Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

Ogólnym celem tej metody jest amplifikacja 16 SRRNA z mleka ludzkiego i innych próbek o niskiej biomasie przy użyciu protokołu półautomatycznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i zaburzeń ludzkiego mikrobiomu w odniesieniu zarówno do zdrowia, jak i choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona częściowo automatyczna, stosunkowo łatwa do wykonania i można ją dostosować do wielu rodzajów próbek, w tym wydzieliny, wymazów i kału.

Po rozmrożeniu i stopikacji pełnego mleka zgodnie z protokołem tekstowym, wiruj próbki w temperaturze 5000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać komórki. Użyj plastikowej szpatułki lub końcówki do pipety o dużym otworze, aby usunąć górną warstwę tłuszczu. Następnie, nie naruszając osadu, usuń cały supernatant, z wyjątkiem 100 mikrolitrów.

Z jednym mililitrem PBS ponownie zawiesić i umyć granulki. Następnie przygotuj kontrolę ujemną, dodając jeden mililitr sterylnego PBS do pięciomililitrowej probówki. Przenieść zawiesinę do czystej, jednopunktowej, pięciomililitrowej probówki wirówkowej i wirować ją z prędkością 5000 razy G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie użyj sterylnej końcówki pipety z filtrem o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć całą warstwę tłuszczową sklarowanego osadu. Aby rozbić i homogenizować próbkę, dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta merkaptoetanol do osadu i przenieś zawiesinę do probówki z kulkami. Przygotować jedną kontrolę pozytywną z buforem do lizy i 20 mikrolitrami próbki próbnej bakteryjnej.

Energicznie obracaj wszystkie rurki z koralikami przez 15 sekund. Następnie podgrzej próbki w wirówce o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od 700 do 800 obr./min przez 10 minut. Załaduj probówki do zestawu adaptera do automatycznego zakłócania próbek.

Następnie koralik ubijał próbki z częstotliwością 30 Hz przez jedną minutę. Zdemontuj zestaw adapterów i ręcznie przełącz go z płytkami próbkowymi z lewego ramienia robota na prawe ramię robota urządzenia. Ubijaj probówki z częstotliwością 30 herców przez kolejną minutę, a następnie odwiruj probówki w temperaturze 17, 200 razy G i 25 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usunąć cały sklarowany szwadron, uważając, aby nie pobrać żadnej warstwy tłuszczowej na górze ani pozostałości kulek na dole próbki. Nałożyć supernatant na kolumny homogenizatora. Następnie odwiruj kolumny z maksymalną prędkością i 25 stopniami Celsjusza przez trzy minuty.

Przenieś 350 mikrolitrów eluidu do dwumililitrowej probówki wirówkowej producenta. W celu wyizolowania DNA zgodnie z protokołem tekstowym należy odciąć pokrywki i wygładzić krawędzie poszczególnych kolumn wirowych dla DNA i RNA. Włóż kolumnę wirującą DNA bez rurki zbiorczej do adaptera wirnika.

Następnie wyrzuć probówkę zbiorczą. Następnie włóż wirowane dwumililitrowe probówki do shakera, postępując zgodnie z tabelą ładowania automatycznego instrumentu do oczyszczania DNA/RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznacz jednopunktowe pięciomililitrowe probówki zbiorcze i włóż je do adapterów wirnika.

Następnie umieść adaptery wirnika w wirówce, postępując zgodnie z tabelą ładowania automatycznego przyrządu do oczyszczania DNA/RNA. Po włożeniu końcówek filtra, wody wolnej od RNaz i odczynników do bloku odczynników instrumentu, zamknij pokrywę instrumentu i uruchom niestandardowy program oczyszczania DNA na instrumencie. Po zakończeniu reakcji pobrać próbkę zawierającą probówki z wytrząsarki, a jeśli pozostała jakakolwiek próbka, przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub minus 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania.

Po przygotowaniu obszaru roboczego i głównej mieszanki PCR, zgodnie z protokołem tekstowym, załaduj od 50 do 100 mikrolitrów próbek DNA do 32-dołkowego adaptera próbek instrumentu, postępując zgodnie z 96-dołkową mapą płytki. Dla każdej płytki PCR należy ustawić dwie kontrole ujemne, pipetując 30 mikrolitrów wody do PCR w czystej, jednopunktowej probówce o pojemności pięciu mililitrów. Następnie umieść wszystkie próbki na 32-dołkowym adapterze do próbek instrumentu z nasadkami zablokowanymi w pozycji otwartej.

Zdejmij nasadkę z każdego odwróconego startera z określonymi numerami kodów kreskowych pojedynczo. Aby załadować zrobotyzowaną ładowarkę do cieczy, umieść adapter odczynnika w odpowiedniej pozycji, B1.In aby uniknąć efektu krawędzi, ostrożnie przyłóż jedną krawędź adaptera do strony uchwytu i powoli opuść drugą krawędź. Upewnij się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów.

Umieść sample adapter w pozycji C1, upewniając się, że naciskasz na wszystkie rogi adapterów. Następnie zwiruj pięciomililitrową mieszankę główną. Otwórz nasadkę i umieść ją w pozycji A na bloku miksu głównego i odczynnika instrumentu.

Umieść płytkę PCR na adapterze 96-dołkowego, który jest przeznaczony do przechowywania płytek PCR z półspódniczką. Następnie uruchom przebieg i zapisz go jako nowy plik. Po zakończeniu przebiegu sprawdź, czy nie wystąpiły żadne błędy.

Następnie użyj 12 lub ośmiu nasadek paskowych, aby uszczelnić płytkę. Energicznie wiruj i użyj 96-dołkowej wirówki do płytek, aby wirować płytki przez jedną minutę. Na koniec umieść płytkę na lodzie, aż zostanie przeniesiona do pomieszczenia po amplifikacji i załadowana do termocyklera.

Po amplifikacji PCR należy przeprowadzić kontrolę jakości i przygotować bibliotekę zgodnie z protokołem tekstowym. Pierwszy etap kontroli jakości protokołu następuje po amplifikacji PCR regionu 16SV4. Jak pokazano tutaj, jeden mikrolitr produktu PCR z każdej próbki został przeanalizowany za pomocą elektroforezy, aby potwierdzić, że mieści się on w oczekiwanym zakresie wielkości od 350 do 450 par zasad.

Niektóre próbki mleka kobiecego generowały mniejsze ilości określonego produktu, co sugeruje albo niski poziom wyekstrahowanego DNA drobnoustrojów w tych próbkach, albo przeniesienie inhibitorów PCR podczas ekstrakcji. Oznaczanie ilościowe określonego produktu dla każdej próbki miało zasadnicze znaczenie dla określenia jego wymaganej objętości dla równego łączenia molowych próbek do sekwencjonowania. Zbiorcza biblioteka do sekwencjonowania celowanego jest zwykle zdominowana przez określony produkt PCR.

Jeśli w bibliotece znajduje się znaczna ilość niespecyficznego produktu, do przepływu pracy należy dodać etap oczyszczania żelu. Wyniki sekwencjonowania wskazują na dużą różnorodność taksonów związanych z mikrobiomem mleka kobiecego oraz zmienność liczby sekwencjonowanych liczb trzciny dla każdej próbki. W przeciwieństwie do tego, skład taksonów i liczba trzciny w makiecie bakteryjnej były porównywalne z wynikami uzyskanymi dla makiety w poprzednich przebiegach przepływu pracy, co sugeruje, że obserwowana zmienność próbek mleka kobiecego jest autentycznym wynikiem eksperymentalnym, a nie funkcją wewnętrznej zmienności przepływu pracy.

W przypadku pozostawienia sekwenatora włączonego na noc, technikę tę można wykonać w ciągu dwóch dni, dla 12 do 24 próbek, jeśli wszystkie próbki amplifikują się do początkowego przebiegu PCR. Jeśli nie, potrzebny jest kolejny dzień muszli. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby podróżować tylko z obszaru przed PCR do obszaru po PCR, aby uniknąć zakażenia.

Bardzo ważna jest również częsta zmiana rękawic, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiedni sprzęt ochronny i szafki bezpieczeństwa biologicznego.