Name: Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu myszy. Protokół zachowuje oryginalne właściwości komórek RPE i umożliwia uzyskanie niezbędnych umiejętności mikrochirurgicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez The BrightFocus Foundation (do DS).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Pittsburghu
1. Przygotuj rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową, uzupełniając Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), wysoki poziom glukozy z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 2,5 mM L-glutaminy i 1x MEM aminokwasy endogenne. Przed użyciem podgrzej pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 2% (wag./obj.) roztwór roboczy dispazy II:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 100 mg/ml dypazy II, rozpuszczając 30 mg dypazy II w 300 μl soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (50 mM HEPES/KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Ta objętość jest przeznaczona dla 3-4 myszy, można ją skalować w górę lub w dół w zależności od liczby myszy w eksperymencie). Zapas ten może być przechowywany przez co najmniej 1 tydzień w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy 2% dypazy, dodając 300 μl 100 mg/ml bulionu dispazy II do 1,2 ml sterylnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy i filtrując roztwór przez filtr 0,22 μm. Ten krok należy wykonać w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. Przed użyciem podgrzej przygotowaną dyspazę II w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uzyskanie oczu myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji dowolną zatwierdzoną metodą i umieść ją na podkładce chłonnej.</li>
	<li>Zakładając rękawiczki, połóż kciuk i palec wskazujący wokół oka i delikatnie dociśnij skórę, aby wyprostować gałkę oczną.</li>
	<li>Włóż końcówkę skośnych nożyczek między skórę a gałkę oczną i ostrożnie wytnij oko. Aby uniknąć zanieczyszczenia, zanurz na krótko oko w 70% etanolu.</li>
	<li>Natychmiast umieścić oko w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) na szalce Petriego.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2 - 2.4, aby usunąć drugie oko.</li>
</ol>
3. Sekcja oka
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń tkankę łączną z oka pod mikroskopem preparacyjnym. Można to zrobić zarówno w PBS, jak i na suchej szalce Petriego.
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy do szycia, aby podnieść tkanki łączne z gałki ocznej i wyciąć je za pomocą nożyczek Vannas. Nie przecinaj twardówki, ponieważ praktycznie niemożliwe jest uzyskanie nienaruszonych tylnych muszli ocznych, jeśli twardówka zostanie przecięta.</li>
		<li>Po oczyszczeniu tkanki łącznej pozostaw powstałe gałki oczne w PBS do następnego kroku mycia. 
		UWAGA: Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj oczy dwukrotnie w podgrzanym 37 °C DMEM (wysoka glukoza). Ostrożnie przenieś gałki oczne do wstępnie ogrzanego 37 °C DMEM (o wysokiej zawartości glukozy) za pomocą kleszczy. Odessać pożywkę i przenieść gałki oczne na świeże podłoże w nowym naczyniu.</li>
	<li>Odessać podłoże DMEM (o wysokiej zawartości glukozy) i inkubować oczy w podgrzanym roztworze roboczym 2% (wag./obj.) dyspazy II przez 45 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: We wszystkich poniższych krokach umieść oczy lub muszle oczne w pożywce wzrostowej i manipuluj nimi, co ochroni tkankę i zapewni dobre podłoże do sekcji.</li>
	<li>Usunąć roztwór dypazy II i dwukrotnie przemyć oczy w pożywce wzrostowej, odsysając starą pożywkę i dodając nową, wstępnie ogrzaną pożywkę o temperaturze 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a). 
	UWAGA: Po dysocjacji przez dyspazę II gałki oczne stają się miękkie.</li>
	<li>Przytrzymaj oko kleszczami i wykonaj nacięcie wokół ora serrata każdego oka za pomocą nożyczek Vannas pod mikroskopem preparacyjnym umieszczonym w komorze laminarnej.
	<ol>
		<li>Trzymając gałkę oczną w roztworze, ostrożnie usuń przednią rogówkę, przedłużając nacięcie wokół obwodu ora serrata i odciągając przednią rogówkę po zakończeniu cięcia.</li>
		<li>Wyjmij torebkę soczewki i związany z nią nabłonek barwnikowy tęczówki, delikatnie wyciągając je z muszli ocznej za pomocą kleszczyków zębatych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1b, 1c).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powstałe tylne muszle oczne należy inkubować w pożywce wzrostowej przez 20 minut w temperaturze 37 °C, aby ułatwić oddzielenie siatkówki nerwowej od RPE.</li>
	<li>Pokrój tylne muszle oczne na 4 płatki pod mikroskopem preparacyjnym umieszczonym w komorze z przepływem laminarnym. Nacięcia powinny być wystarczająco długie, aby spłaszczyć muszlę oczną, ale wystarczająco krótkie, aby utrzymać płatki połączone (<silna klasa="xfig">Rysunek 1d).
	<ol>
		<li>Spłaszcz muszlę oczną i usuń siatkówkę nerwową, bardzo delikatnie pociągając ją kleszczami, jednocześnie przytrzymując pozostały kompleks RPE-naczyniówka-twardówka innymi kleszkami (<silna klasa="xfig">Ryc. 1e). Zacznij ciągnąć od krawędzi, a nie od środka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść wszystkie poćwiartowane tkanki do nowego sterylnego naczynia hodowlanego wypełnionego wstępnie podgrzaną pożywką wzrostową o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Izolacja pierwotnych komórek RPE
<ol>
	<li>Trzymając jeden płatek poćwiartowanego kompleksu RPE-naczyniówka-twardówka za pomocą bardzo cienkich kleszczyków, delikatnie oderwij nienaruszone arkusze RPE od leżącej poniżej błony podstawnej (błony Brucha) za pomocą mikrochirurgicznego noża półksiężycowego pod mikroskopem preparacyjnym umieszczonym w komorze laminarnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1f).
	<ol>
		<li>Przenieś arkusze RPE do nowego sterylnego naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę wzrostową za pomocą mikropipety P200. Podczas przenoszenia arkuszy RPE należy zwilżyć końcówki pipet pożywką wzrostową, pipetując kilka razy, aby zapobiec przywieraniu tkanki do wnętrza końcówki. RPE będzie wyraźnie odróżnialny od naczyniówki: RPE wygląda na bardziej brązowawy, podczas gdy naczyniówka jest ciemniejsza i wygląda na lepką i puszystą.</li>
		<li>Alternatywnie, użyj trawienia enzymatycznego i delikatnej dysocjacji bez kleszczy, aby odłączyć RPE od choroid14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj arkusze RPE 2-3 razy przy użyciu wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej o temperaturze 37 °C w sterylnym naczyniu hodowlanym. Po każdym etapie prania ostrożnie zbieraj prześcieradła RPE, unikając innych tkanek, takich jak resztki siatkówki lub naczyniówka. Pod koniec ostatniego prania zbierz arkusze RPE za pomocą mikropipety P200 i umieść je w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby odwirowywania arkuszy RPE: osadzają się one grawitacyjnie w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Usuń dodatkowe podłoże wzrostowe za pomocą mikropipety P200. Ponownie zawiesić komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym pożywce wzrostowej i delikatnie je rozcierać za pomocą mikropipety P200. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Zawiesina jednokomórkowa jest idealna, ale należy również uniknąć zbyt dużego roztarcia, w przeciwnym razie komórki RPE nie są w stanie przetrwać. Zalecamy bardzo delikatne tarcie 40 - 50 razy.</li>
</ol>
5. Hodowla komórek RPE
<ol>
	<li>Umieść komórki na płytce hodowlanej.
	<ol>
		<li>Jeśli dalsze zastosowania komórek RPE wymagają zachowania ich polarności, należy umieścić komórki RPE z 2 myszy w jednej 12-milimetrowej wkładce z membraną poliestrową wstępnie załadowaną na 12-dołkowe płytki hodowlane. Pożądane jest powlekanie komórek o dużej gęstości, ponieważ w takim przypadku komórki RPE są w stanie zachować pierwotne właściwości, takie jak sześciokątny kształt i pigmentacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nie przesuwaj płytki ani nie zmieniaj podłoża przez pierwsze 72 godziny hodowli. Po 3 dniach zastąp stare podłoże świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem. Następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Gdy komórki RPE uzyskają konfluencję, zmniejsz FBS w pożywce wzrostowej do 2%. 
	UWAGA: Komórki można podzielić za pomocą 0,25% trypsyny. Jednak po rozszczepieniu komórki mogą stracić swój sześciokątny kształt i pigmentację w kolejnych pasażach. Nie zalecamy dzielenia komórek, ale jeśli jest to wymagane przez dalsze zastosowania hodowli, należy pamiętać, że komórki pierwotne nie mogą być pasażowane w nieskończoność: wiadomo, że różnicują się po 5-7 pasażach.</li>
</ol>

<ol><li>Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development%3A+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li>
<li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li>
<li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells%3A+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li>
<li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li>
<li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li>
<li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li>
<li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+%28RPESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li>
<li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+culture%3Ba+potential+source+of+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmic+Vis+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li>
<li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li>
<li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1%2F%CE%B2A3%2FA1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li>
<li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin%2C+complex+1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li>
<li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium%3A+Special+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li>
<li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li>
<li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa%2C+the+Usher+syndrome+1B+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+retinal+pigment+epithelium%3A+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li>
<li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li>
</ol>

DS otrzymał dofinansowanie na badania od Bayer HealthCare z Niemiec i F. Hoffmann-La Roche ze Szwajcarii. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych. Praca ta jest wspierana przez Research to Prevent Blindness (nieograniczone granty dla Wilmer Eye Institute i University of Pittsburgh). Prace te są również wspierane przez fundusze startowe dla DS z Ophthalmology, University of Pittsburgh.

Przedstawiony szczegółowy protokół umożliwia wiarygodne ustalenie pierwotnych hodowli RPE myszy, które osiągają konfluencję po 1 tygodniu i prezentują główne cechy RPE, takie jak heksagonalny kształt i pigmentacja po 2 tygodniach. Uzyskane komórki RPE mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań, takich jak metabolizm witaminy A9, fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptora10 i transport jonów11, polaryzacja komórek nabłonkowych<sup class...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to pojedyncza warstwa spolaryzowanych komórek nabłonkowych, która znajduje się pomiędzy siatkówką nerwową a naczyniówką oka. Funkcjonalność komórek RPE i integralność monowarstwy RPE mają kluczowe znaczenie dla widzenia, ponieważ RPE odgrywa ważną rolę w wielu procesach, takich jak utrzymanie zewnętrznej bariery krew-siatkówka, transport wody i jonów między siatkówką a naczyniówką, absorpcja światła, ochrona przed stresem oksydacyjnym, kontrola metabolizmu retinoidów i fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptorów1, 2. Umiejscowienie RPE w tylnej części oka, a także jego funkcja barierowa zapobiegająca przechodzeniu leków podawanych ogólnoustrojowo z krwi do ciała szklistego, utrudniają badanie złożoności funkcji RPE in vivo. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba stworzenia hodowli komórek RPE w celu badania komórek RPE w elastycznym, kontrolowanym środowisku3,4.
Istnieje wiele ustalonych linii komórkowych RPE, które zapewniają łatwy i wygodny sposób pozyskiwania i przechowywania komórek; jednak komórki pasażowane mają pewne wady w porównaniu z komórkami pierwotnymi2,3,4. Po pierwsze, często charakteryzują się zmianami w morfologii komórek. Na przykład, żadna z istniejących linii komórkowych nie została uznana za odpowiednią do wiarygodnego badania właściwości bariery RPE ze względu na utratę fenotypu polaryzacji komórek i częściowy zanik ścisłych połączeń4. Oprócz utraty polaryzacji i prawidłowych połączeń międzykomórkowych, linie komórkowe RPE szybko tracą pigmentację z powodu braku kluczowych enzymów melanogenezy w dorosłym RPE5. Pigmentację można przywrócić, ale nigdy nie przeprowadzono kompleksowej analizy mechanizmu repigmentacji, która obejmowałaby połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej, analizy ekspresji genów i testów chemicznych w celu potwierdzenia obecności melaniny6. Kolejnym ograniczeniem jest to, że linie komórkowe RPE mają wydłużone życie komórek (czasami - nieśmiertelność) i w pewnych warunkach mogą przekształcić się w samoodnawiające się multipotencjalne komórki macierzyste, które odrywają się od podłoża i tworzą pływające kolonie7,8. To ograniczenie uniemożliwia wykorzystanie linii komórkowych do eksperymentów transplantacyjnych3.
Biorąc pod uwagę wady ustalonych linii komórkowych RPE, pierwotne hodowle komórek RPE uzyskane z świeżych tkanek mogą służyć jako bardziej biologicznie istotny model do badania RPE. Pierwotne komórki RPE zostały wykorzystane nie tylko do badania funkcji specyficznych dla RPE, takich jak metabolizm witaminy A9, fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptora10 i transport jonów11, ale także do badania podstawowej biologii komórki, takiej jak polaryzacja komórek nabłonkowych2 , homeostaza lizosomalna i autofagia12,13.
W ciągu ostatnich kilku lat pojawiło się wiele publikacji na temat tworzenia pierwotnych kultur RPE, co wskazuje na rosnące zainteresowanie tym obszarem badań3,14,15. Opublikowano liczne protokoły dla ludzkich komórek RPE i komórek RPE innych niż ludzkie, takich jak komórki RPE bydła i świń16,17,18,19. Jednak obsługa mysich komórek RPE jest trudniejsza ze względu na ich znacznie mniejszy rozmiar. Mimo, że wiele publikacji opisało protokoły izolacji komórek RPE od mouse14,20,21, wciąż jest wielu badaczy, którzy mają trudności z izolacją komórek RPE bez zanieczyszczenia komórek naczyniówki lub komórek z resztek siatkówki nerwowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustalania pierwotnej hodowli komórek RPE u myszy, w tym pobieranie oczu od myszy, preparację oczu i izolację arkuszy RPE w celu uzyskania komórek do hodowli. Ten protokół wideo byłby szczególnie przydatny dla badaczy, którzy rozpoczynają pracę z pierwotnymi hodowlami myszy RPE i potrzebują wskazówek dotyczących technik sekcji.

<table><tbody><tr><td><silne>zwierzęta</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-tygodniowe myszy</td><td></td><td></td><td></td> typu dzikiego</tr><tr><td><silne>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM), wysoki poziom glukozy</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało RPE65</td><td>Prezent od dr Michaela Redmonda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Phalloidyna&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza (H+L), Mąka Alexa 568&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Przeciwciało poliklonalne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Katalog Numer</silny></td><td><silny>Komentarze</td></tr><tr><td><silny>instrumenty i urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komora laminarna</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny (mikroskop stereoskopowy z zoomem)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>inkubator CO2 ze sterylizacją gorącym powietrzem</td><td>Spoiwo</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm wkładki z membraną poliestrową wstępnie załadowane w 12-dołkowe płytki hodowlane, wielkość porów: 0,4 i mikro; m, Sterylne</td> nożyczki do tenotomii <td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott, ostrza std, ostre</td><td>narzędzia STEPHENS</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do szycia Castroviejo 0,12 mm</td><td>Instrumenty okulistyczne Stroz</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Nóż prosty Crescent</td><td>Pęseta Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5, 11 cm, prosta, końcówki 0,1x0,06 mm, Dumostar</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas, 8 cm, 45& Kąt, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m</td> Strzykawka <td>do SLGL0250S</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop laboratoryjny&nbsp; Leica DM IL LED&</td><td>nbsp; Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier i niefiltrowane końcówki do pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wysoce spolaryzowany, wielofunkcyjny nabłonek, który znajduje się pomiędzy siatkówką nerwową a naczyniówką oka. Jest to pojedynczy arkusz pigmentowanych komórek, które są sześciokątnie upakowane i połączone ścisłymi połączeniami. Do głównych funkcji RPE należą: absorpcja światła, fagocytoza zewnętrznych segmentów fotoreceptorów zrzucanych, buforowanie przestrzenne jonów, transport składników odżywczych, jonów i wody, a także aktywny udział w cyklu widzenia. Przy tak ważnych i różnorodnych funkcjach niezwykle ważne jest badanie biologii komórek RPE. Ustalono szereg linii komórkowych RPE; jednak wiadomo, że pasażowane i unieśmiertelnione komórki szybko tracą niektóre cechy morfologiczne i fizjologiczne naturalnych komórek RPE. W związku z tym komórki pierwotne są bardziej odpowiednie do badania różnych aspektów biologii i funkcji komórek RPE. Hodowla pierwotnych komórek RPE myszy jest bardzo przydatna dla badaczy, ponieważ modele mysie są szeroko stosowane w badaniach biologicznych, jednak pobieranie komórek RPE od myszy jest również bardzo trudne ze względu na ich niewielki rozmiar. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych hodowli komórek RPE u myszy, który obejmuje enukleację i sekcję oczu oraz izolację arkuszy RPE w celu uzyskania komórek do hodowli. Ta metoda umożliwia wydajną regenerację komórek. Komórki RPE uzyskane od dwóch myszy mogą osiągnąć konfluencję na jednej 12-milimetrowej wkładce z membrany poliestrowej wstępnie załadowanej na płytkę hodowlaną po tygodniu hodowli i wykazywać niektóre z pierwotnych właściwości komórek RPE w dobrej wierze, takie jak sześciokątny kształt i pigmentacja po dwóch tygodniach hodowli.

Pierwotna hodowla RPE myszy, utworzona z 2 myszy w insertach z membrany poliestrowej o średnicy 12 mm, osiąga 90–95% konfluencji po 1 tygodniu hodowli. Po 2 tygodniach hodowli komórki osiągnęły 10% konfluencji i zaczęły tworzyć mozaikę sześciokątnych, pigmentowanych i dwojądrowych komórek. Po 3 tygodniach hodowli komórki nadal kształtowały swój formę i pigmentację, jednak po 4 tygodniach część komórek uległa hiperpigmentacji (Rysunek 2).
<p class="jove_co...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie wykonalnego sposobu pozyskiwania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu myszy i hodowania ich in vitro przy zachowaniu ich pierwotnych właściwości. Metoda ta pomoże badaczom RPE w zdobyciu umiejętności preparacji, które są wymagane do ustanowienia hodowli komórek RPE u myszy, oraz w zademonstrowaniu, jak to zrobić w łatwy sposób. Główną zaletą tej procedury jest to, że jest prosta i wykonalna.Jedyne, czego potrzeba, to praktyka, a wizualna demonstracja izolacji RPE i mikroskopia dosłownie pokazuje, jak uzyskać wymagane umiejętności. Aby odizolować gałki oczne myszy, najpierw poddaj je eutanazji przy użyciu dowolnej zatwierdzonej metody, a następnie w rękawiczkach umieść je na podkładce chłonnej. Umieść kciuk i palec wskazujący wokół oka i delikatnie popchnij skórę, aby wybrzuszyć gałkę oczną.Gdy gałka oczna jest wysunięta, wsuń końcówkę kątowych nożyczek między skórę a gałkę oczną i ostrożnie przetnij tkankę wokół oka, aż zostanie zwolniona. Następnie na krótko zanurz izolowane oko w 70% etanolu i zanurz je w PBS na szalce Petriego. Po pobraniu obu oczu od każdej z myszy przystąp do sekcji.Pod mikroskopem preparacyjnym ostro

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Ten protokół opisuje procedurę pozyskiwania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z lokalnie pozyskiwanych oczu świń. Komórki te służą jako wysokiej jakości alternatywa dla komórek macierzystych i nadają się do badań siatkówki in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu myszy. Protokół zachowuje oryginalne właściwości komórek RPE i umożliwia uzyskanie niezbędnych umiejętności mikrochirurgicznych.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów