Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis
25 grudnia 2017
Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wykonanie mikroiniekcji do zarodków nosa szklistego w celu ułatwienia manipulacji genomowej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z biologią nosa wiciowatego i pióra, takie jak produkcja jadu i determinacja płci. Główną zaletą stosowania tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią manipulację genomem osy i oferuje szeroką gamę zaawansowanych modyfikacji genomowych.
Procedurę zademonstruje Ming Li, post-doc z naszego laboratorium. Na początek stwórz kilka kolonii N.vitripennis, umieszczając od 200 do 500 dorosłych osobników w stosunku trzech do jednego samic do samców w klatkach dla owadów. Utrzymuj osy w temperaturze 25 plus minus jeden stopień Celsjusza przy wilgotności względnej 30% i cyklu od 12 do 12 światła/ciemności.
Przez dwa dni pozwól krytym samicom żywić się świeżymi poczwarkami S. bullata, a także małymi kropelkami roztworu sacharozy o objętości od jednej do dziesięciu objętości. Przez następne dwa dni usuwaj poczwarki muchówki, aby pozbawić samice os miejsca składania jaj, czyniąc je bardzo ciężkimi. Aby utrzymać świeżość poczwarek S.bullotae, przechowuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza natychmiast po uzyskaniu i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to konieczne.
Rozróżnij młodych żywicieli, którzy mają poczwarkę w kolorze czerwonym, od starszych żywicieli, którzy mają poczwarkę w ciemniejszym kolorze. Pozwól samicom os pasożytować na młodym żywicielu, umieszczając pojedyncze świeże poczwarki S. bullata w piankowym korku z otworem wielkości poczwarki wyciętym pośrodku. Aby uzyskać maksymalną koncentrację pasożytowania i łatwiejsze pobieranie zarodków, należy odsłonić tylko około 0,2 centymetra przedniego końca żywiciela, który jest zaokrąglony, w porównaniu z tylnym końcem, który jest grubszy i zawiera otwór przypominający krater.
Umieść poczwarki żywiciela w tym układzie w klatce i odczekaj około 45 minut, aby osy mogły je pasożytować. Usuń pasożytniczych żywicieli, pobierając ich ręcznie i delikatnie stukając lub zdmuchując wszelkie pozostałe osy. Zastąp je świeżymi żywicielami mniej więcej co 15 minut, aby kontynuować zbieranie jaj we wczesnym stadium podczas wstrzyknięć.
Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać tylny koniec zewnętrznej poczwarki świeżo spasożytowanego żywiciela, aby odsłonić jaja N. vitripennis. Następnie przygotuj szkiełko wyrównujące zarodki, używając płynnego kleju, aby przykleić szkiełko nakrywkowe do czystego szkiełka podstawowego. Za pomocą mokrego pędzla z cienką końcówką ostrożnie zetrzyj zarodki z żywiciela, uważając, aby nie uszkodzić miękkiej, poczwarkowej skóry żywiciela.
Następnie mokrym pędzlem przenieś około 20 zarodków jeden po drugim na szkiełko podstawowe, bezpośrednio przylegające do boku szkiełka nakrywkowego. Ustawić przedni koniec zarodka na krawędzi szkiełka przykrywczego, tak aby tylne końce zarodka były skierowane w tym samym kierunku. Pozwoli to na większą precyzję iniekcji w tę samą pozycję wśród wszystkich zarodków.
Po wyciągnięciu igieł iniekcyjnych zgodnie z protokołem tekstowym, należy ukosować końcówkę igły, lekko dotykając końcówki do diamentowej płytki ściernej w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około 10 sekund. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników modyfikujących genom i przechowywać ją na lodzie. Za pomocą końcówki do mikroładowarki naładować igłę iniekcyjną dwoma mikrolitrami mieszanki iniekcyjnej.
Następnie umieść szklane szkiełko z wyściełanymi zarodkami na stoliku mikroskopu złożonego. Ostrożnie wbić igłę w tylny koniec zarodka pod kątem pionowym od 25 do 35 stopni. Następnie wstrzyknąć od jednego do pięciu pikolitrów mieszaniny iniekcyjnej i upewnić się, że embyro lekko pęcznieje wraz z wstrzyknięciem.
Jeśli dojdzie do zatkania, spróbuj ponownie ukosować igły. Cytoplazma zarodków N.vitripennis jest niezwykle lepka i lepka, co prowadzi do częstego zatykania się igieł. Wstrzyknij około 20 do 40 jaj na raz, a następnie przestań.
Przenieś wstrzyknięte jaja mokrym pędzlem, lekko dotykając wstrzykniętych jaj i umieść je w żywicielu. Następnie należy kontynuować wstrzykiwanie, używając świeżej, świeżo złożonej partii jaj. Idealnie byłoby, gdyby ten krok był najbardziej skuteczny, gdy jedna osoba zbiera i ustawia jaja, podczas gdy inna osoba wstrzykuje składniki modyfikacji genomu i przeszczepia wstrzyknięte zarodki do poczwarek gospodarza.
Po mikroiniekcji za pomocą mokrego pędzla ostrożnie umieść do 40 wstrzykniętych zarodków G zero pojedynczo na uprzednio użądlonej poczwarce S.bullata. Umieść poczwarki gospodarza na szalce Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną i wacikami i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności około 70%, aż wstrzyknięte zarodki wyklują się w ciągu około jednego do dwóch dni. Co ważne, żywicieli można pozostawić z oderwanym poczwarką, a jaja N.vitripennis będą się normalnie rozwijać, o ile będą inkubowane w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu.
Po wykluciu się zarodków G zero przenieś poczwarki gospodarza na nową szalkę Petriego i wysiaduj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 70%. Codziennie monitoruj poczwarki żywiciela i wstrzyknięte larwy G zero. Jeśli poczwarki żywiciela mają nieprzyjemny zapach, przenieś wstrzyknięte larwy do nowych, zdrowych poczwarek gospodarza.
W celu skutecznej penetracji igły i mikroiniekcji do zarodków N. vitripennis, przetestowano różne ściągacze do mikropipet z kilkoma rodzajami igieł ze szkła kapilarnego z włóknami, w tym kwarcem, glinokrzemianem i borokrzemianem, aby uzyskać pożądaną długą końcówkę przypominającą podskórną, skuteczną w mikroiniekcji zarodków N. vitripennis. Zastosowane tutaj komponenty modyfikacji genomu to zmieszane przewodnikowe RNA i białko cas9 do wyraźniejszej edycji genomu. W tym eksperymencie sgRNA ukierunkowane na gen cynobru wstrzyknięto w różnych ilościach, wraz z białkiem cas9, do N. vitripennis.
Poniższa tabela pokazuje, że wskaźniki przeżycia były zależne od dawki, ponieważ zwiększone stężenie sgRNA i białka cas9 prowadziło do zmniejszenia wskaźników przeżycia. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby uważać, aby nie nakłuwać ani nie wysuszać zarodków osy podczas manipulacji lub transferu, ostrożnie używając zwilżonego pędzla z cienką końcówką lub szpikulca do zarodków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie pobierać, mikrowstrzykiwać i przeszczepiać zarodki osy, aby z powodzeniem przeprowadzić zaawansowane modyfikacje genomu.
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę mikroiniekcji do zarodków Nasonia vitripennis, ułatwiającą dziedziczone modyfikacje genomu. Metoda ma na celu ulepszenie manipulacji genomowych w tym organizmie, wspierając badania w dziedzinach takich jak produkcja jadu i determinacja płci.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genomika
- Embriologia
Tło
- Nasonia vitripennis jest organizmem modelowym w badaniach genetycznych.
- Mikroiniekcja umożliwia bezpośrednie manipulowanie genomem osy.
- Ta technika może dostarczyć wglądów w procesy biologiczne.
- Modyfikacje genomu mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania biologiczne.
Cel badania
- Rozwój niezawodnego protokołu mikroiniekcji dla Nasonia vitripennis.
- Ułatwienie zaawansowanych modyfikacji genomowych.
- Poprawa rozumienia biologii osy.
Stosowane metody
- Ustanawianie kolonii Nasonia vitripennis do pobierania zarodków.
- Mikroiniekcja zarodków reagentami do modyfikacji genomu.
- Ostrożne traktowanie zarodków, aby zapobiec uszkodzeniom.
- Monitorowanie zastrzykniętych zarodków w celu stwierdzenia pomyślnego rozwoju.
Główne wyniki
- Udało się wykonać pomyślne mikroiniekcje zarodków Nasonia vitripennis.
- Wstrzyknięcie komponentów modyfikacji genomu wykazało różne współczynniki przeżywalności.
- Zarodki rozwijały się normalnie w kontrolowanych warunkach.
- Technika wykazała potencjał do dziedzicznych modyfikacji genomu.
Wnioski
- Metoda mikroiniekcji jest skuteczna w manipulacji genomowej w Nasonia vitripennis.
- Ta technika może postępować w badaniach nad biologią osy.
- Dalsze badania mogą eksplorować różne modyfikacje genetyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in functional genomics for Nasonia vitripennis, a model organism with unique haplodiploid genetics relevant to target validation in insect-borne disease and symbiont research. By enabling precise delivery of genome editing reagents into embryos, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic targets and phenotypic screening platforms. It enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible system for assessing gene function in a disease-relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through targeted genome modification in a genetically tractable system.
- Operational Value: Provides a streamlined workflow for embryo retrieval, microinjection, and transplantation, reducing technical failure rates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts (e.g., survival rates, hatch rates) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Supports scalable preparation of injected embryos for downstream screening campaigns using CRISPR libraries or compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by enabling gene edits in pathways linked to venom synthesis and host-symbiont interactions.
- Operational Value: Ensures developmental continuity from embryo to larva, supporting longitudinal phenotypic assessment in preclinical-like conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling target validation through genome editing prior to lead identification and preclinical evaluation in invertebrate models of host-pathogen or symbiont interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via precise gene knockout or knock-in to clarify gene function in sex determination and venom production pathways.
- Screening: Delivers embryos with consistent microinjection quality, enabling reproducible compound or genetic screening outputs.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as embryo survival and hatch rates to quantify editing efficiency and toxicity.
- Translational Research: Connects genetic modification to phenotypic outcomes in a system with relevance to invertebrate immunity and symbiont-mediated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative genome modification campaigns across multiple target genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling heritable genome modifications and reducing false positives from off-target effects.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection procedures, improving reproducibility across users and laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing functional evidence in a genetically manipulable system.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions through quantitative assessment of phenotypic consequences following gene editing.
Implementation Considerations
- Expertise in embryo handling and microinjection techniques under dissection and compound microscopy.
- Access to microloader tips, capillary glass, and micropipette pullers for needle preparation.
- Environmental controls for host pupae storage (4°C) and embryo incubation (25°C, 70% humidity).
- Adaptation considerations for varying embryo stages and host pupae conditions affecting injection success.
- Limitations include embryo fragility, cytoplasmic viscosity causing needle clogging, and dependence on host pupae availability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
N. vitripennis Colony Rearing
1:40
Collection and Alignment of N. vitripennis Pre-blastoderm Stage Embryos
4:13
Embryo Microinjection
5:58
Transplanting Injected G0 N. vitripennis Embryos onto Pre-stung Host
7:15
Results: sgRNA and Cas9 Microinjection in N. vitripennis Transplanted Embryos
8:23
Conclusion
