Name: Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę oceny naprawy błony komórkowej w fibroblastach pacjentów z dystrofią mięśniową przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego. Technika umożliwia ilościową analizę kinetyki resealingu w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberty, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, Instytut Badań nad Zdrowiem Kobiet i Dzieci (WCHRI) oraz Alberta Innovates Health Solutions (AIHS).
Chcielibyśmy podziękować Dr. Stevenowi Lavalowi za dostarczenie nam pełnowymiarowego plazmidu dysferliny. Chcielibyśmy również podziękować dr Katsuya Miyake za porady techniczne.

Ludzkie komórki fibroblastów użyte w tym badaniu zostały użyte za zgodą Komisji Etyki Człowieka Wydziału Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberta.
1. Transfekcja komórek z pełnowymiarowym plazmidem DYSF
<ol>
	<li>Hodowla komórek fibroblastów w kolbie T225 zawierającej 40 ml pożywki wzrostowej - 36 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM), 4 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20 μl penicyliny/streptomycyny (P/S) - w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C. 
	UWAGA: Komórki powinny być hodowane do około 70-80% zbiegu i nie powinny być dopuszczone do całkowitego zlewania się.</li>
	<li>Aby przygotować komórki do wysiewu, przepłucz komórki dwukrotnie 40 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodaj 5 ml 0,05% trypsyny, aby odłączyć komórki. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i inkubować komórki przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Gdy komórki zostaną całkowicie odłączone, dodaj 40 ml pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję trypsyny.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 2 ml komórek w proporcji 1x105 komórek/ml do 35 mm pokrytych kolagenem naczyń ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Następnego dnia komórki powinny być w około 50-60% zlewane.</li>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 2 ml pożywki pozbawionej surowicy (pożywka wzrostowa bez FBS).</li>
	<li>Transfekcja komórek plazmidem dysferlin na całej długości za pomocą lipotransfekcji.
	<ol>
		<li>Przygotować 150 μl pożywki pozbawionej surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na każde naczynie do transfekcji).</li>
		<li>Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do każdej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę pozbawioną surowicy. Inkubuj go co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do osobnej probówki o pojemności 1,5 ml dodać 175 μl pożywki pozbawionej surowicy i 3,5 μg plazmidowego DNA. 
		UWAGA: Pomnóż powyższe ilości dla każdej dodatkowej potrawy, która ma być transfekowana.</li>
		<li>Połączyć 150 μl pożywki zawierającej plazmidowe DNA w probówce ze 150 μl pożywki pozbawionej surowicy i odczynnikiem do transfekcji. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Równomiernie rozprowadzić 300 μl pożywki z plazmidem i odczynnikiem do transfekcji na naczyniu. Inkubować szalki przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką wzrostową zawierającą surowicę i inkubuj ją przez dodatkowe 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do testu zranienia dwufotonowego
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę przez pipetowanie i przepłukać komórki raz 1 ml roztworu Tyrode, a następnie dodać 1 ml świeżego roztworu Tyrode'a zawierającego 1 μl 2,5 mM barwnika FM 4-64. 
	UWAGA: Końcowe stężenie barwnika FM 4-64 wynosi 2,5 μM.</li>
	<li>Jeśli pożądana jest ocena naprawy błony w środowisku zubożonym w wapń, przepłucz komórki 1 ml PBS, a następnie dodaj 1 ml PBS zawierającego 1 mM EGTA. 
	UWAGA: Ponieważ PBS spowoduje z czasem oderwanie się komórek, test zranienia powinien zostać zakończony tak szybko, jak to możliwe.</li>
</ol>
3. Dwufotonowy test laserowego ranienia
<ol>
	<li>Korzystając z odwróconego mikroskopu konfokalnego i powiązanego oprogramowania, utwórz cel o wymiarach 0,2 μm x 2 μm i umieść go na krawędzi błony komórkowej tak, aby linia docelowa zachodziła na siebie i leżała prostopadle do kierunku błony komórkowej (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2) .</li>
	<li>Użyj lasera HeNe o długości fali 543 nm, aby wzbudzić sygnał barwnika FM i ustaw zakres wykrywania na 600-760 nm. Użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm, aby wzbudzić sygnał GFP (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) i ustaw zakres wykrywania na 500-550 nm.
	<ol>
		<li>Utwórz 5-minutową serię czasową sekwencyjnych skanów obrazu, obrazując komórki co 5 sekund.</li>
		<li>Aby wygenerować uszkodzenie błony, wybielaj komórki za pomocą lasera dwufotonowego ustawionego na 820 nm, używając 15% mocy lasera z 10 iteracjami i wybielaj komórki 25 s po rozpoczęciu szeregu czasowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić ilościowo fluorescencję barwnika FM 4-64, użyj oprogramowania, aby narysować obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 6 μm x 6 μm i umieść go w sąsiedztwie miejsca zranienia i w komórce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Unikaj próbkowania obszarów przesycenia pikseli, korzystając z funkcji "Wskaźnik zasięgu" w oprogramowaniu - w tej aplikacji czerwone piksele reprezentują przesycone piksele. Eksportuj surowe wartości fluorescencji do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego w celu analizy statystycznej.</li>
	<li>Oblicz względne wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego, odejmując wartość tła (średnia wartość fluorescencji punktów czasowych przed uszkodzeniem błony) i dzieląc wzrost netto przez wartość fluorescencji przy t = 0 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, 6).</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li>
<li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li>
<li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi%2Fbeige+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li>
<li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos%3A+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li>
<li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
<li>Lee, J., Yokota, T. Ch 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Translational+Research+in+Muscular+Dystrophy%22">Translational Research in Muscular Dystrophy</a>. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).</li>
<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dwufotonowe laserowe ranienie błony komórkowej jest precyzyjną i wszechstronną techniką oceny dynamiki ponownego uszczelniania błony in vitro. W tym artykule opisaliśmy protokół określania zdolności do ponownego uszczelniania błony komórkowej w komórkach pacjentów z dysferlinopatią za pomocą dwufotonowego testu ranienia laserowego. Nasze wyniki pokazują, że komórki pacjentów z dysferlinopatią są wadliwe w ponownym uszczelnianiu błony komórkowej, co jest zgodne z ustaleniami innych badaczy i co dodatkowo podkreśl...

Błona komórkowa komórek eukariotycznych składa się z podwójnej warstwy naszpikowanych białkami fosfolipidów, które definiują wewnątrz/zewnątrzkomórkowe środowisko komórki i są niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej i przetrwania komórki. Uszkodzenia błony komórkowej wynikające z urazów mechanicznych lub chemicznych są powszechne w różnych typach komórek ssaków, w tym w komórkach mięśni szkieletowych i sercowych, żołądka i płuc1,2,3,4. Oprócz urazów wynikających z codziennych funkcji fizjologicznych, błony komórkowe mogą być również uszkodzone przez zniewagi środowiskowe, toksyny bakteryjne i reperfuzję niedokrwienną5. Brak ponownego uszczelnienia pęknięć w błonie komórkowej prowadzi do nieuregulowanego napływu zewnątrzkomórkowego Ca2+- wraz z innymi potencjalnie toksycznymi składnikami zewnątrzkomórkowymi - do komórki, wywołując kaskady sygnałów w dół, które mogą szybko doprowadzić do śmierci komórki1,4,5,6.
Do tej pory zaproponowano kilka modeli naprawy błon komórkowych. W zależności od wielkości i charakteru pęknięcia membrany mogą zostać aktywowane różne mechanizmy naprawcze. Na przykład sugeruje się, że błony komórkowe mogą wykorzystywać przepływ boczny lub zatykanie białek do naprawy małych zakłóceń (<1 nm). Model fuzji bocznej sugeruje, że pęknięcia błony są szybko naprawiane poprzez boczną rekrutację błony zawierającej dysferlinę7, podczas gdy model zatykania białek sugeruje, że małe perforacje są naprawiane przez agregacje białek (głównie aneksyny)8. I odwrotnie, większe zmiany błonowe wywołują zależną od Ca2+ fuzję pęcherzyków za pośrednictwem dysferliny i tworzenie łaty naprawczej. W modelu łaty naprawczej szybki napływ Ca2+ do komórki wyzwala rekrutację wielu białek (dysferliny, aneksyn, mitsuguminy-53 i białek EDH), które tworzą kompleks lub "łatkę", wraz z fuzją wewnątrzkomórkowych pęcherzyków lub lizosomów w miejscu uszkodzenia błony4,9,10,11,12. Ważne jest, aby pamiętać, że modele te niekoniecznie wzajemnie się wykluczają i mogą współpracować w celu ułatwienia naprawy membrany. Brak prawidłowego uszczelnienia błony komórkowej jest związany z wieloma stanami chorobowymi, w tym dystrofią mięśniową (dysferlinopatia - w tym miopatia Miyoshiego, dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa typu IIB i miopatia dystalna z początkiem przedniej kości piszczelowej)13, kardiomiopatia14 i zespół Chediaka-Higashiego (CHS)15.
Biorąc pod uwagę, że prawidłowa integralność błony komórkowej i ponowne uszczelnienie odgrywa tak ważną rolę w zdrowiu i chorobie, głębsze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw naprawy błony komórkowej byłoby korzystne w poszukiwaniu nowych strategii terapeutycznych. Dlatego konieczne jest posiadanie odpowiednich technik eksperymentalnych w celu monitorowania kinetyki i oceny zdolności naprawy błony komórkowej. Opracowano kilka metod modelowania naprawy błon in vitro. Jedna ze strategii obejmuje uraz mechaniczny, który można ułatwić poprzez skrobanie komórek za pomocą pipety/ostrza chirurgicznego/maszynki do golenia lub poprzez toczenie szklanych koralików po komórkach16. Jednak ten rodzaj urazu mechanicznego generuje większe zmiany i powoduje duże zróżnicowanie uszkodzeń komórek, zarówno w obrębie hodowli, jak i między nimi.
Inną metodą generowania ran błonowych jest ablacja laserowa za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W przeciwieństwie do tradycyjnej laserowej mikroskopii konfokalnej, która wykorzystuje wzbudzenie pojedynczych fotonów, laser dwufotonowy jednocześnie wykorzystuje dwa długofalowe, niskoenergetyczne fotony, aby ułatwić wzbudzenie wysokoenergetycznego elektronu 17. Ten nieliniowy proces powoduje wzbudzenie wyłącznie w płaszczyźnie ogniskowej, a nie wzdłuż całej ścieżki światła17 (rysunek 1). Ta zmniejszona objętość wzbudzenia pomaga zminimalizować fotouszkodzenia podczas obrazowania żywych komórek18,19. Naukowcy są zatem w stanie generować precyzyjne zmiany w błonie komórkowej i monitorować ponowne uszczelnianie błony w czasie rzeczywistym, stosując barwniki fluorescencyjne i obserwując zmiany intensywności fluorescencji w miarę pękania, a następnie ponownego uszczelniania błony komórkowej.
To podejście było wielokrotnie wykorzystywane do badania uszkodzeń błon komórkowych in vitro i in vivo oraz w wielu typach komórek20,21. Na przykład defekty naprawy błon w fibroblastach i miotubkach pochodzących od pacjentów z dysferlinopatią oceniano za pomocą tej techniki22,23. Również pojedyncze włókna mięśniowe wyizolowane od myszy zostały wykorzystane do monitorowania tworzenia łat naprawczych13,24,25. Ruch fluorescencyjnie znakowanych białek można również zaobserwować podczas naprawy błony w pojedynczych włóknach mięśniowych9. Co więcej, proces naprawy sarkolemmalnej po dwufotonowym zranieniu laserowym w zarodkach danio pręgowanego można obserwować w czasie rzeczywistym in vivo26.
W tym artykule przedstawiamy metodologię oceny dynamiki naprawy błony komórkowej w fibroblastach za pomocą dwufotonowego ranienia laserowego, chociaż ta metodologia może być stosowana do różnych typów komórek w celu ilościowego określenia zdolności do ponownego uszczelniania błony plazmatycznej in vitro. W tej metodzie komórki są inkubowane z FM4-64, lipofilowym, nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem, który szybko fluoryzuje, wiążąc się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami w cytoplazmie po wejściu do komórki przez uszkodzenie błony (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2&3). Kwantyfikacja fluorescencji barwnika przylegającego do zmiany błony pozwala na monitorowanie czasu potrzebnego do ponownego uszczelnienia błony komórkowej. Aby zilustrować użyteczność tej metody, używamy fibroblastów pacjentów z dysferlinopatią transfekowanych plazmidami dysferliny o pełnej długości (DYSF) sprzężonymi z GFP, aby ocenić ratunek naprawy błony komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm naczynia ze szklanym dnem pokryte kolagenem</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża pozbawione surowicy</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Roztwór soli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kameleon Laser dwufotonowy</td><td>Koherentny</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Liczne patofizjologiczne uszkodzenia mogą powodować uszkodzenia błon komórkowych, a w połączeniu z wrodzonymi defektami w naprawie lub integralności błon komórkowych, mogą prowadzić do choroby. Zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z naprawą błon komórkowych jest zatem ważnym celem dla opracowania nowych strategii terapeutycznych w chorobach związanych z dysfunkcyjną dynamiką błon komórkowych. Wiele badań in vitro i in vivo mających na celu zrozumienie ponownego uszczelniania błon komórkowych w różnych kontekstach chorobowych wykorzystuje dwufotonową ablację laserową jako standard do określania funkcjonalnych wyników po eksperymentalnym leczeniu. W tym teście błony komórkowe są poddawane zranieniu laserem dwufotonowym, co powoduje pęknięcie błony komórkowej i infiltrację komórki przez barwnik fluorescencyjny. Intensywność fluorescencji w komórce można następnie monitorować w celu ilościowego określenia zdolności komórki do ponownego uszczelnienia. Istnieje kilka alternatywnych metod oceny odpowiedzi błony komórkowej na uszkodzenie, a także duże różnice w samym podejściu do ranienia laserem dwufotonowym, dlatego pojedynczy, ujednolicony model zraniania komórek korzystnie posłużyłby do zmniejszenia różnic między tymi metodologiami. W tym artykule przedstawiamy prosty protokół ranienia laserem dwufotonowym do oceny naprawy błony komórkowej in vitro zarówno u zdrowych, jak i pacjentów z dysferlinopatią komórek fibroblastów transfekowanych z plazmidem dysferliny o pełnej długości lub bez niego.

Zdrowe ludzkie fibroblasty, nieleczone fibroblasty pacjenta z dysferlinopatią oraz fibroblasty pacjenta przetransfekowane plazmidem zawierającym pełną sekwencję dysferliny poddano uszkadzaniu laserem dwufotonowym w celu oceny zdolności do uszczelniania błony w czasie rzeczywistym. Zdrowe ludzkie komórki fibroblastyczne wykazały niski poziom aktywacji fluorescencji FM 4-64 po uszkodzeniu laserowym, natomiast nieleczone fibroblasty pacjenta wykazały wysoki stopień względnej intensywności fl...

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdolności do naprawy błony plazmatycznej w komórkach pacjentów z dystrofią mięśniową. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dystrofii mięśniowej, takie jak związek między daną mutacją a kinetyką ponownego uszczelniania błony. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościową ocenę w czasie rzeczywistym kinetyki ponownego uszczelniania błony w żywych komórkach.Zacznij od hodowli komórek fibroblastów w kolbie T225 zawierającej 40 mililitrów pożywki wzrostowej w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kultura osiągnie 70 do 80% konfluencji, przepłucz komórki dwa razy 40 mililitrami PBS na pranie, a następnie dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję za pomocą 40 mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i wysiewaj dwa mililitry komórek w stężeniu 100 000 komórek na mililitr na 35-milimetrowe płytki ze szklanym dnem pokrytym kolagenem na nocną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Dodaj 150 mikrolitrów świeżej pożywki pozbawionej surowicy do jednej 1,5-mililitrowej probówki na kulturę transfekcyjną. Następnie dodaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do każdej probówki i inkubuj probówki przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji probówek dodaj 175 mikrolitrów pożywki pochodzącej z surowicy i 3,5 mikrograma plazmidowego DNA dysferliny do dodatkowej 1,5-mililitrowej probówki na płytkę.Następnie połącz 150 mikrolitrów roztworu plazmidowego DNA ze 150 mikrolitrami odczynnika do transfekcji w jednej nowej probówce na płytkę na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnego ranka zastąp pożywkę wzrostową dwoma mililitrami pożywki pochodzącej z surowicy. Pod koniec inkubacji równomiernie rozprowadź całe 300 mikrolitrów roztworu plazmidu na każdej płytce i inkubuj płytki przez 24 godziny w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia zastąp supernatant plazmidowy świeżą pożywką wzrostową i umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny. Aby przygotować komórki do testu zranienia dwufotonowego, przepłucz transfekowane kultury jeden raz jednym mililitrem roztworu Tyrode'a. Następnie dodaj do komórek jeden mililitr świeżego roztworu Tyrode'a uzupełnionego jednym mikrolitrem 2,5-milimolowego barwnika FM4-64.Następnie, za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego, utwórz cel o wymiarach 0,2 na dwa mikrony w oprogramowaniu mikroskopu i umieść cel na krawędzi błony komórkowej tak, aby linia docelowa zachodziła na siebie i leżała prostopadle do błony komórkowej. Wybierz 543-nanometrowy helowy laser neonowy do wzbudzenia sygnału barwnika FM oraz 488-nanometrowy laser argonowy do wzbudzenia sygnału GFP i ustaw zakres wykrywania odpowiednio na 600 do 760 nanometrów i 500 do 550 nanometrów. Następnie utwórz pięciominutową serię czasową sekwencyjnych skanów obrazów.Aby wygenerować uszkodzenie błony, użyj lasera dwufotonowego do 820 nanometrów przy 15% mocy lasera z 10 iteracjami, aby wybielić komórki 25 sekund po rozpoczęciu szeregu czasowego. Aby określić ilościowo fluorescencję barwnika FM4-64, użyj oprogramowania, aby narysować obszar zainteresowania o wymiarach sześć na sześć mikronów i umieść obszar zainteresowania w sąsiedztwie miejsca zranienia w komórce. Następnie odejmij wartość tła i podziel wzrost netto przez wartość fluorescencji w czasie zero, aby obliczyć względne wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego.Zdrowe ludzkie komórki fibroblastów wykazują niski poziom aktywacji fluorescencji FM4-64 po zranieniu laserowym, podczas gdy nieleczone fibroblasty pacjentów wykazują wysoki stopień względnej intensywności fluorescencji po urazie. Komórki pacjenta, które zostały transfekowane plazmidem dysferliny o pełnej długości, wykazują zmniejszoną względną intensywność fluorescencji FM4-64 w porównaniu z grupą kontrolną nieleczoną, ale podobną do wartości fluorescencji obserwowanych u zdrowych osób z grupy kontrolnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że komórki będą powoli umierać w roztworze buforowym, więc pracuj szybko i zmieniaj komórki na świeże w regularnych odstępach czasu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zregenerować zmiany w błonie za pomocą mikroskopu dwufotonowego i jak określić ilościowo ponowne uszczelnienie błony w czasie rzeczywistym.

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.

Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Inaktywacja laserowa wspomagana chromeforem za pośrednictwemAlPcS 2a jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennych uszkodzeń pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (IV) w żywych komórkach.

Fotodynamiczne podejście do badania funkcji pękania pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Poznaj metodę oceny naprawy błony komórkowej w fibroblastach pacjentów z dystrofią mięśniową przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego. Technika umożliwia ilościową analizę kinetyki resealingu w żywych komórkach.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Przeglądaj więcej filmów