Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny
24 lutego 2018
Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie szybkości produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH oczyszczonych dehydrogenaz mitochondrialnych zawierających flawinę za pomocą fluorometrii mikropłytek. Mitrochondria mogą zawierać do 12 różnych miejsc tworzenia ponadtlenku/nadtlenku wodoru, które zostały zidentyfikowane przy użyciu różnych kombinacji substratów i inhibitorów z izolowanymi mitochondriami. Nadal jednak istnieją pewne trudności w dokładnym określeniu zdolności uwalniania poszczególnych miejsc produkcji w izolowanych mitochondriach.
A to wiąże się z niepożądanymi reakcjami ubocznymi, które również wytwarzają reaktywne formy tlenu, ale także z obecnością przeciwutleniaczy i stosowaniem inhibitorów, którym brakuje specyficzności, a także ze stosowaniem dodatków, które mogą zakłócać pomiary. W artykule przedstawiono metodę jednoczesnego pomiaru produkcji nadtlenków/nadtlenków wodoru i NADH za pomocą oczyszczonych flawinozależnych dehydrogenaz mitochondrialnych. Metoda ta jest korzystna, ponieważ może pozwolić na bezpośrednie i dokładne określenie ilościowe potencjału wytwarzania ROS w poszczególnych miejscach produkcji poprzez eliminację niepożądanych reakcji ubocznych i wszelkich systemów wygaszania reaktywnych form tlenu.
Jednoczesny pomiar produkcji ROS i NADH pozwala również na bezpośrednie porównanie potencjału tworzenia nadtlenków/nadtlenków wodoru i aktywności poszczególnych enzymów, co może być cenne dla badań przesiewowych inhibitorów produkcji ROS przed przeprowadzeniem testów z mitochondriami. Do naszych celów tutaj będziemy używać jako przykładów kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej i kompleksu dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu pochodzenia sercowego świni. Oba są enzymami zawierającymi flawiny i znanymi źródłami reaktywnych form tlenu.
Ponadto te dwa enzymy można łatwo oczyścić. Jednoczesny pomiar nadtlenku/nadtlenku wodoru i NADH uzyskuje się poprzez śledzenie zmian w kwiatostanie. NADH posiada swoje własne właściwości florescencyjne, co pozwala na łatwy pomiar jego produkcji.
Tymczasem zmiany w nadtlenku / nadtlenku wodoru wymagają dysmutatazy ponadtlenkowej, peroksydazy chrzanowej i odczynnika ultraczerwonego amplex. W obecności peroksydazy chrzanowej i nadtlenku wodoru amplex ultrared jest przekształcany z cząsteczki niefluorescencyjnej w rezorufinę fluorescencyjną. Dysmutaza ponadtlenkowa zapewnia, że każdy ponadtlenek utworzony przez badaną dehydrogenazę jest przekształcany w nadtlenek wodoru.
Przed ustawieniem testu przygotowywane są roztwory robocze. Aby usprawnić test, wszystkie odczynniki dodaje się do studzienek 96-dołkowej czarnej płytki w podwielokrotnościach o pojemności 20 mikrolitrów. Objętość każdej reakcji w studni wynosi 200 mikrolitrów, dlatego roztwory robocze są 10 razy większe niż stężenie znajdujące się w studzience reakcyjnej.
Następnie zaprogramuj czytnik mikropłytek tak, aby uruchamiał test kinetyczny do podwójnego pomiaru autoflorescencji NADH i florescencji rezorufiny. Odbywa się to poprzez wybranie opcji Procedura i ustawienie jej na 25 stopni Celsjusza. Następnie kliknij przycisk Start Kinetic.
Ustaw czas działania na około pięć minut, a następnie wybierz interwał odczytu fluorescencyjnego wynoszący 30 sekund. Następnie kliknij przycisk Czytaj i ustaw parametry pomiaru fluorescencyjnego dla swojego testu. Tutaj pozycja sondy, długości fal używane do śledzenia zmian w kwiatostancji i studzienki, które zostaną odczytane, są wprowadzane do oprogramowania.
Wybierane są również różne kanały do odczytów fluorescencyjnych, z których jeden jest poświęcony autoflorescencji NADH, która jest ustawiona na 376 nanometrów wzbudzenia i 450 nanometrów długości fali emisji. Zmiany we florescencji rezorufiny są śledzone w zakresie 565 nanometrów i 600 nanometrów. Po ustaleniu warunków testu, poszczególne studzienki są ładowane buforem i różnymi odczynnikami wymaganymi do jednoczesnego pomiaru zarówno NADH, jak i produkcji nadtlenku/nadtlenku wodoru.
Kolejność ładowania studzienek różnymi odczynnikami jest następująca. Najpierw do studzienki dodaje się wymaganą ilość buforu, a następnie dodaje się 20 mikrolitrów oczyszczonego roztworu enzymu. Enzym jest równoważony w buforze przez kilka minut wewnątrz urządzenia.
Następnie pozostałe odczynniki dodaje się w następującej kolejności. Po dodaniu podłoża naciśnij Start. Plate carrier wejdzie do czytnika i zostanie zainicjowany protokół.
Podczas testu za pomocą oprogramowania można śledzić wyniki w czasie rzeczywistym dla surowych względnych jednostek fluorescencyjnych (RFU). Użytkownik może przełączać się między różnymi odczytami fluorescencyjnymi, korzystając z zakładki Dane nad układem studni. Należy pamiętać, że można wybrać krzywe dla różnych odczytów fluorescencyjnych.
Ponadto, przytrzymując Control na klawiaturze i klikając lewym przyciskiem myszy na studzienkach, można uzyskać złożony wykres pozwalający na porównanie różnych reakcji w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu eksperymentu nośnik mikropłytki opuści urządzenie. W tym momencie wyniki na wykresie reprezentatywnym dla zmian w RFU są eksportowane do programu Excel.
Surowe wartości RFU są eksportowane poprzez kliknięcie najpierw opcji Dane na reprezentatywnym wykresie RFU. W ten sposób uzyskamy tabelę surowych wartości RFU dla NADH i florescencji rezorufiny. Nie oznacza to, że surowe numery RFU odpowiadające zmianom NADH lub florecji rezorufiny nie mogą być eksportowane jednocześnie.
Po wyeksportowaniu wyniki są organizowane do analizy. Korzystając z krzywych wzorcowych dla NADH i florescencji rezorufiny wygenerowanych przed przeprowadzeniem testu, można obliczyć ilość NADH w mikromolu i nadtlenku/nadtlenku wodoru w pikomolu powstałą w czasie. Następnie można obliczyć szybkość produkcji NADH i nadtlenku/nadtlenku wodoru.
W przypadku tej procedury ważne jest, aby sprawdzić czystość wyizolowanej dehydrogenazy zawierającej flawinę przed przeprowadzeniem testów. Można to osiągnąć, przeprowadzając proste barwienie coomassie dla białek lub oznaczając aktywność enzymu w obecności różnych substratów. Należy zauważyć, że zaleca się, aby środki redukujące, takie jak DTT, zostały pominięte w teście, ponieważ mogą one służyć jako substrat do produkcji nadtlenków/nadtlenków wodoru przez dehydrogenazy związane z flawiną.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest bardzo elastyczna, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych inhibitorów do produkcji nadtlenków/nadtlenków wodoru, a także pozwala na bezpośrednie porównanie zdolności do tworzenia RZS różnych dehydrogenaz mitochondrialnych związanych z flawiną. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dogłębne zrozumienie, jak mierzyć produkcję ROS i NADH za pomocą oczyszczonych dehydrogenaz. Ten test może służyć jako odskocznia do bardziej wyrafinowanych eksperymentów z izolowanymi mitochondriami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę ilościowego określania szybkości produkcji nadtlenku wodoru/rodnika ponadtlenkowego oraz NADH z oczyszczonych mitochondrialnych dehydrogenaz zawierających flawinę, z wykorzystaniem fluorometrii na płytkach mikrotitracyjnych. Metoda ta rozwiązuje problemy związane z pomiarem uwalniania reaktywnych form tlenu (ROS) z poszczególnych miejsc mitochondrialnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia mitochondriów
Wprowadzenie
- Mitochondria zawierają różne enzymy zależne od flawin, które generują reaktywne formy tlenu (ROS).
- Precyzyjne ilościowe określenie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc jest trudne.
- Niepożądane reakcje uboczne oraz obecność przeciwutleniaczy komplikują pomiary.
- Do identyfikacji miejsc produkcji ROS stosowano różne kombinacje substratów i inhibitorów.
Cel badania
- Opracowanie metody jednoczesnego pomiaru produkcji nadtlenku rozpływu/nadtlenku wodoru oraz NADH.
- Wyeliminowanie niepożądanych reakcji ubocznych podczas ilościowego oznaczania ROS.
- Zapewnienie bezpośredniej oceny potencjału produkcji ROS w miejscach mitochondrialnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano oczyszczone mitochondrialne dehydrogenazy zależne od flawiny.
- Do pomiarów zastosowano fluorometrię na mikropłytkach.
- Przeprowadzono jednoczesną kwantyfikację anionorodnika ponadtlenkowego/nadtlenku wodoru oraz NADH.
- W celu oceny poszczególnych miejsc produkcji wykorzystano specyficzne inhibitory i substraty.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia dokładne ilościowe określenie szybkości produkcji ROS.
- Niepożądane reakcje uboczne zostały skutecznie zminimalizowane.
- Pomyślnie oceniono poszczególne miejsca produkcji ROS.
- Zastosowane podejście pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki mitochondrialnych ROS.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa możliwość badania produkcji mitochondrialnych ROS.
- Stanowi ona niezawodne narzędzie dla badaczy analizujących funkcje mitochondriów.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla zrozumienia stresu oksydacyjnego w komórkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne ilościowe określenie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) przez poszczególne enzymy mitochondrialne jest kluczowe dla walidacji celów w procesie poszukiwania leków związanych ze stresem oksydacyjnym. Metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie powstawania ROS oraz aktywności enzymatycznej, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów będących flawinowymi dehydrogenazami. Poprzez wyeliminowanie zakłócających systemów antyoksydacyjnych i reakcji ubocznych, metoda ta zapewnia wiarygodność predykcyjną podczas przesiewu inhibitorów przed przeprowadzeniem złożonych analiz mitochondrialnych lub komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie szybkości uwalniania natywnych ROS z oczyszczonych dehydrogenaz zależnych od flawin.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośredni pomiar produkcji anionorodnika ponadtlenkowego/nadtlenku wodoru oraz NADH z poszczególnych centrów enzymatycznych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio, umożliwiając badanie selektywności i skuteczności inhibitorów w hamowaniu produkcji ROS przed przeprowadzeniem testów mitochondrialnych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów prac, zapewniając standaryzowane, ilościowe odczyty ROS i NADH.
- Powtarzalność: Wykorzystuje fluorometrię na płytkach mikrotitracyjnych z określonymi długościami fal wzbudzenia/emisji (NADH: 376/450 nm; rezorufina: 565/600 nm) w celu zapewnienia spójnej detekcji sygnału.
- Skalowalność: Umożliwia wysokoprzepustowy screening inhibitorów z wykorzystaniem formatu płytki 96-dołkowej z objętościami reakcji wynoszącymi 200 µL.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Służy jako punkt wyjścia do bardziej zaawansowanych eksperymentów z izolowanymi mitochondriami lub permeabilizowanymi włóknami mięśniowymi poprzez ustanowienie bazowych zależności między ROS a enzymami.
- System istotny dla chorób: Wykorzystuje kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDHC) i kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu (KGDHC) pochodzące z serca świni jako modele źródeł mitochondrialnych ROS istotnych w chorobach metabolicznych i sercowo-naczyniowych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane zmiany ROS wynikają z aktywności docelowego enzymu, czy z efektów poza docelowych lub interferencji przeciwutleniającej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając ilościowe dane dotyczące ROS i aktywności, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań przed przejściem do złożonych modeli fenotypowych lub przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolację produkcji ROS z konkretnych flawinowych dehydrogenaz, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w analizie szlaków.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zestandaryzowanej, jednoczesnej detekcji autofluorescencji NADH oraz fluorescencji rezorufiny, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe (NADH w mikromolach, nadtlenek dwuwymiarowy/nadtlenek wodoru w pikomolach w czasie), które pozwalają na obliczenie szybkości produkcji w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez określenie natywnych szybkości uwalniania ROS dla poszczególnych enzymów przed testami w nienaruszonych systemach mitochondrialnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania celów enzymatycznych zależnych od flawin w różnych projektach, ograniczając redundantny rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w przypisywaniu źródła ROS.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki określonej kolejności dodawania reagentów, ustawieniom kinetycznym oraz separacji kanałów fluorescencji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesny screening inhibitorów, co redukuje ryzyko niepowodzeń na późniejszych etapach z powodu nieprzewidzianej toksyczności pośredniczonej przez ROS.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez ilościowe określenie potencjału produkcji ROS przez poszczególne miejsca enzymatyczne, co dostarcza informacji niezbędnych przy wyborze celu i decyzjach o dalszym rozwoju.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie oczyszczania enzymów i konfiguracji testów fluorometrycznych, w tym walidacja czystości dehydrogenazy zawierającej flawinę poprzez barwienie Coomassie lub testy aktywności.
- Zależność od czytnika mikropłytek zdolnego do kinetycznych odczytów dwudługościowych (376/450 nm dla NADH, 565/600 nm dla rezorufiny) z kontrolą temperatury na poziomie 25°C.
- Niezbędne jest wykluczenie czynników redukujących, takich jak DTT, które mogą działać jako substraty w produkcji anionorodnika ponadtlenkowego/nadtlenku wodoru i zaburzać wyniki.
- Wymagane jest przygotowanie roztworów roboczych w stężeniu 10x ze względu na końcową objętość 200 µL przy użyciu alikwotów 20 µL w płytkach 96-dołkowych.
- Metoda wiąże się z ograniczeniami praktycznymi, takimi jak konieczność zastosowania dysmutazy ponadtlenkowej w celu przekształcenia anionorodnika ponadtlenkowego w nadtlenek wodoru w celu detekcji za pomocą układu Amplex UltraRed/peroksydaza chrzanowa.
