Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie wykonalnego sposobu pozyskiwania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu myszy i hodowania ich in vitro przy zachowaniu ich pierwotnych właściwości. Metoda ta pomoże badaczom RPE w zdobyciu umiejętności preparacji, które są wymagane do ustanowienia hodowli komórek RPE u myszy, oraz w zademonstrowaniu, jak to zrobić w łatwy sposób. Główną zaletą tej procedury jest to, że jest prosta i wykonalna.

Jedyne, czego potrzeba, to praktyka, a wizualna demonstracja izolacji RPE i mikroskopia dosłownie pokazuje, jak uzyskać wymagane umiejętności. Aby odizolować gałki oczne myszy, najpierw poddaj je eutanazji przy użyciu dowolnej zatwierdzonej metody, a następnie w rękawiczkach umieść je na podkładce chłonnej. Umieść kciuk i palec wskazujący wokół oka i delikatnie popchnij skórę, aby wybrzuszyć gałkę oczną.

Gdy gałka oczna jest wysunięta, wsuń końcówkę kątowych nożyczek między skórę a gałkę oczną i ostrożnie przetnij tkankę wokół oka, aż zostanie zwolniona. Następnie na krótko zanurz izolowane oko w 70% etanolu i zanurz je w PBS na szalce Petriego. Po pobraniu obu oczu od każdej z myszy przystąp do sekcji.

Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń większość tkanki łącznej z okolic oka. Na tym etapie nie jest konieczne, aby oko było zanurzone. W tym celu użyj kleszczy do szycia, aby podnieść tkankę łączną z gałki ocznej i wyciąć je za pomocą nożyczek Vannas.

Nie przecinaj twardówki, ponieważ praktycznie niemożliwe jest uzyskanie nienaruszonych tylnych muszli ocznych, jeśli twardówka zostanie przecięta. Po oczyszczeniu tkanki łącznej zanurz gałki oczne w PBS i przełącz się na pracę w komorze laminarnej w sterylnych warunkach. Teraz użyj kleszczy, aby przenieść oczy do naczynia z ciepłym DMEM zawierającym wysokie stężenie glukozy.

Po 20 do 30 sekundach wymień roztwór myjący za pomocą aspiracji do drugiego prania. Przenieś gałki oczne do ogrzanego roztworu roboczego 2% Dispazy II w probówkach o pojemności 15 ml i pozwól oczom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut w celu dysocjacji. Po inkubacji gałki oczne powinny być miękkie.

Następnie umyj oczy dwa razy w tym samym naczyniu z podgrzanym podłożem. Po drugim umyciu zastąp pożywkę wzrostową świeżą pożywką i przenieś gałki oczne i pożywkę do nowego naczynia, aby kontynuować sekcję. Kontynuuj pracę na czystej ławce za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

Rozpocznij sekcję od zabezpieczenia oka kleszczami i wykonaj nacięcie wokół ora serrata za pomocą nożyczek Vannas. Trzymając gałkę oczną w roztworze, ostrożnie usuń przednią rogówkę, przedłużając nacięcie wokół obwodu ora serrata. Po zakończeniu cięcia oderwij przednią rogówkę.

Następnie wyjmij torebkę soczewki i związany z nią nabłonek barwnikowy tęczówki, delikatnie wyciągając go z muszli ocznej za pomocą kleszczyków zębatych. Następnie powtórz sekcję na pozostałych oczach i inkubuj tylne muszle oczne w pożywce wzrostowej przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić oddzielenie siatkówki nerwowej od RPE. Po 20 minutach pokrój tylne muszle oczne na cztery płatki.

Wykonaj nacięcia na tyle długie, aby spłaszczyć muszlę oczną, ale wystarczająco krótkie, aby płatki były połączone. Następnie spłaszcz muszlę oczną, aby usunąć siatkówkę nerwową. Zabezpiecz pozostały kompleks twardówki naczyniówki RPE ręką niedominującą i bardzo delikatnie odciągnij siatkówkę od krawędzi.

Po usunięciu siatkówki nerwowej przenieś poćwiartowany kompleks twardówki naczyniówki RPE do nowego sterylnego naczynia hodowlanego wypełnionego ciepłym podłożem wzrostowym. Na szalce Petriego zabezpiecz jeden płatek poćwiartowanego kompleksu twardówki naczyniówkowej RPE za pomocą bardzo cienkich kleszczyków i za pomocą mikrochirurgicznego noża w kształcie półksiężyca delikatnie oderwij nienaruszone arkusze RPE od leżącej poniżej błony podstawnej. Brązowawy RPE powinien być wyraźnie odróżnialny od ciemnej, lepkiej, puszystej naczyniówki.

Następnie zwilż końcówkę mikropipety p200 pożywką wzrostową i użyj końcówki do przeniesienia arkuszy RPE do nowego naczynia zawierającego podgrzane podłoże wzrostowe. Teraz umyj arkusze RPE trzy razy w podgrzanym podłożu wzrostowym. Po każdym etapie prania ostrożnie zbieraj prześcieradła RPE, unikając innych tkanek, takich jak zanieczyszczenia z siatkówki lub naczyniówki.

Po ostatnim praniu przenieś arkusze RPE do probówki o pojemności 1,5 ml i pozwól im osadzać się grawitacyjnie. Następnie w komorze z przepływem laminarnym usuń dodatkową pożywkę wzrostową i ponownie zawieś komórki w świeżo przygotowanym ciepłym pożywce wzrostowej. Teraz delikatnie rozetrzeć tkankę za pomocą mikropipety p200 bez tworzenia pęcherzyków.

Rozcieraj od 40 do 50 razy, tylko tyle, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Bądź ostrożny, ponieważ zbyt duże roztarcie może być śmiertelne. Teraz umieść komórki RPE zebrane od obu myszy w jednej wkładce z membraną poliestrową o pojemności 12 ml w studzience 12-dołkowej płytki hodowlanej.

Pożądana jest wysoka gęstość komórek, aby komórki RPE zachowały swój sześciokątny kształt i pigmentację. Mysia pierwotna hodowla RPE utworzona z dwóch myszy w 12-milimetrowej wkładce z membrany poliestrowej osiągnęła 90 do 95% konfluencji po tygodniu hodowli. Po dwóch tygodniach hodowli komórki były w 100% zlewające się i zaczęły tworzyć mozaikę sześciokątnych komórek barwnikowych i dwujądrowych.

W trzecim tygodniu komórki nadal zmieniały kształt i pigmentację. Jednak po czterech tygodniach część komórek uległa przebarwieniu. Czystość pierwotnej hodowli komórek RPE oceniano przy użyciu przeciwciała RPE65, które znakuje izomerohydrolazę retinoidów, enzym o krytycznym znaczeniu dla cyklu wzrokowego kręgowców.

Integralność komórki z połączeniami komórkowymi i sześciokątny kształt komórki wykazano poprzez barwienie falloidyną. Ścisłe połączenia zwizualizowano poprzez analizę ekspresji białka ZO-1, którą można było zwizualizować za pomocą barwienia aminowego i zwalidować za pomocą western blot. Ogólnie rzecz biorąc, kultury są w stanie się namnażać, zachowywać pigmentację i sześciokątny kształt, tworząc ścisłe połączenia i wyrażając funkcjonalne markery, takie jak RPE65.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki RPE z oczu myszy i prawidłowo je hodować in vitro. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze mieć mokre oczy i starać się działać tak szybko, jak to możliwe.