Test behawioralny do badania roli pamięci przestrzennej podczas instynktownej obrony u myszy
21 lipca 2018
Ten protokół opisuje test behawioralny, oparty na teście labiryntu Barnesa, w celu zbadania, jak instynktowne działania obronne są modyfikowane przez wiedzę o środowisku przestrzennym.
Ten test może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pamięci przestrzennej, takie jak sposób, w jaki zwierzęta nawigują w kierunku niedawno poznanej lokalizacji celu. Główną zaletą tego paradygmatu jest to, że wywołuje on etiologicznie ważne zachowania nawigacyjne ukierunkowane na cel, które są wyzwalane przez dobrze kontrolowany bodziec sensoryczny i nie wymaga wcześniejszego szkolenia myszy. Zacznij od przymocowania wskazówek wizualnych na obrzeżach platformy, które powinny znajdować się co najmniej dwa centymetry od krawędzi, aby myszy nie mogły do nich dotrzeć.
Przymocuj wiatę do platformy. Następnie umieść diodę elektroluminescencyjną lub diodę LED przy wejściu do schronu, aby zapewnić lokalną wizualną wskazówkę dotyczącą punktu orientacyjnego. Następnie, aby odizolować mysz od zewnętrznych dystalnych sygnałów wizualnych, zmontuj ośmiokątną ścianę rozciągającą się 40 centymetrów powyżej i 15 centymetrów pod powierzchnią platformy wokół areny, umieszczoną w odległości 10 centymetrów od krawędzi platformy.
Umieść głośnik ultradźwiękowy 50 centymetrów nad środkiem platformy, aby dostarczać awersyjne bodźce słuchowe i podłącz kartę dźwiękową i amplifier do głośnika. Następnie umieść półprzezroczysty ekran 64 centymetry nad areną, aby wyświetlać nad głową awersyjne bodźce wizualne za pomocą projektora. Skalibruj światło projektora tak, aby na środku powierzchni platformy znajdowało się od pięciu do 10 występów.
Umieść światła podczerwone i kamerę na podczerwień z filtrem stratnoprzepustowym nad platformą, aby zapobiec migotaniu ochraniacza w pozyskanym filmie. Następnie umieść aparat behawioralny w pudełku odpornym na dźwięk i światło, aby zapobiec wpływowi zewnętrznych sygnałów na eksperyment. Na koniec użyj dostępnego na rynku oprogramowania, aby śledzić pozycję myszy w Internecie.
Zacznij od projekcji bodźców wizualnych na ekran umieszczony nad areną. Śledź pozycję myszy w trybie online i wstępnie zdefiniuj obszar zainteresowania na arenie odpowiadający lokalizacji wcześniej zdefiniowanego bodźca wizualnego, aby wyśrodkować bodziec wzrokowy nad zwierzęciem. Następnie przetestuj bodziec słuchowy składający się z ciągu trzech modulowanych częstotliwościowo wymiatania w górę od 17 do 20 kiloherców w ciągu trzech sekund, trwających łącznie dziewięć sekund.
Zacznij od skrupulatnego oczyszczenia powierzchni platformy 70% etanolem, aby usunąć niechciane sygnały węchowe. Opłucz schronienie wodą i 70% etanolem, a następnie ponownie umyj wodą, aby pozbyć się zapachu etanolu. Dokładnie osusz zarówno platformę, jak i schronienie, ponieważ mysz może uniknąć wejścia do schronu, jeśli jest mokry.
Zmieniaj położenie schronu na platformie dla każdej próby, obracając platformę przed eksperymentem. Następnie przynieś mysz do pokoju eksperymentalnego w jej domowej klatce i umieść klatkę obok platformy testowej na 10-minutowy okres aklimatyzacji. Dodaj dwa gramy ściółki z domowej klatki myszy do wnętrza schronienia, aby służyły jako lokalna wskazówka węchowa
.Wyjmij mysz z klatki domowej i unikaj chwytania za ogon. Albo go przygarnij, albo pozwól mu wspiąć się na przedmiot wzbogacający, który można podnieść. Następnie delikatnie umieść mysz na środku areny i rozpocznij akwizycję wideo.
Pozwól na siedmiominutowy okres przyzwyczajenia, podczas którego nie występuje żaden bodziec awersyjny. Upewnij się, że mysz ma wystarczająco dużo czasu, aby znaleźć i wejść do schronu przynajmniej raz, czyli wtedy, gdy wszystkie cztery kończyny znajdują się w schronieniu. Następnie automatycznie lub ręcznie uruchom dostarczanie bodźca wizualnego wyśrodkowanego nad myszą, gdy zwierzę dotrze do zdefiniowanego obszaru zainteresowania.
Aby wywołać więcej niż jedną reakcję ucieczki w tej samej sesji, pozwól myszy dobrowolnie opuścić schronienie. Po zakończeniu testu należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej. Na koniec wyczyść platformę i schronienie przed przetestowaniem następnego zwierzęcia.
Myszy wystawione na bodźce słuchowe lub wzrokowe inicjowały szybkie reakcje ucieczki z krótkimi opóźnieniami między początkiem stymulacji a rozpoczęciem lotu. Średnie opóźnienie ucieczki od bodźca było znacznie dłuższe w przypadku stymulacji słuchowej niż wizualnej. Co więcej, nawigacja do schronienia była dokładna, a trajektorie lotu były bliskie linii prostej w zależności od rodzaju bodźców.
Po siedmiominutowym okresie aklimatyzacji w labiryncie bez żadnego schronienia, prezentacja długiego bodźca wizualnego spowodowała zamrożenie zamiast ucieczki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 90 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przedstawieniu bodźca wizualnego powyżej lub powyżej w głowie myszy, a nie podczas badania krawędzi platformy, ponieważ prawdopodobnie przegapi bodziec.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zachowaniem instynktownym do zbadania kontroli wyuczonej wiedzy nad instynktownym zachowaniem obronnym u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zachowania obronne u myszy i jak wykorzystać je do badania nawigacji przestrzennej podczas reakcji ucieczki.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje test behawioralny oparty na labiryncie Barnesa, służący do badania instynktownych działań obronnych modyfikowanych przez wiedzę o środowisku przestrzennym. Jego celem jest wyjaśnienie, w jaki sposób zwierzęta nawigują w kierunku wyuczonych lokalizacji celu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Pamięć przestrzenna
Wstęp
- Test labiryntu Barnesa jest powszechnie stosowaną metodą oceny uczenia się przestrzennego i pamięci u gryzoni.
- Analiza ta umożliwia badanie zachowań nawigacyjnych ukierunkowanych na cel bez uprzedniego treningu.
- Zrozumienie zachowań obronnych w relacji do wskazówek przestrzennych może dostarczyć informacji na temat działań instynktownych.
- Poprzednie badania wykazały, że bodźce sensoryczne mogą znacząco wpływać na reakcje ucieczkowe.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób bodźce wzrokowe i słuchowe wpływają na zachowania obronne u myszy.
- Zbadanie związku między wiedzą nabytą a reakcjami instynktownymi.
- Opracowanie wiarygodnej metody wywoływania i pomiaru zachowań ucieczkowych w kontrolowanym środowisku.
Zastosowane metody
- Konfiguracja labiryntu Barnesa ze stymulacją wizualną i słuchową.
- Wykorzystanie kamer podczerwieni do śledzenia ruchów myszy.
- Kalibracja bodźców sensorycznych w celu wywołania specyficznych reakcji ucieczkowych.
- Aklimatyzacja myszy do środowiska testowego przed rozpoczęciem prób.
Główne wyniki
- Myszy wykazywały szybkie reakcje ucieczki w odpowiedzi na bodźce słuchowe i wzrokowe.
- Czas latencji ucieczki był dłuższy w przypadku bodźców słuchowych w porównaniu do bodźców wzrokowych.
- Zaobserwowano dokładną nawigację w kierunku schronienia niezależnie od rodzaju bodźca.
- Odnotowano zachowanie zamierania (freezing), gdy podczas aklimatyzacji nie zapewniono schronienia.
Wnioski
- Analiza ta skutecznie demonstruje wpływ bodźców sensorycznych na zachowania obronne.
- Metoda ta może być wykorzystana do dalszego badania kontroli zachowań instynktownych u myszy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia nawigacji przestrzennej i pamięci w odniesieniu do wyuczonych wskazówek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ten test pozwala badaczom z sektora biofarmaceutycznego ocenić, w jaki sposób nabyta pamięć przestrzenna moduluje instynktowne zachowania obronne u myszy, zapewniając model translacyjny do badania nawigacji ukierunkowanej na cel w warunkach awersyjnych. Poprzez powiązanie reakcji wyzwalanych sensorycznie z mapowaniem poznawczym, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych w przypadku terapii neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych. Oferuje ona pozbawiony etapu treningu, etologicznie istotny paradygmat, który zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych związków wpływających na lęk, niepokój lub poznanie przestrzenne na etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje, w jaki sposób pamięć przestrzenna wpływa na zachowania obronne, wyjaśniając obwody neuronalne zaangażowane w reakcję na zagrożenie i nawigację.
- Wartość operacyjna: Umożliwia testowanie hipotez bez konieczności wcześniejszego szkolenia, co zmniejsza zmienność i przyspiesza badania nad angażowaniem celów we wczesnej fazie.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty czasu latencji ucieczki oraz dokładności nawigacji, umożliwiając standaryzowaną ocenę wpływu związków na przetwarzanie sensoryczne i podejmowanie decyzji.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testu poprzez kontrolowane dostarczanie bodźców i zautomatyzowany tracking, co poprawia powtarzalność w ramach kampanii screeningowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy wrodzone zachowania z poznawczym uczeniem się, oferując wgląd w to, jak kontekst środowiskowy zmienia szlaki odpowiedzi na leki w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie zachowań adaptacyjnych w zmieniających się warunkach środowiskowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od identyfikacji celu po optymalizację wiodących związków, w szczególności w przypadku związków celujących w obwody neuronalne odpowiedzialne za strach, lęk lub pamięć przestrzenną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów modulacji reakcji instynktownych przez wyuczone cele, pomagając w ograniczaniu ryzyka związanego z wyborem celu terapeutycznego.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników behawioralnych odpowiednich do wysokoprzepustowego screeningu związków neuroaktywnych.
- Analityka: Umożliwia pomiar latencji ucieczki, efektywności ścieżki oraz precyzji dotarcia do schronienia jako parametrów farmakodynamicznych.
- Badania translacyjne: Modeluje wpływ wiedzy przestrzennej na strategie obronne, co jest istotne w badaniach nad PTSD, chorobą Alzheimera oraz uzależnieniami.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Stanowi skalowalną platformę do oceny terapeutyków ukierunkowanych na OUN na wielu etapach procesu odkrywania leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez wyizolowanie wkładu pamięci przestrzennej w zachowania obronne.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę wstępnego szkolenia, zmniejszając obciążenie operacyjne i zwiększając przepustowość w głównych ośrodkach badań behawioralnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez ujawnianie zależnych od kontekstu efektów działania leków, które mogą zostać pominięte w standardowych testach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o efekty zaobserwowane w etologicznie poprawnych scenariuszach z wyzwaniami środowiskowymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie neuronauki behawioralnej oraz systemów śledzenia opartych na obrazowaniu wideo.
- Zależne od precyzyjnej kalibracji bodźców słuchowych i wzrokowych oraz konfiguracji obrazowania w podczerwieni.
- Wymaga standaryzacji czyszczenia platformy i przygotowania schronienia w celu kontrolowania zakłóceń zapachowych.
- Należy uwzględnić indywidualną zmienność w eksploracji i zachowaniach poszukiwania schronienia podczas habituacji.
- Ograniczone do modeli mysich; ekstrapolacja na inne gatunki wymaga walidacji behawioralnej i anatomicznej.
