Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego
2 stycznia 2018
Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdolności do naprawy błony plazmatycznej w komórkach pacjentów z dystrofią mięśniową. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dystrofii mięśniowej, takie jak związek między daną mutacją a kinetyką ponownego uszczelniania błony. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościową ocenę w czasie rzeczywistym kinetyki ponownego uszczelniania błony w żywych komórkach.
Zacznij od hodowli komórek fibroblastów w kolbie T225 zawierającej 40 mililitrów pożywki wzrostowej w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kultura osiągnie 70 do 80% konfluencji, przepłucz komórki dwa razy 40 mililitrami PBS na pranie, a następnie dodaj pięć mililitrów 0,05% trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję za pomocą 40 mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i wysiewaj dwa mililitry komórek w stężeniu 100 000 komórek na mililitr na 35-milimetrowe płytki ze szklanym dnem pokrytym kolagenem na nocną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Dodaj 150 mikrolitrów świeżej pożywki pozbawionej surowicy do jednej 1,5-mililitrowej probówki na kulturę transfekcyjną. Następnie dodaj trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji do każdej probówki i inkubuj probówki przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji probówek dodaj 175 mikrolitrów pożywki pochodzącej z surowicy i 3,5 mikrograma plazmidowego DNA dysferliny do dodatkowej 1,5-mililitrowej probówki na płytkę.
Następnie połącz 150 mikrolitrów roztworu plazmidowego DNA ze 150 mikrolitrami odczynnika do transfekcji w jednej nowej probówce na płytkę na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnego ranka zastąp pożywkę wzrostową dwoma mililitrami pożywki pochodzącej z surowicy. Pod koniec inkubacji równomiernie rozprowadź całe 300 mikrolitrów roztworu plazmidu na każdej płytce i inkubuj płytki przez 24 godziny w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia zastąp supernatant plazmidowy świeżą pożywką wzrostową i umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny. Aby przygotować komórki do testu zranienia dwufotonowego, przepłucz transfekowane kultury jeden raz jednym mililitrem roztworu Tyrode'a. Następnie dodaj do komórek jeden mililitr świeżego roztworu Tyrode'a uzupełnionego jednym mikrolitrem 2,5-milimolowego barwnika FM4-64.
Następnie, za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego, utwórz cel o wymiarach 0,2 na dwa mikrony w oprogramowaniu mikroskopu i umieść cel na krawędzi błony komórkowej tak, aby linia docelowa zachodziła na siebie i leżała prostopadle do błony komórkowej. Wybierz 543-nanometrowy helowy laser neonowy do wzbudzenia sygnału barwnika FM oraz 488-nanometrowy laser argonowy do wzbudzenia sygnału GFP i ustaw zakres wykrywania odpowiednio na 600 do 760 nanometrów i 500 do 550 nanometrów. Następnie utwórz pięciominutową serię czasową sekwencyjnych skanów obrazów.
Aby wygenerować uszkodzenie błony, użyj lasera dwufotonowego do 820 nanometrów przy 15% mocy lasera z 10 iteracjami, aby wybielić komórki 25 sekund po rozpoczęciu szeregu czasowego. Aby określić ilościowo fluorescencję barwnika FM4-64, użyj oprogramowania, aby narysować obszar zainteresowania o wymiarach sześć na sześć mikronów i umieść obszar zainteresowania w sąsiedztwie miejsca zranienia w komórce. Następnie odejmij wartość tła i podziel wzrost netto przez wartość fluorescencji w czasie zero, aby obliczyć względne wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego.
Zdrowe ludzkie komórki fibroblastów wykazują niski poziom aktywacji fluorescencji FM4-64 po zranieniu laserowym, podczas gdy nieleczone fibroblasty pacjentów wykazują wysoki stopień względnej intensywności fluorescencji po urazie. Komórki pacjenta, które zostały transfekowane plazmidem dysferliny o pełnej długości, wykazują zmniejszoną względną intensywność fluorescencji FM4-64 w porównaniu z grupą kontrolną nieleczoną, ale podobną do wartości fluorescencji obserwowanych u zdrowych osób z grupy kontrolnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że komórki będą powoli umierać w roztworze buforowym, więc pracuj szybko i zmieniaj komórki na świeże w regularnych odstępach czasu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zregenerować zmiany w błonie za pomocą mikroskopu dwufotonowego i jak określić ilościowo ponowne uszczelnienie błony w czasie rzeczywistym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół oceny zdolności do uszczelniania błony w komórkach pacjentów z dysferlinopatią z wykorzystaniem ablacji laserowej dwufotonowej. Metoda ta umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym oraz kwantyfikację naprawy błony w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad dystrofią mięśniową
Wprowadzenie
- Naprawa błony jest kluczowa dla przetrwania komórek, szczególnie w przypadku dystrofii mięśniowej.
- Dysferlinopatia jest schorzeniem wpływającym na mechanizmy naprawy błony.
- Ablacja laserowa dwufotonowa jest techniką stosowaną do badania uszczelniania błon.
- Niniejsze badanie koncentruje się na fibroblastach pochodzących od pacjentów z dystrofią mięśniową.
Cel badania
- W celu ilościowego określenia zdolności do naprawy błony plazmatycznej w komórkach pacjentów.
- W celu zbadania zależności między mutacjami a kinetyką uszczelniania błony.
- W celu przedstawienia szczegółowego protokołu obrazowania na żywo procesu uszczelniania błony.
Zastosowane metody
- Hodowlać komórki fibroblastów i przeprowadzić transfekcję plazmidowym DNA dysferliny.
- Użyć lasera dwufotonowego do wywołania uszkodzeń błony.
- Zastosować barwnik FM4-64 w celu wizualizacji naprawy błony.
- Przeanalizować intensywność fluorescencji, aby ilościowo określić kinetykę uszczelniania.
Główne wyniki
- Zdrowe fibroblasty wykazują niską aktywację fluorescencji FM4-64 po zranieniu.
- Nieleczone fibroblasty pacjentów wykazują wysoką intensywność fluorescencji po uszkodzeniu.
- Transfekowane komórki pacjentów wykazują zmniejszoną intensywność fluorescencji, podobną do zdrowych kontroli.
- Metoda ta umożliwia obserwację procesów naprawy błony w czasie rzeczywistym.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczną kwantyfikację uszczelniania błony w komórkach pacjentów.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym dostarcza informacji na temat dynamiki naprawy błony.
- Technika ta może pomóc w zrozumieniu patologii dystrofii mięśniowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test umożliwia ilościowe określenie w czasie rzeczywistym kinetyki uszczelniania błony w żywych komórkach, zapewniając funkcjonalny odczyt służący do walidacji celów w badaniach nad dystrofią mięśniową. Poprzez powiązanie mutacji genetycznych z dynamiką naprawy błony, metoda ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze modeli przedklinicznych. Metoda oferuje zestandaryzowane podejście do oceny interwencji terapeutycznych mających na celu przywrócenie integralności błony w dysferlinopatii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza zależności między mutacjami dysferliny a kinetyką uszczelniania błony w celu walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Dostarczenie ilościowego pomiaru w czasie rzeczywistym do oceny funkcjonalnego odzyskania sprawności w komórkach pochodzących od pacjentów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewania związków poprzez ustalenie podstawowej zdolności do naprawy.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testu poprzez kontrolowane nanoszenie uszkodzeń laserem dwufotonowym i kwantyfikację opartą na fluorescencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na pomiar istotnych dla choroby wyników naprawy błony w fibroblastach pacjentów z dysferlinopatią, co umożliwia dostrojenie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, zapewniając funkcjonalny odczyt ratunku genetycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację wiodących związków, oferując funkcjonalny odczyt, który pozwala na podjęcie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań w oparciu o zdolność do naprawy błony.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie wpływu modyfikacji genetycznych na uszczelnianie błony w żywych komórkach.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy oraz powtarzalne wyniki ilościowe w celu oceny wpływu związków na naprawę błony.
- Analityka: Generuje pomiary intensywności fluorescencji w czasie w celu porównania kinetyki uszczelniania w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów do modelowania odpowiedzi terapeutycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny terapii celowanych w błony w wielu modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie genotypu z funkcjonalnym fenotypem naprawy błony.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym parametrom lasera oraz kwantyfikacji fluorescencji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach naprawy błony.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich zdolności do przywracania kinetyki uszczelniania w komórkach pacjentów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, transfekcji oraz laserowej mikroskopii dwufotonowej.
- Zależność od dostępu do dwufotonowego skaningowego mikroskopu laserowego oraz kompatybilnych systemów detekcji fluorescencji.
- Konieczność standaryzacji parametrów zadawania ran oraz ładowania barwnika pomiędzy laboratoriami w celu zapewnienia spójności wyników między zespołami.
- Kwestie adaptacyjne przy zastosowaniu testu w przypadku różnych typów komórek lub modeli chorób innych niż fibroblasty.
- Ograniczenia praktyczne związane z żywotnością komórek w buforze, co wymaga sprawnego wykonania procedury i regularnego odświeżania komórek.
