawic, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiedni sprzęt ochronny i szafki bezpieczeństwa biologicznego.

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Opisujemy tutaj wysokoprzepustowe wykrywanie i kwantyfikację fukozylowanych oligosacharydów mleka ludzkiego (HMO) za pomocą biosensora obejmującego całe komórki. Pokazujemy tutaj również adaptację tej platformy do analizy szczepów produkcyjnych HMO, koncentrując się na poprawie stosunku sygnału do szumu.

Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Ten artykuł opisuje, jak złożyć urządzenie, które może być używane do zbierania mleka od myszy laboratoryjnych. To urządzenie jest niedrogie, przenośne i umożliwia pobranie 0,1–0,5 ml mleka przez jedną przeszkoloną osobę. Dołączony jest również szczegółowy protokół doju.

Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych

Artykuł opisuje protokół odtwarzania mikrobioty pasteryzowanej mleka dawcy przy użyciu mikrobioty mleka matki w praktycznych, rzeczywistych warunkach. Wykazuje skuteczny wzrost bakterii i modulację mikrobiomu, wspierając wykonalne zastosowanie tej procedury w rutynowej opiece szpitala położniczego i powiązanego z nim banku mleka kobiecego.

Zindywidualizowana rekonstrukcja mikrobioty mleka kobiecego: wykonalne podejście w warunkach rzeczywistych

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Poznaj półautomatyczną metodę sekwencjonowania 16S rRNA z mleka kobiecego i innych próbek o niskiej biomie. Protokół ułatwia badanie mikrobiomu człowieka w kontekście zdrowia i chorób.

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

Przeglądaj więcej filmów