Name: Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru nadtlenków i NADH w dehydrogenazach mitochondrialnych zawierających flawiny przy użyciu fluorometrii mikropłytkowej. Technika ta umożliwia dokładne określenie potencjału produkcji ROS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC). Produkcja wideo została zrealizowana we współpracy z Center for Innovation in Teaching and Learning (CITL) na Memorial University of Newfoundland.

1. Chemikalia i oczyszczone enzymy
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w następujące materiały: PDHC i KGDHC pochodzenia sercowego świń (lub innego oczyszczonego flawoenzymu mitochondrialnego); H2O2(30% roztwór), pirogronian, α-ketoglutaran, NAD+, NADH, CoASH, pirofosforan tiaminy (TPP), mannitol, HEPES, sacharoza, EGTA, kwas 3-metylo-2-oksowalerinowy (KMV), dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), peroksydaza chrzanowa (HRP), odczynnik 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyny (AUR) i CPI-613.</li>
</ol>
2. Planowanie testu i przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Ustawić test zgodnie z tabelą 1 na płytce 96-dołkowej. 
	UWAGA: Całkowita objętość każdej reakcji wynosi 200 μL. Stężenia podstawowe są dostosowywane w taki sposób, że do każdej studzienki dodaje się 20 μl odczynnika. Zapewnia to szybkie dodawanie kofaktorów i substratów do każdej reakcji na długo przed rozpoczęciem testu.</li>
	<li>Przygotować bufor reakcyjny zawierający 220 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 1 mM EGTA i 20 mM HEPES (pH 7,4 z HCl). 
	UWAGA: Może się to zmienić w zależności od właściwości fizycznych różnych oczyszczonych enzymów.</li>
	<li>Zbadaj oczyszczone KGDHC lub PDHC pod kątem zanieczyszczenia za pomocą testów aktywności enzymatycznej 14,16,17 lub za pomocą immunoblot lub barwienia Coomassie5.</li>
	<li>Przygotować wszystkie odczynniki w buforze reakcyjnym zgodnie ze stężeniami roztworu roboczego podanymi w tabeli 1.</li>
	<li>Przechowywać wszystkie odczynniki w postaci podwielokrotności o pojemności 1 ml w temperaturze -20 °C. Przechowywać pirogronian i α-ketoglutaran w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach o objętości 100 μl, aby zapobiec spontanicznej degradacji w wyniku autoutleniania i wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przygotować główny zapas odczynnika AUR w 1 ml DMSO, a następnie rozcieńczyć do 100 μM w buforze reakcyjnym. Przechowywać w bezpiecznym miejscu. 
	UWAGA: W tym przypadku roztwór roboczy 100 μM jest świeży co 2 do 3 tygodni i chroniony przed światłem.</li>
</ol>
3. Konfiguracja szablonu testu
<ol>
	<li>Skonfiguruj procedurę oznaczania na monochromatycznym czytniku mikropłytek z możliwością podwójnego pomiaru.</li>
	<li>Zdefiniuj procedurę odczytu, wybierając "PROTOKÓŁ". Następnie kliknij "PROCEDURA".</li>
	<li>Ustaw "TEMPERATURA" na 25 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Kliknij "START KINETIC", aby ustawić warunki odczytu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Ustaw czas i liczbę interwałów odczytu/eksperymentów.</li>
	<li>Kliknij "CZYTAJ" (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Próbki są odczytywane z pozycji TOP z wzmocnieniem 50. Czas: 5 min, czytane w odstępach 30-sekundowych. Kanał 1: Fluorescencja rezorufiny - wzbudzenie/emisja = 565 nm:600 nm, szerokość długości fali 13,5 nm. Kanał 2: autofluorescencja NADH - wzbudzenie/emisja = 376 nm:450 nm, szerokość długości fali 20 nm.</li>
	<li>W sekcji "ODCZYT" wybierz studnie do monitorowania (np. A1-A4 i B1-B4).</li>
	<li>Wybierz "KONIEC KINETYCZNY".</li>
</ol>
4. Krzywe standardowe
<ol>
	<li>Rozmrozić odczynniki i przechowywać na lodzie do czasu, aż będą potrzebne.</li>
	<li>Krzywa standardowa NADH (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory robocze dla NADH w zakresie stężeń 0,5-10 mM w buforze reakcyjnym.</li>
		<li>Dodać 20 μl podwielokrotności z każdego stężenia roztworu roboczego NADH do studzienek zawierających 180 μl buforu reakcyjnego. Końcowe stężenie NADH w każdym dołku wynosi 0,05-1 mM.</li>
		<li>Kliknij "READ" i ustaw wzbudzenie/emisję = 376 nm:450 nm, szerokość długości fali 20 nm. 
		UWAGA: Jest to punkt końcowy tylko do odczytu - parametry kinetyczne nie są wymagane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa standardowa AUR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
	<ol>
		<li>Przygotować zapasy robocze nadtlenku wodoru w buforze reakcyjnym; stężenia zapasów wahają się od 200 do 4 000 nM.</li>
		<li>Dodać 120 μl buforu reakcyjnego do każdego dołka.</li>
		<li>Dodać 20 μl HRP (stężenie robocze = 30 U/ml, stężenie końcowe w studzience = 3 U/ml), 20 μL SOD (stężenie robocze = 250 U/mL, stężenie końcowe w studzience = 25 U/ml) i 20 μl AUR (stężenie robocze = 100 μM, stężenie końcowe w studzience = 10 μM) do każdego studzienka zawierającego bufor reakcyjny.</li>
		<li>Dodać 20 μl każdego roboczego roztworu podstawowegoH2O2do każdego studzienki zawierającego bufor i odczynniki do oznaczania. Końcowa objętość reakcji wynosi 200 μL, a końcowe stężenieH2O2w każdym studzience wynosi 20-400 nM.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 1 minutę w czytniku płytek w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Kliknij "READ" i ustaw wzbudzenie/emisję = 565 nm/600 nm, szerokość długości fali 13,5 nm. Należy pamiętać, że jest to punkt końcowy tylko do odczytu - parametry kinetyczne nie są wymagane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar O2 ●- /h2 O2 Uwalnianie i produkcja NADH przez KGDHC i PDHC
<ol>
	<li>Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z kolejnością dodawania różnych odczynników, stężeniem każdego roztworu roboczego oraz objętością dodaną do każdego studzienki.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu reakcyjnego do każdego dołka. W przypadku testów z użyciem KMV lub CPI-613 dodaj 20 μl buforu do każdego dołka.</li>
	<li>Dodać 20 μl PDHC lub KGDHC (zapas roboczy 1 U/ml, końcowe stężenie na studzienkę = 0,1 U/ml) do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować PDHC i KGDHC w temperaturze 25 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 20 μl KMV (zapas roboczy = 100 mM, stężenie końcowe = 10 mM) lub 20 μl CPI-613 (stężenie robocze = 1,5 mM, stężenie końcowe = 150 μM) (tabela 2). 
	UWAGA: Ten krok można wykluczyć, jeśli inhibitory nie są używane do testów.</li>
	<li>Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Ten krok można wykluczyć, jeśli inhibitory nie są używane do testów.</li>
	<li>Dodać 20 μl HRP (stężenie robocze = 30 jednostek/ml, stężenie końcowe w studzience = 3 jednostki/ml) i 20 μl SOD (stężenie robocze = 250 jednostek/ml, stężenie końcowe w studzience = 25 jednostek/ml) do każdego dołka.</li>
	<li>Dodać 20 μl koenzymu A (stężenie robocze = 1 mM, stężenie końcowe = 0,1 mM), 20 μl TPP (stężenie robocze = 3 mM, stężenie końcowe = 0,3 mM) i 20 μL NAD+ (stężenie robocze = 10 mM, stężenie końcowe = 1 mM) do każdej studzienki.</li>
	<li>Usunąć odczynnik AUR z ochronnej folii aluminiowej i dodać 20 μl do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 20 μl pirogronianu (stężenie robocze w zakresie 1-100 mM, stężenie końcowe dla testów = 0,1-10 mM) do studzienek zawierających PDHC i α-ketoglutaran (stężenie zapasu roboczego w zakresie 1-100 mM, stężenie końcowe dla testów = 0,1-10 mM) do studzienek zawierających KGDHC.</li>
	<li>Kliknij "CZYTAJ", aby rozpocząć pomiar kinetyczny.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Przytrzymaj przycisk "CTRL" na klawiaturze i klikaj studnie, aby wygenerować jeden wykres zawierający wszystkie pomiary kinetyczne odpowiadające kanałowi 1 (Rysunek 3A).</li>
	<li>Kliknij "dane" w ikonie widoku w prawym górnym rogu, aby uzyskać surowe wartości dla względnych jednostek fluorescencji (RFU) mierzonych w różnych punktach czasowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Eksportuj wartości do analizy (tabela 3).</li>
	<li>Kliknij menu rozwijane "Wykres" w prawym górnym rogu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B), aby uzyskać dostęp do wartości RFU powiązanych z kanałem fluorescencji 2.</li>
	<li>Powtórz kroki od 6.1 do 6.3 dla kanału 2.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li>
<li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Protokół ten jest korzystny, ponieważ: 1) eliminuje wszelkie konkurencyjne reakcje, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać wykrywanieH2O2(np. systemy przeciwutleniające lub inne źródła ROS), 2) zapewnia bezpośrednią ocenę natywnej szybkości uwalniania ROS przez mitochondrialną dehydrogenazę zawierającą flawinę, 3) umożliwia porównanie natywnych szybkości uwalniania ROS dwóch lub więcej oczyszczonych dehydrogenaz na bazie flawiny, 4) może pozwolić na bezpośrednie porównanie szybkości uwa...

Ostatecznym celem metabolizmu składników odżywczych jest wytworzenie trifosforanu adenozyny (ATP). W komórkach ssaków dzieje się to w mitochondriach, organellach o podwójnej błonie, które przekształcają energię zmagazynowaną w węglu w ATP. Produkcja ATP rozpoczyna się, gdy węgiel jest spalany przez mitochondria tworzące dwa nośniki elektronów, NADH i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH2)1. NADH i FADH2 są następnie utleniane przez wielopodjednostkowe kompleksy oddechowe I i II, odpowiednio, a uwolnione elektrony są przenoszone do końcowego akceptora elektronów tlenu cząsteczkowego (O2) w kompleksie IV1. Korzystny termodynamicznie transfer elektronów "w dół" do O2 na końcu łańcucha jest sprzężony z eksportem protonów do przestrzeni międzybłonowej przez kompleksy I, III i IV. W ten sposób powstaje transbłonowy gradient elektrochemiczny protonów (siła napędowa protonu), tymczasowa forma energii swobodnej Gibbsa, która jest wykorzystywana przez kompleks V, aby utworzyć ATP2. Reakcje przenoszenia elektronów w mitochondriach nie są idealnie sprzężone z produkcją ATP. W różnych punktach cyklu Krebsa i łańcucha oddechowego elektrony mogą przedwcześnie oddziaływać z O2, tworząc ROS3. Najbardziej istotnymi biologicznie ROS generowanymi przez mitochondria są O2●- i H2O2. Chociaż O2●- jest często uważany za proksymalny ROS utworzony przez mitochondria, obecnie jest oczywiste, że miejsca produkcji tworzą mieszaninę O2●- i H2O2, co jest związane z wolnymi rodnikami w flawinowych grupach protetycznych4,5. Przy wysokich poziomach ROS może być niebezpieczny, uszkadzając składniki biologiczne niezbędne do funkcjonowania komórki, powodując zaburzenia oksydacyjne6. Jednak w niewielkich ilościach mitochondrialne ROS spełniają ważne funkcje sygnalizacyjne. Na przykład uwalnianieH2O2z mitochondriów jest zaangażowane w kontrolowanie aktywacji limfocytów T, sygnalizacji stresu (np. Indukcji szlaków sygnałowych Nrf2), indukcji proliferacji i różnicowania komórek, sygnalizacji i uwalnianiu insuliny oraz zachowaniach żywieniowych7. Poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu funkcji sygnalizacyjnej ROS. Jednak nadal pozostają ważne pytania dotyczące tego, które enzymy w mitochondriach służą jako najważniejsze źródła i jak kontrolowana jest produkcja.
Uwolnienie ROS przez miejsce produkcji zależy od kilku czynników: 1) stężenie miejsca oddawania elektronów, 2) stan redoks miejsca oddawania elektronów, 3) dostęp do tlenu, oraz 4) stężenie i rodzaj podłoża utleniającego3,8,9. W mitochondriach inne czynniki, takie jak stężenie NADH i siła potencjału błony, również wpływają na produkcję ROS8,10. Na przykład szybkość produkcji O2●-/H2O2 przez oczyszczony PDHC lub KGDHC wzrasta wraz ze wzrostem dostępności NADH5,11. W tym scenariuszu elektrony przepływają wstecz z NADH do centrum FAD w podjednostce E3 PDHC lub KGDHC, miejscu produkcji O2●-/H2O2 12. Podobnie, dostarczanie NAD+ ma odwrotny skutek, zmniejszając uwalnianie ROS z KGDHC12. Tak więc kontrolowanie wejścia lub wyjścia elektronów z miejsc produkcji ROS może zmienić ilość O2●-/H2O2 powstaje. Na przykład zablokowanie podjednostki E2 PDHC lub KGDHC za pomocą CPI-613, analogu kwasu liponowego, powoduje prawie 90% spadek produkcji O2●-/H2O213. Podobne wyniki można uzyskać za pomocą chemicznych katalizatorów S-glutationylionu, diamidu i disulfiramu, które prawie znoszą wytwarzanie O2●-/H2O2 przez PDHC lub KGDHC poprzez koniugację glutationu z podjednostką E214. Kompromisem w blokowaniu przepływu elektronów przez podjednostkę E2 PDHC i KGDHC jest zmniejszenie produkcji NADH, co zmniejsza tworzenie ROS przez łańcuch transportu elektronów (np. kompleks III). Może to również zmniejszyć produkcję ATP przez łańcuch transportu elektronów. Ogólnie rzecz biorąc, blokowanie wejścia elektronów do miejsc produkcji ROS może być bardzo skutecznym sposobem kontrolowania produkcji O2●-/H2O2.
Mitochondria mogą zawierać do 12 potencjalnych O2●-/H2O2 sources6. Większość z tych miejsc to enzymy zawierające flawiny, które wytwarzają mieszaninę O2●- iH2O2. Zastosowanie różnych kombinacji substratów i inhibitorów pozwoliło na zidentyfikowanie, które kompleksy oddechowe i dehydrogenazy mitochondrialne służą jako miejsca tworzenia O2●-/H2O2 o dużej pojemności w różnych tkankach3. Wykazano, że PDHC i KGDHC służą jako miejsca emitujące O2●-/H2O2 o dużej pojemności w mitochondriach mięśni i wątroby13,15. Pozostają jednak pewne trudności w odniesieniu do badania potencjału tworzeniaO2●-/H2O2 poszczególnych miejsc w mitochondriach oraz wpływu różnych kombinacji substratów i inhibitorów na aktywność enzymów. Wynika to z obecności niepożądanych reakcji ubocznych (np. tworzenie O2●-/H2O2 przez miejsca inne niż enzym będący przedmiotem zainteresowania), zanieczyszczających endogenne składniki odżywcze (np. kwasy tłuszczowe) lub organelle (np. peroksysomy, które również tworzą O2●-/H2O2) oraz stosowanie inhibitorów, które nie są selektywne, i/lub stosowanie związków, które nie hamują w pełni wytwarzania ROS. Niektóre inhibitory mogą również zmieniać bioenergetykę mitochondriów i kierunek przepływu elektronów, a to zmienia uwalnianie ROS z innych miejsc produkcji i zakłóca wyniki. Bezwzględne szybkości uwalniania O2●-/H2O2 z poszczególnych miejsc w mitochondriach są również trudne do określenia ilościowego ze względu na wysokie stężenie enzymów eliminujących O2●- iH2O2 w macierzy i przestrzeni międzybłonowej. Dlatego eliminacja wszelkich konkurencyjnych reakcji, które mogą zakłócać pomiary uwalniania O2●-/H2O2 może być przydatna przy identyfikacji miejsc tworzenia O2● o dużej pojemności.
Tutaj prezentujemy prostą metodę, która pozwala na jednoczesne badanie produkcji O2●-/H2O2 i tworzenia NADH przez oczyszczone dehydrogenazy zależne od flawiny. Dzięki zastosowaniu oczyszczonych enzymów można wyeliminować niepożądane reakcje uboczne tworzące ROS i enzymy rozkładające ROS, co pozwala na dokładniejszy pomiar natywnych wskaźników produkcji O2●-/H2O2 dla poszczególnych flawoenzymów. Metodę tę można wykorzystać do bezpośredniego porównania zdolności do tworzeniaO2●-/H2O2 różnych oczyszczonych dehydrogenaz lub do badania przesiewowego potencjalnych specyficznych dla miejsca inhibitorów uwalniania O2●-/H2O2. Wreszcie, jednoczesny pomiar O2●-/H2O2 i produkcji NADH może pozwolić na ocenę w czasie rzeczywistym związku między aktywnością enzymu a zdolnością uwalniania ROS.

<table><tbody><tr><td>Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>oczyszczony</td></tr><tr><td>kompleks dehydrogenazy alfa-ketoglutaranu</td><td>flawoenzymu SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>oczyszczony flawoenzym</td></tr><tr><td>30% roztwór nadtlenku wodoru</td><td>odczynnik SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>, krzywe standardowe</td></tr><tr><td>Odczynnik NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>, test</td></tr> <tr><td>aktywności/uwalniania ROSOdczynnik NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>, krzywe standardowe</td></tr><tr><td>pirogronian</td><td>Odczynnik SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>, test aktywności/uwalniania ROS</td></tr><tr>odczynnik<td>alfa-ketoglutaran</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>, test aktywności/uwalniania ROS</td></tr><tr><td>Odczynnik CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>, test aktywności/uwalniania ROS</td></tr><tr><td>pirofosforan tiaminy</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>odczynnik, test aktywności/uwalniania ROS</td></tr><tr><td>mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>składnik buforowy</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td> składnik <td>buforowy</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td> składnik <td>buforowy</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td> składnik <td>buforowy</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>, inhibitor uwalniania ROS</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td><td>odczynnik, inhibitor uwalniania ROS</td></tr><tr><td>SOD</td><td>Odczynnik SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>, odczynnik do wykrywania uwalniania</td></tr><tr><td>persoksydazy chrzanowej</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>, odczynnik do wykrywania uwalniania ROS</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>, wykrywanie uwalniania ROS</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Biotech Synergy 2</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>czytnik mikropłytek do testów</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Gen5</td><td>Oprogramowanie BioTek Instruments</td><td></td><td>, używane do zbierania surowych danych</td></tr><tr><td>RFU Graphpad Prism</td><td>Oprogramowanie Graphpad</td><td></td><td>, analiza danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Microsoft EXCEL</td><td>Microsoft</td><td></td><td>, analiza danych</td></tr></tbody></table>

jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i nadh przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Doniesiono, że mitochondria mogą zawierać do 12 enzymatycznych źródeł reaktywnych form tlenu (ROS). Większość z tych miejsc obejmuje zależne od flawiny kompleksy oddechowe i dehydrogenazy, które wytwarzają mieszaninę ponadtlenku (O2●-) i nadtlenku wodoru (H2O2). Dokładna kwantyfikacja potencjału wytwarzania RFT w poszczególnych miejscach w izolowanych mitochondriach może być trudna ze względu na obecność antyoksydacyjnych systemów obronnych i reakcji ubocznych, które również tworzą O, 2●-/H2O2. Stosowanie niespecyficznych inhibitorów, które mogą zakłócać bioenergetykę mitochondriów, może również zagrozić pomiarom poprzez zmianę uwalniania ROS z innych miejsc produkcji. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę jednoczesnego pomiaru uwalnianiaH2O2i produkcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) przez oczyszczone dehydrogenazy flawinowe. Do naszych celów użyliśmy jako przykładów oczyszczonego kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (PDHC) i kompleksu dehydrogenazy α-ketoglutaranu (KGDHC) pochodzenia sercowego świni. Metoda ta pozwala na dokładny pomiar natywnych szybkości uwalnianiaH2O2przez poszczególne miejsca produkcji poprzez eliminację innych potencjalnych źródeł ROS i systemów antyoksydacyjnych. Ponadto metoda ta pozwala na bezpośrednie porównanie zależności między uwalnianiemH2O2a aktywnością enzymu oraz badanie przesiewowe skuteczności i selektywności inhibitorów produkcji ROS. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może pozwolić na dogłębną ocenę natywnych szybkości uwalniania ROS dla poszczególnych enzymów przed przeprowadzeniem bardziej wyrafinowanych eksperymentów z izolowanymi mitochondriami lub przepuszczalnymi włóknami mięśniowymi.

Rysunek 3A przedstawia reprezentatywny zapis RFU zarejestrowany podczas jednoczesnego pomiaru produkcji H2O2 i NADH przez oczyszczoną KGDHC. Surowe dane RFU dla każdego przedziału czasowego przedstawiono na Rysunku 3B. Następnie surowe dane RFU są eksportowane do analizy. Poprzez ekstrapolację z krzywych standardowych przedstawionych na Rysunku 2, można określić bezwzględną iloś...

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie szybkości produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH oczyszczonych dehydrogenaz mitochondrialnych zawierających flawinę za pomocą fluorometrii mikropłytek. Mitrochondria mogą zawierać do 12 różnych miejsc tworzenia ponadtlenku/nadtlenku wodoru, które zostały zidentyfikowane przy użyciu różnych kombinacji substratów i inhibitorów z izolowanymi mitochondriami. Nadal jednak istnieją pewne trudności w dokładnym określeniu zdolności uwalniania poszczególnych miejsc produkcji w izolowanych mitochondriach.A to wiąże się z niepożądanymi reakcjami ubocznymi, które również wytwarzają reaktywne formy tlenu, ale także z obecnością przeciwutleniaczy i stosowaniem inhibitorów, którym brakuje specyficzności, a także ze stosowaniem dodatków, które mogą zakłócać pomiary. W artykule przedstawiono metodę jednoczesnego pomiaru produkcji nadtlenków/nadtlenków wodoru i NADH za pomocą oczyszczonych flawinozależnych dehydrogenaz mitochondrialnych. Metoda ta jest korzystna, ponieważ może pozwolić na bezpośrednie i dokładne określenie ilościowe potencjału wytwarzania ROS w poszczególnych miejscach produkcji poprzez eliminację niepożądanych reakcji uboc

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy zastosowanie spektrometru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) do badania reakcji redukcyjnej i utleniającej sideroforu A Aspergillus fumigatus (SidA), który jest monooksygenazą zależną od flawiny. Następnie przedstawiamy widma odpowiadające produktom reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Źródło:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumenty OroborosTen film wyjaśnia, w jaki sposób strumień tlenu jest wykorzystywany do oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach ssaków. Demonstruje sekwencyjne zastosowanie digitoniny, substratów metabolicznych, ADP, rozprzęgacza i inhibitora w celu scharakteryzowania różnych stanów oddechowych. Uzyskany w ten sposób profil strumienia tlenu ujawnia funkcję mitochondriów i wydajność...

Pomiary strumienia tlenu w celu oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

To badanie wprowadza metodologię badania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów za pomocą testów respirometrycznych i enzymatycznych. Bada modulację łańcucha transportu elektronów u różnych gatunków, dostarczając informacji na temat ukierunkowanego opracowywania biopestycydów przeciwko chorobom przenoszonym przez owady.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru nadtlenków i NADH w dehydrogenazach mitochondrialnych zawierających flawiny przy użyciu fluorometrii mikropłytkowej. Technika ta umożliwia dokładne określenie potencjału produkcji ROS.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Przeglądaj więcej filmów