Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Ogólnym celem tej procedury jest ocena komórek macierzystych białaczki w ostrej białaczce szpikowej i ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta za pomocą cytometrii przepływowej w momencie rozpoznania i obserwacji leczenia. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematologii/onkologii, takie jak kliniczne znaczenie ilościowej oceny komórek macierzystych białaczki za pomocą cytometrii przepływowej w ostrej białaczce szpikowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować w większości laboratoriów hematologicznych/onkologicznych z powszechnie stosowanymi przeciwciałami.

Procedura ta zostanie zademonstrowana przez Thomasa, doktoranta, Fanny, doktorantkę, i Adeline, inżyniera z mojego laboratorium. Na początek zbierz dwa mililitry szpiku kostnego z de novo AML w probówkach zawierających 1,8 miligrama na mililitr antykoagulantu EDTA. Wyizoluj komórki jednojądrzaste z czerwonych krwinek i granulocytów, najpierw rozcieńczając szpik kostny w trzech objętościach PBS.

Następnie ostrożnie nałożyć jedną objętość ficolu na jedną objętość rozcieńczonego szpiku kostnego. Wiruj gradientem gęstości z prędkością 300 g przez 30 minut bez przerwy. Następnie przenieś białą warstwę kożuchowego płaszcza komórek jednojądrowych do nowej sterylnej probówki.

Aby usunąć supernatanty zanieczyszczające składniki surowicy, dodaj 10 mililitrów PBS i odwiruj komórki przy 300 g przez pięć minut przed powtórzeniem płukania. Zjonizuj czerwone krwinki, dodając dwa mililitry buforu do lizy do osadu komórkowego i delikatnie wiruj. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Odwirować komórki o masie 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant. Następnie użyj PBS do umycia komórek. Po wyizolowaniu komórek blastycznych ze szpiku kostnego zgodnie z protokołem tekstowym, pod kapturem z przepływem laminarnym, włóż niekondycjonowaną mysz NSG do urządzenia ograniczającego i wstrzyknij pięć razy 10 do szóstych komórek blastycznych AML do żyły ogonowej.

Umieść mysz z powrotem w indywidualnej, wentylowanej klatce w konwencjonalnych i określonych warunkach wolnych od patogenów. Co dwa tygodnie użyj metody pobierania podżuchwowego z krwią krwionośną, aby pobrać 60 mikrolitrów krwi. Przenieś kapilatę do pięciomililitrowej probówki, a następnie za pomocą sterylnego gazika delikatnie dociśnij, aby zatrzymać krwawienie.

Dodaj jeden mililitr buforu do lizy do probówki i delikatnie odwiruj. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwiruj komórki z prędkością 300 g przez pięć minut.

Następnie, po usunięciu supernatantu, dodać 100 mikrolitrów PBS z 10% BSA, trzy mikrolitry anty-ludzkiego CD45 FITC, inkubować przez 30 minut. Następnie umyj osad komórkowy dwa razy w PBS, dwa mililitry, z 10% BSA i odwiruj przy 300 g przez pięć minut. Co dwa tygodnie należy użyć cytometrii przepływowej, aby przeanalizować wszczepienie za pomocą analizy chimeryzmu ekspresji CD45 u ludzi w porównaniu z mysimi.

Gdy liczba blastów jest większa niż 70% lub obserwuje się ciężkie objawy kliniczne choroby, należy złożyć zwierzę w ofierze i pobrać jednojądrzaste komórki blastyczne ze zmiażdżonej śledziony i szpiku kostnego za pomocą PBS do płukania piszczeli i kości udowych, jak opisano wcześniej. Aby przeprowadzić barwienie panelowe, połącz sprzężone przeciwciała z ludzkimi próbkami pierwotnego lub pobranego od pacjenta ksenoprzeszczepu lub PDX i przekręć probówki. Następnie inkubuj komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut.

Usuń niezwiązane przeciwciała, używając dwóch mililitrów PBS do przemycia komórek. Ponownie zawiesić komórki w 450 mikrolitrach PBS, a następnie przystąpić do analizy cytometrii przepływowej i monitorowania MRD. Aby dokładnie i powtarzalnie ocenić błonę markerów cytoplazmatycznych za pomocą cytometrii przepływowej, sprawdź wyrównanie optyczne.

Prawidłowe dostrojenie systemu 3D oraz czułość optyczna i stomatyzacja za pomocą kalibracji stomatyki bije na głowę każdy dzień. Użyj normalnego szpiku kostnego, aby ustawić bramki dla CD38. Wymagane jest co najmniej 500 000 zdarzeń i sprawdzane jest, czy każdy przebieg przepływu jest regularny i jednorodny.

Ponadto eliminowane są dublety, a także martwe komórki i resztki komórek. Niedojrzałe komórki krwiotwórcze definiuje się tym, że są pośrednie CD45, SSC niskie. A kontrola pozytywna CD38 lub hematogonie są podwójnie dodatnie CD19 / CD38.

Następnie definiuje się dodatni P8 lub CD38, pośredni P7 lub CD38 oraz ujemny P6 lub CD38. Komórki P6 można dalej podzielić na HSC, MPP i LSC. Ponieważ jest to prawidłowy szpik kostny, jest LSC ujemny.

Za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej stwierdzono, że frakcja blastyczna CD34 dodatnia, CD38 ujemna była wyższa w PDX w porównaniu z diagnostyczną próbką pacjenta. Co ciekawe, w PDX stwierdzono wyższy odsetek domniemanego LSC w porównaniu z pierwotną próbką pacjenta, co sugeruje możliwe wzbogacenie złośliwych komórek progenitorowych w tkankach hematologicznych w tym modelu mysim. Po porównaniu populacji progenitorów blastu w dwóch różnych próbkach pacjentów, frakcja CD34 dodatnia, CD38 ujemna wzrosła z 0,06% w momencie rozpoznania do 3,33% podczas pierwszej obserwacji leczenia u pierwszego pacjenta.

Natomiast frakcja CD34 dodatnia, CD38 ujemna zmniejszyła się u drugiego pacjenta z 7,8% w momencie rozpoznania do 2,27% w pierwszej obserwacji leczenia. W związku z tym przypuszczalna frakcja LSC wzrosła u pierwszego pacjenta z 0% w momencie rozpoznania do 0,65% i zmniejszyła się u drugiego pacjenta z 6,57% w momencie rozpoznania do 1,44% w okresie obserwacji leczenia. Monitorowanie minimalnej choroby resztkowej lub MRD, wykorzystujące jako markery molekularne mutację NPM1 u pacjenta pierwszego i fuzję genu CBF-beta MYH11 u pacjenta drugiego, wykazało, że molekularne MRD zmniejszyło się mniej u pierwszego pacjenta w porównaniu z drugim pacjentem w pierwszym punkcie obserwacji leczenia.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować ustawienia cytometrii przepływowej i pomiar CD38. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe metody, takie jak sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ocena funkcjonalnych komórek macierzystych białaczki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać i określać ilościowo komórki macierzyste białaczki w próbkach pobranych od pacjentów w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów. Nie zapominaj, że praca z próbkami od pacjentów może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wytyczne GOP i instytucjonalne procedury bezpieczeństwa.