Name: Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj cytometrię przepływową do oceny komórek macierzystych białaczki w ostrej białaczce szpikowej i ksenoprzeszczepach od pacjenta. Ta metoda pozwala ilościowo oznaczać populacje progenitorowe i LSC w standardowych laboratoriach hematologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Francuskie Stowarzyszenie Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Północne Centrum), Fondation de France (Komitet ds. Białaczki), SIRIC Oncolille i Francuski Narodowy Instytut Raka.

Przestrzegamy europejskich standardów wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. To badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (#3097-2015120414583482v3).
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pobrać szpik kostny (2 ml) z ostrej białaczki szpikowej de novo w probówkach zawierających antykoagulant kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w stężeniu 1,8 mg na ml szpiku kostnego.</li>
	<li>Wykonaj separację Ficoll, separację gradientu gęstości w celu wyizolowania komórek jednojądrzastych z krwinek czerwonych i granulocytów, jak pokazano poniżej. Rozcieńczyć szpik kostny w 3 objętościach buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Ostrożnie nałożyć 1 objętość Ficollu na 1 objętość rozcieńczonego szpiku kostnego. Wirować 30 minut przy 300 x g bez hamulca. Przenieś warstwę białego kożuchowego płaszcza komórek jednojądrowych do nowej sterylnej probówki.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie w 10 ml PBS) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, w celu usunięcia zanieczyszczających składników surowicy.</li>
</ol>
2. Liza czerwonych krwinek (RBC)
<ol>
	<li>Dodać 2 ml buforu do lizy (chlorek amonu 0,8%) do osadu komórkowego, delikatnie wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Wirować przy 300 x g przez 5 min. 
	Uwaga: w razie potrzeby powtórz ten krok.</li>
	<li>Przemyć komórki w PBS, jak opisano wcześniej (1.3.).</li>
</ol>
3. Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów.
<ol>
	<li>Pozyskanie komórek blastycznych ze szpiku kostnego po oddzieleniu Ficollu i po wyczerpaniu limfocytów za pomocą negatywnej selekcji immunomagnetycznej (CD3 dla limfocytów T i CD20 dla limfocytów B). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wstrzyknij 5 x 106 komórek blastycznych AML do żyły ogonowej nieuwarunkowanych myszy NSG. Użyj urządzenia krępującego, aby ułatwić wstrzyknięcie żyły ogonowej. Trzymaj myszy w konwencjonalnych warunkach, a zwłaszcza w warunkach wolnych od określonych patogenów przez cały czas, używając indywidualnych wentylowanych klatek i manipulując pod kapturem z przepływem laminarnym. Co dwa tygodnie pobieraj 60 μl krwi metodą pobierania podżuchwowego za pomocą naczynia włosowatego hematokrytu. Umieść kapilar w probówce o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Zatamować krwawienie, delikatnie uciskając go małym sterylnym gazikiem. Wydalić krew czystą strzykawką. </li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy i inkubować przez 5 minut. Następnie wirować przy 300 x g przez 5 minut. Przemyć PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, dodać 100 μl PBS z 10% barwnikiem albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 3 μl anty-ludzkiego CD45-FITC i 1 μl anty-mysiego CD45-APC i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć osad komórkowy dwa razy w PBS (2 ml) z 10% BSA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Podwielokrotność do 1 x 106 komórek na 100 μl PBS do probówek do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wszczepianie ankietowe co dwa tygodnie za pomocą analizy chimeryzmu ekspresji CD45 (człowiek kontra mysz) przy użyciu cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig">Figura 2A i B).</li>
	<li>Podczas składania ofiary (liczba blastów obwodowych większa niż 70% lub ciężkie objawy kliniczne choroby) należy pobrać jednojądrzaste komórki blastyczne ze zmiażdżonych śledzionów i szpiku kostnego, przepłukując piszczele i kości udowe PBS, jak opisano wcześniej13. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi. </li>
	<li>Jeśli osad komórkowy zawiera erytrocyty, należy przeprowadzić lizę czerwonych krwinek za pomocą buforu do lizy (krok 2.1).</li>
	<li>Przemyć komórki dwa razy w PBS (2 ml) z 10% BSA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać komórki i podwielokrotność do 1 x 106 komórek na 100 μl PBS do probówek do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Barwienie
<ol>
	<li>Dodaj sprzężone przeciwciała (patrz krok 4.2) i wir. Inkubuj komórki przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Poniższy panel należy zastosować do próbek pierwotnych lub PDX składających się z 10 μl anty-CD36-FITC, 5 μl anty-CD19-ECD, 5 μl anty-CD33-PC5.5, 5 μl anty-CD90-APC, 5 μl anty-CD34-AA700, 5 μl anty-CD45RA-APC-H7, 5 μl anty-CD38-Pacific Blue, 5 μL anty-CD123-PC7 i 2,5 μL anty-CD45-KO.</li>
	<li>Usunąć niezwiązane przeciwciała, przemłukując komórki w 2 ml PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 450 μl PBS w celu końcowej analizy cytometrycznej przepływu.</li>
</ol>
5. Strategia bramkowania do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj akwizycję danych (co najmniej 500 000 komórek) na cytometrze przepływowym wyposażonym w lasery czerwony, niebieski i fioletowy. Codziennie sprawdzaj ustawienia cytometru pod kątem 1) wyrównania optycznego, 2) układu fluidycznego, 3) czułości optycznej i 4) standaryzacji za pomocą fluorosfer</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania sekwencyjnego, aby zdefiniować wyrażenie CD38 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Użyj komórek z normalnych próbek szpiku kostnego, aby zdefiniować hematogonie lub komórki plazmatyczne, które będą służyć jako pozytywna kontrola ekspresji CD38. 
		Uwaga: ta bramka jest szczególnie ważna do oceny, ponieważ kolejne przypuszczalne populacje LSC zależą od jej definicji.</li>
		<li>Zdefiniuj fizjologiczne komórki prekursorowe (normalne komórki blastyczne) za pomocą kryteriów niskiej populacji CD45dim / SSC (rozproszenie boczne) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). W tej populacji blastów zdefiniuj hematogoni, które wykazują fenotyp CD38 + + CD19 + (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B) i na koniec użyj wyrażenia CD36 i CD33 do zdefiniowania mieloblastów, monoblastów i erytroblastów (<silna klasa = "xfig">Figura 1C). Określ ekspresję CD34 na hematogoniach, jak pokazano na (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Oceń kilka subpopulacji prekursorów w komórkach blastycznych zdefiniowanych jako P6-P10 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Oddziel przedział CD34 komórek blastycznych na subpopulacje progenitorowe P6, P7, P8 w oparciu o wstępnie ustawione bramki CD38. Upewnij się, że przedział P8 zawiera blasty, które mają taką samą intensywność CD38 jak hematogony, że P6 zawiera komórki, które są oparte na CD38 fluorescencji minus jeden (FMO) kontrola i że komórki P7 znajdują się pomiędzy dwoma skrajnościami w odniesieniu do ekspresji CD38 (<silna klasa = "xfig">Figura 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z komórek bramkowanych CD34 + 38- (P6) oddziel HSC od przypuszczalnego LSC za pomocą ekspresji CD90 i CD45RA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F). 
	Uwaga: fenotyp HSC to CD34+CD38-CD90+CD45RA-, a multipotencjalne czynniki progenitorowe (MPP) są zdefiniowane jako CD34+CD38-CD90-CD45RA-. Przypuszczalny fenotyp LSC to CD34+CD38-CD90dimCD45RA+, a bardziej niedojrzała populacja to progenitorzy zaszczepieni limfoidami (LMPP) zdefiniowani jako CD34+CD38-CD90-CD45RA+.</li>
</ol>
6. Monitorowanie MRD za pomocą RT-PCR
<ol>
	<li>Monitoruj poziomy MRD za pomocą RT-PCR, jak opisano wcześniej14.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dokładna i powtarzalna ocena markerów błonowych lub cytoplazmatycznych za pomocą cytometrii przepływowej wymaga, aby ustawienia przyrządu były codziennie weryfikowane pod kątem wyrównania optycznego, prawidłowego funkcjonowania układu fluidycznego, czułości optycznej i standaryzacji za pomocą koralików kalibracyjnych.
Wykrywanie populacji komórek blastycznych w AML za pomocą CD90 i CD45RA za pomocą wieloparametrycznej analizy cytometrii przepływowej jest stosunkowo prostą i niezawodną metodą. ...

Ostra białaczka szpikowa (AML) jest najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z białaczką. Początkowo AML jest chorobą klonalną hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) charakteryzującą się zatrzymaniem różnicowania, późniejszą akumulacją komórek blastycznych i zmniejszoną produkcją funkcjonalnych elementów krwiotwórczych. Ostatnio ustalono heterogeniczność klonalną populacji komórek blastycznych głównie przy użyciu strategii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i wykazując istnienie wewnątrzklonalnej ewolucji komórek nowotworowych1.
Heterogeniczność rozciąga się na obecność białaczkowych komórek macierzystych (LSC). Przypuszcza się, że ten dynamiczny przedział komórkowy ewoluuje, aby przezwyciężyć różne naciski selekcyjne wywierane podczas progresji i leczenia białaczki. W związku z tym uważa się, że LSC jest oporny na obecne schematy chemioterapeutyczne i pośredniczy w nawrocie choroby, co ma głębokie implikacje kliniczne2. Opisano różne markery charakteryzujące LSC, takie jak CD1233, CLL-14, CD975 lub TIM-36. Uważa się, że kompartment CD34 + CD38- komórek blastycznych jest wzbogacony dla LSC7, ale obejmuje również normalny HSC. Ekspresja CD90 i CD45RA zastosowana do przedziału CD34+CD38- (P6) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) pozwala na segregację kilku etapów prawidłowych i złośliwych prekursorów układu krwiotwórczego 8. W szczególności w większości przypadków AML można określić normalne komórki progenitorowe CD34 + CD38-CD90 + CD45RA, multipotencjalne komórki progenitorowe (MPP), takie jak CD34 + CD38-CD90 dimCD45RA- i CD34 + CD38-CD90-CD45RA + limfoidalne multipotencjalne komórki progenitorowe (LMPP) 8,9. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) CD38 jest szczególnie ważna, aby wziąć ją pod uwagę w przedziale komórkowym CD34 +. Ponieważ intensywność CD38 definiuje trzy nowe przedziały komórkowe: CD38 ujemny (P6), CD38 przyciemniony (P7) i CD38 jasny (P8) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). MFI CD38 można określić przy użyciu hematogonów i/lub komórek plazmatycznych jako wewnętrznej kontroli pozytywnej, ponieważ komórki te silnie eksprymują CD38.
Mysi modelNOD/SCID/IL2Rγc null (NSG) z niedoborem odporności jest powszechnie stosowany do wszczepiania prawidłowych i złośliwych ludzkich komórek krwiotwórczych10,11. Seryjne testy ksenotransplantacji są stosowane do eksperymentalnej walidacji funkcji LSC lub HSC. Badania te zostały szeroko przeanalizowane za pomocą podejść sekwencjonowania na dużą skalę. Niemniej jednak mniej wiadomo na temat immunofenotypu LSC i HSC populacji blastów AML wszczepionych myszom NSG w porównaniu z jej pierwotną AML (<silna klasa = "xfig">Figura 2).
Liczby LSC są z natury niskie, dlatego identyfikacja i kwantyfikacja LSC są trudne, a opisana tutaj metoda może być użyta jako test cytometrii przepływowej przy diagnozie i podczas obserwacji klinicznej w celu oceny odpowiedzi na chemioterapię (ponieważ resztkowe LSC może powodować nawrót AML). Obecność LSC może wskazywać na dodatnią minimalną chorobę resztkową (MRD). Do tej pory monitorowanie MRD w AML opiera się głównie na metodach molekularnych (tj. RT-PCR, NGS)10,12. Jednak w tym protokole wykrywamy jednoczesną ekspresję białka kilku markerów HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) na pierwotnych komórkach blastycznych ludzkiej AML za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej2,8,9. Ta kombinacja przeciwciał może być stosowana w każdym standardowym laboratorium cytometrii przepływowej, a ten test MRD przepływu jest szczególnie interesujący, gdy MRD za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) nie jest możliwe, tj. jeśli markery molekularne specyficzne dla białaczki nie są wykrywalne w próbce diagnostycznej AML. Co więcej, protokół ten jest komplementarny z bardziej czułymi molekularnymi technikami MRD, ponieważ ma na celu wykrycie i ilościowe określenie nieprawidłowych hematopoetycznych komórek progenitorowych, które reprezentują funkcjonalną charakterystykę komórki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).
Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje krwiotwórczych progenitorów i przypuszczalny przedział LSC o różnym stopniu dojrzewania za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałami dostępnymi w większości laboratoriów klinicznych. Ponadto potwierdziliśmy obecność tych przedziałów komórkowych w odpowiednich ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów (PDX) i podczas obserwacji leczenia.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10x)</td><td>Ozym</td><td>BLE420301</td><td>roztwór do lizy RBC A: 8,29 g NH4Cl + 0,037 g Na2EDTA w 100 ml sterylnego roztworu do lizy H2O i RBC: 1 g KHCO3 w 100 ml sterylnego H2O</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2R&gamma; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; myszy</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>Nr katalogowy: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; Bufor separacyjny MACS</td><td>Bufor MACS Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (klon FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (klon D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (klon 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (klon J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (klon 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (klon HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (klon LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (klon J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD123-PC7</td><td>Beckman Redlica</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola przepływu</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw selekcyjny EasySep do badania ludzkiego PE</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; magnes&nbsp;</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Ostra białaczka szpikowa (AML) jest chorobą niejednorodną, a jeśli nie jest leczona, śmiertelna. Jest to najczęstsza przyczyna śmiertelności związanej z białaczką u dorosłych. Początkowo AML jest chorobą hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) charakteryzującą się zatrzymaniem różnicowania, późniejszą akumulacją komórek blastycznych białaczki i zmniejszoną produkcją funkcjonalnych elementów hematopoetycznych. Heterogeniczność rozciąga się na obecność komórek macierzystych białaczki (LSC), przy czym ten dynamiczny przedział komórkowy ewoluuje, aby przezwyciężyć różne naciski selekcyjne wywierane podczas progresji i leczenia białaczki. Aby dokładniej określić populację LSC, dodanie CD90 i CD45RA pozwala na dyskryminację normalnych HSC i multipotencjalnych komórek progenitorowych w przedziale komórek CD34 + CD38. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji kilku przypuszczalnych markerów LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) na pierwotnych komórkach blastycznych ludzkiej AML za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Ponadto pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów. Ta metoda wykrywania i ilościowego oznaczania przypuszczalnego LSC może być stosowana do klinicznej obserwacji odpowiedzi na chemioterapię (tj. minimalnej choroby resztkowej), ponieważ resztkowa LSC może powodować nawrót AML.

Przedstawiamy tutaj metodę oznaczania populacji progenitorowych w prawidłowych i złośliwych próbkach szpiku kostnego człowieka. Pobrano szpik kostny oraz śledzionę z udanego modelu PDX i przeprowadzono multiparametryczną cytometrię przepływową zgodnie z powyższym opisem. Porównano kilka subpopulacji blastów w diagnostycznej próbce pacjenta oraz w odpowiadającym jej modelu PDX, a w szczególności przedział progenitorowy CD34+CD38-, w którym stwierdzono znaczne wzbogacenie domniemanych LSC. Wykazano, że frakcja blastów CD34...

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena komórek macierzystych białaczki w ostrej białaczce szpikowej i ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta za pomocą cytometrii przepływowej w momencie rozpoznania i obserwacji leczenia. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematologii/onkologii, takie jak kliniczne znaczenie ilościowej oceny komórek macierzystych białaczki za pomocą cytometrii przepływowej w ostrej białaczce szpikowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować w większości laboratoriów hematologicznych/onkologicznych z powszechnie stosowanymi przeciwciałami.Procedura ta zostanie zademonstrowana przez Thomasa, doktoranta, Fanny, doktorantkę, i Adeline, inżyniera z mojego laboratorium. Na początek zbierz dwa mililitry szpiku kostnego z de novo AML w probówkach zawierających 1,8 miligrama na mililitr antykoagulantu EDTA. Wyizoluj komórki jednojądrzaste z czerwonych krwinek i granulocytów, najpierw rozcieńczając szpik kostny w trzech objętościach PBS.Następnie ostrożnie nałożyć jedną objętość ficolu na jedną objętość rozcieńczonego szpiku kostnego. Wiruj gradientem gęstości z prędkością 300 g przez 30 minut bez przerwy. Następnie przenieś białą warstwę kożuchowego płaszcza komórek jednojądrowych do nowej sterylnej probówki.Aby usunąć supernatanty zanieczyszczające składniki surowicy, dodaj 10 mililitrów PBS i odwiruj komórki przy 300 g przez pięć minut przed powtórzeniem płukania. Zjonizuj czerwone krwinki, dodając dwa mililitry buforu do lizy do osadu komórkowego i delikatnie wiruj. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odwirować komórki o masie 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant. Następnie użyj PBS do umycia komórek. Po wyizolowaniu komórek blastycznych ze szpiku kostnego zgodnie z protokołem tekstowym, pod kapturem z przepływem laminarnym, włóż niekondycjonowaną mysz NSG do urządzenia ograniczającego i wstrzyknij pięć razy 10 do szóstych komórek blastycznych AML do żyły ogonowej.Umieść mysz z powrotem w indywidualnej, wentylowanej klatce w konwencjonalnych i określonych warunkach wolnych od patogenów. Co dwa tygodnie użyj metody pobierania podżuchwowego z krwią krwionośną, aby pobrać 60 mikrolitrów krwi. Przenieś kapilatę do pięciomililitrowej probówki, a następnie za pomocą sterylnego gazika delikatnie dociśnij, aby zatrzymać krwawienie.Dodaj jeden mililitr buforu do lizy do probówki i delikatnie odwiruj. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwiruj komórki z prędkością 300 g przez pięć minut.Następnie, po usunięciu supernatantu, dodać 100 mikrolitrów PBS z 10% BSA, trzy mikrolitry anty-ludzkiego CD45 FITC, inkubować przez 30 minut. Następnie umyj osad komórkowy dwa razy w PBS, dwa mililitry, z 10% BSA i odwiruj przy 300 g przez pięć minut. Co dwa tygodnie należy użyć cytometrii przepływowej, aby przeanalizować wszczepienie za pomocą analizy chimeryzmu ekspresji CD45 u ludzi w porównaniu z mysimi.Gdy liczba blastów jest większa niż 70% lub obserwuje się ciężkie objawy kliniczne choroby, należy złożyć zwierzę w ofierze i pobrać jednojądrzaste komórki blastyczne ze zmiażdżonej śledziony i szpiku kostnego za pomocą PBS do płukania piszczeli i kości udowych, jak opisano wcześniej. Aby przeprowadzić barwienie panelowe, połącz sprzężone przeciwciała z ludzkimi próbkami pierwotnego lub pobranego od pacjenta ksenoprzeszczepu lub PDX i przekręć probówki. Następnie inkubuj komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut.Usuń niezwiązane przeciwciała, używając dwóch mililitrów PBS do przemycia komórek. Ponownie zawiesić komórki w 450 mikrolitrach PBS, a następnie przystąpić do analizy cytometrii przepływowej i monitorowania MRD. Aby dokładnie i powtarzalnie ocenić błonę markerów cytoplazmatycznych za pomocą cytometrii przepływowej, sprawdź wyrównanie optyczne.Prawidłowe dostrojenie systemu 3D oraz czułość optyczna i stomatyzacja za pomocą kalibracji stomatyki bije na głowę każdy dzień. Użyj normalnego szpiku kostnego, aby ustawić bramki dla CD38. Wymagane jest co najmniej 500 000 zdarzeń i sprawdzane jest, czy każdy przebieg przepływu jest regularny i jednorodny.Ponadto eliminowane są dublety, a także martwe komórki i resztki komórek. Niedojrzałe komórki krwiotwórcze definiuje się tym, że są pośrednie CD45, SSC niskie. A kontrola pozytywna CD38 lub hematogonie są podwójnie dodatnie CD19 / CD38.Następnie definiuje się dodatni P8 lub CD38, pośredni P7 lub CD38 oraz ujemny P6 lub CD38. Komórki P6 można dalej podzielić na HSC, MPP i LSC. Ponieważ jest to prawidłowy szpik kostny, jest LSC ujemny.Za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej stwierdzono, że frakcja blastyczna CD34 dodatnia, CD38 ujemna była wyższa w PDX w porównaniu z diagnostyczną próbką pacjenta. Co ciekawe, w PDX stwierdzono wyższy odsetek domniemanego LSC w porównaniu z pierwotną próbką pacjenta, co sugeruje możliwe wzbogacenie złośliwych komórek progenitorowych w tkankach hematologicznych w tym modelu mysim. Po porównaniu populacji progenitorów blastu w dwóch różnych próbkach pacjentów, frakcja CD34 dodatnia, CD38 ujemna wzrosła z 0,06% w momencie rozpoznania do 3,33% podczas pierwszej obserwacji leczenia u pierwszego pacjenta.Natomiast frakcja CD34 dodatnia, CD38 ujemna zmniejszyła się u drugiego pacjenta z 7,8% w momencie rozpoznania do 2,27% w pierwszej obserwacji leczenia. W związku z tym przypuszczalna frakcja LSC wzrosła u pierwszego pacjenta z 0% w momencie rozpoznania do 0,65% i zmniejszyła się u drugiego pacjenta z 6,57% w momencie rozpoznania do 1,44% w okresie obserwacji leczenia. Monitorowanie minimalnej choroby resztkowej lub MRD, wykorzystujące jako markery molekularne mutację NPM1 u pacjenta pierwszego i fuzję genu CBF-beta MYH11 u pacjenta drugiego, wykazało, że molekularne MRD zmniejszyło się mniej u pierwszego pacjenta w porównaniu z drugim pacjentem w pierwszym punkcie obserwacji leczenia.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować ustawienia cytometrii przepływowej i pomiar CD38. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe metody, takie jak sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena funkcjonalnych komórek macierzystych białaczki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać i określać ilościowo komórki macierzyste białaczki w próbkach pobranych od pacjentów w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów. Nie zapominaj, że praca z próbkami od pacjentów może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wytyczne GOP i instytucjonalne procedury bezpieczeństwa.

flow-cytometry-to-estimate-leukemia-stem-cells-primary-acute-myeloid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Prezentujemy dwa różne protokoły barwienia do wykrywania ligandów NKG2D (NKG2DL) w próbkach ludzkiej pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML). Pierwsze podejście opiera się na białku fuzyjnym, zdolnym do rozpoznania wszystkich znanych i potencjalnie jeszcze nieznanych ligandów, podczas gdy drugi protokół opiera się na dodaniu wielu przeciwciał anty-NKG2DL.

Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Poznaj cytometrię przepływową do oceny komórek macierzystych białaczki w ostrej białaczce szpikowej i ksenoprzeszczepach od pacjenta. Ta metoda pozwala ilościowo oznaczać populacje progenitorowe i LSC w standardowych laboratoriach hematologicznych.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji (Wideo) | JoVE Journal

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Przeglądaj więcej filmów