Name: Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości z wczesnych zarodków Drosophila melanogaster. Ta metoda pozwala badać wpływ trójwymiarowej architektury chromatyny na ekspresję genów i rozwój.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Towarzystwo Maxa Plancka. C.B.H. było wspierane przez stypendium z Międzynarodowej Szkoły Badawczej Maxa Plancka - Biomedycyna Molekularna. Dziękujemy Shelby Blythe i Ericowi Wieschhausowi za uprzejme dostarczenie linii eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+Domains%2C+Metagenes%2C+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li>
<li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li>
<li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li>
<li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li>
<li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li>
<li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li>
<li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li>
<li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5094/drosophila-melanogaster-embryo-and-larva-harvesting-and-preparation">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , JoVE, Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li>
<li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections%2C+Treatments%2C+and+Incubations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li>
<li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183(2015).</li>
<li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-bench%3A+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li>
<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li>
<li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+systems%22%5BJournal%5D)">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li>
<li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hitchhiker%27s+guide+to+Hi-C+analysis%3A+Practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopDom%3A+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70(2016).</li>
<li>Kruse, K., Hug, C. B., Hernández-Rodríguez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TADtool%3A+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li>
<li>Lévy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), Oxford, England. i386-i392 (2014).</li>
<li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+molecular+biology%3A+AMB%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14(2014).</li>
<li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li>
<li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+systems%22%5BJournal%5D)">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/08/115063">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063(2017).</li>
<li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/31/121889">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889(2017).</li>
<li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li>
<li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li>
<li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+mitotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół jest bardzo skuteczny w generowaniu wysokiej jakości map architektury chromatyny we wczesnych zarodkach Drosophila . W porównaniu z wcześniejszym protokołem34, opisane tutaj podejście wykorzystuje aktualną procedurę Hi-C in situ 5, co skutkuje szybszym przetwarzaniem, wyższą rozdzielczością i mniejszym zużyciem odczynników. Oczekuje się, że cała procedura, w tym protokół Hi-C in situ , będzie działać na wielu etapach i systemach eksperymentalnych poza Drosophila. Ponieważ protokół ma niskie wymagania dotyczące danych wejściowych, może być również stosowany w izolowanych populacjach komórek. U Drosophila, w przypadku stosowania protokołu dla zarodków spoza opisanego tutaj zakresu, niektóre parametry, w szczególności utrwalenie materiału, mogą wymagać dostosowania. Ponieważ u starszych zarodków rozwija się wysoce nieprzepuszczalny naskórek, właściwe może być zwiększenie stężenia formaldehydu i przedłużenie utrwalenia. W przypadku pobierania zarodków na etapach innych niż cykl jądrowy 14, czas inkubacji zarodków w temperaturze 25 °C na etapie 1.4 należy dostosować w następujący sposób: cykl jądrowy 12, 70 min; cykl jądrowy 13, 90 min; 3–4 HPF, 3:30 godz.
Podczas 13 podziałów rozszczepienia (etap 1-4) gęstość jąder z grubsza podwaja się z każdym podziałem. Jądra można łatwo zidentyfikować po ich jasnej fluorescencji GFP. Podczas mitozy eGFP-PCNA nie znajduje się w jądrze, a jego sygnał jest rozpraszany w całym zarodku. Cecha ta umożliwia identyfikację zarodków, które przechodzą synchroniczny podział rozszczepienia. Do badania konformacji chromatyny te mitotyczne zarodki zwykle nie są pożądane, ponieważ mitotyczna organizacja chromatyny jest drastycznie różna niż organizacja interfazowa35. Możliwe jest dostosowanie protokołu do specyficznej selekcji zarodków poddawanych synchronicznemu podziałowi mitotycznemu. W takim przypadku należy zachować tylko zarodki z rozproszoną, niejądrową dystrybucją eGFP-PCNA, a wszystkie inne zarodki należy wyrzucić. Ponieważ nie można określić gęstości jądrowej, należy zastosować alternatywne metody oceny stopnia zarodków na podstawie ich morfologii oglądanej w mikroskopii światła przechodzącego. Obecność komórek biegunowych i jąder na obrzeżach zarodka wskazuje, że zarodek zakończył co najmniej cykl jądrowy 9, podczas gdy widoczna celularyzacja na obrzeżach wskazuje na cykl jądrowy 1412.
Eksperymenty Hi-C mogą być z powodzeniem przeprowadzane przy użyciu szerokiej gamy enzymów restrykcyjnych5. Obecne podejścia zazwyczaj wykorzystują enzymy, które rozpoznają sekwencję 4-zasadową, taką jak MboI, lub miejsce rozpoznawania 6-zasad, takie jak HindIII. Przewagą frezów 4-zasadowych w porównaniu z frezami 6-bazowymi jest to, że oferują one wyższą potencjalną rozdzielczość, biorąc pod uwagę wystarczającą głębokość sekwencjonowania i bardziej równomierne pokrycie miejsc restrykcyjnych w całym genomie. Nie ma wyraźnej przewagi w wyborze jednego noża z 4 podstawami w stosunku do innych 5,23,36,37. Dwa najczęściej stosowane enzymy, MboI i DpnII, rozpoznają to samo miejsce rozpoznawania GATC. DpnII jest mniej wrażliwy na metylację CpG, co nie stanowi problemu u Drosophila. Przedstawiony tutaj protokół można również z powodzeniem zrealizować przy użyciu DpnII jako enzymu restrykcyjnego. W sekcji 4.2. enzym restrykcyjny i bufor muszą być dostosowane do kompatybilności z DpnII, zgodnie z zaleceniami producenta.
Jeśli rozmiar fragmentu biblioteki sekwencjonowania znacznie odbiega od zakresu pokazanego na rysunku 2A, tworzenie klastrów podczas sekwencjonowania może być mniej wydajne lub całkowicie zakończyć się niepowodzeniem. W takim przypadku należy sprawdzić rozkład wielkości po ścinaniu i odpowiednio dostosować parametry ścinania. Piki w rozmieszczeniu fragmentów DNA o bardzo małych (<100 pz) lub bardzo dużych (>1000 pz) rozmiarach wskazują na problemy z doborem wielkości, takie jak przenoszenie kulek lub supernatantu, które powinny zostać odrzucone. Często te biblioteki z małymi pikami w tych niepożądanych rozmiarach, takie jak ta na zdjęciu, są nadal sekwencjonowane z powodzeniem z niewielkim spadkiem wydajności klastrowania.
Należy unikać wysokich wskaźników duplikacji PCR, ponieważ drastycznie zmniejsza to liczbę użytecznych odczytów sekwencji. Częstość duplikatów PCR jest bezpośrednio związana z ilością materiału wejściowego. Użycie większej ilości danych wejściowych zwykle łagodzi zatem problemy z duplikacją PCR.
Większa liczba odczytów przefiltrowanych ze względu na orientację odczytu (ryc. 2B) wskazuje na niewystarczające trawienie, co może być wynikiem użycia zbyt małej ilości enzymu, zbyt dużej ilości materiału wejściowego lub niepełnej homogenizacji zarodków.

Przechwytywanie konformacji chromatyny (3C) okazało się wyjątkowo użyteczną metodą badania topologii chromatyny w jądrze1. Wariant 3C Hi-C pozwala na pomiar częstości kontaktowych wszystkich oddziaływań chromatyny, które zachodzą w jądrze w jednym eksperymencie2. Zastosowanie Hi-C odegrało ważną rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu wielu podstawowych zasad organizacji chromatyny, takich jak TAD, przedziały i pętle3,4,5.
Badania nad architekturą chromatyny w kontekście przemian rozwojowych i różnicowania komórek są coraz częściej wykorzystywane do odkrywania mechanizmów regulacji genów podczas tych procesów6,7,8,9. Jednym z bardzo interesujących organizmów modelowych jest Drosophila melanogaster, którego rozwój i genom są dobrze scharakteryzowane. Przeprowadzono jednak niewiele badań, które badają architekturę chromatyny u Drosophila poza warunkami hodowli tkankowej in vitro10,11. W zarodkach 16–18 godzin po zapłodnieniu zidentyfikowano TAD i kompartmenty przypominające podobne struktury u ssaków10, co rodzi pytanie, jaką rolę odgrywają w regulacji genów podczas rozwoju zarodka Drosophila. Szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju, przed gastrulacją, takie badania są technicznie trudne. Przed gastrulacją zarodki Drosophila przechodzą 13 synchronicznych podziałów jądrowych, które przebiegają w niezwykle szybkim tempie 8–60 minut na cykl12,13. Ponadto brak cech wizualnych pozwalających na rozróżnienie różnych stadiów utrudnia uzyskanie ściśle zaawansowanego materiału zarodkowego w wystarczających ilościach.
W celu opracowania protokołu, który pozwala badać architekturę chromatyny we wczesnym rozwoju Drosophila w rozdzielczości cyklu jądrowego, połączyliśmy dwie istniejące techniki: in situ Hi-C, która pozwala na generowanie map kontaktowych całego genomu w wysokiej rozdzielczości5, oraz ocenę zarodka za pomocą transgenicznej linii Drosophila wyrażającej transgen eGFP-PCNA13,14. Ten transgen lokalizuje się w jądrze podczas interfazy i rozprasza się w syncytialnej blastodermie podczas mitozy. Korzystając z tej właściwości, można łatwo odróżnić różne stadia na podstawie ich gęstości jądrowej i zarodki mitotyczne na podstawie dyspersji sygnału GFP.
Razem, techniki te umożliwiają badanie trójwymiarowej struktury chromatyny w wysokiej rozdzielczości z zaledwie 20 zarodków Drosophila. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące zbierania i sortowania zarodków Drosophila w celu uzyskania populacji zarodków z pojedynczego cyklu podziału jądrowego. Dalej opisano, w jaki sposób uzyskane zarodki są wykorzystywane do wykonywania in situ Hi-C. Efektem końcowym jest biblioteka nukleotydów odpowiednia do sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji. Uzyskane odczyty sekwencjonowania można następnie przetworzyć na szczegółowe mapy interakcji chromatyny obejmujące cały genom Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I Fragment Klenowa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 DNA Ligaza w zestawie</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne inhibitory proteazy wolne od ultra EDTA</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos dla Illumina&nbsp;( Zestaw starterów indeksowych 1)</td> <td>New England Biolabs</td><td>E7335</td><td>Adapter do sekwencjonowania, starter do PCR do przodu (nieindeksowany) i starter do PCR do odwróconego (indeksowany) oraz enzym USER używane w sekcji przygotowania biblioteki są składnikami tego zestawu</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Prep</td> New <td>England Biolabs</td><td>E7645</td><td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix i Polymerase Master Mix używane w sekcji Przygotowanie biblioteki to Składniki tego zestawu</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA System</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Probówki, 1,5 ml</td><td>sitko do komórek Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Kosze do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>37% formaldehydu</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Aparat DFC Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC</td> Mikrotłuczek <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal</td><td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>Służy do lizy zarodków w Krok 4.1.4</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>Koraliki magnetyczne powlekane streptawidyną</td></tr><tr><td>Koraliki Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 3.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA muchy</td><td>Prezent od S. Blythe i E. Wieschaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu 13%</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris pH 8,0 (1 M) dla biologii molekularnej</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS dla biologii molekularnej</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor</td> <td>CutSmartNew England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Bufor enzymatyczny restrykcyjny</td></tr><tr><td>PCR Mieszanka nukleotydów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814362001</td><td>Niezmodyfikowany dCTP, dGTP, dTTP</td></tr><tr><td>BSA, klasa biologii molekularnej</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M roztwór do biologii molekularnej</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu 3 M pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Stojak magnetyczny</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>Mixer</td></tr><tr><td>Małe klatki do pobierania zarodków</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>Klatka do zbierania jaj</td></tr><tr><td>Wirówka 5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Paski probówki PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 Bufor polimerazy DNA</td></tr></tbody></table>

generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków drosophila

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Badanie trójwymiarowej architektury chromatyny dostarcza bezcennych informacji na temat mechanizmów regulacji genów. W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania techniki wychwytywania konformacji chromatyny in situ Hi-C na stadiach zarodków Drosophila melanogaster. Rezultatem jest biblioteka sekwencjonowania, która umożliwia mapowanie wszystkich oddziaływań chromatyny, które zachodzą w jądrze w jednym eksperymencie. Sortowanie zarodków odbywa się ręcznie przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego i transgenicznej linii muchowej zawierającej marker jądrowy. Za pomocą tej techniki można uzyskać populacje zarodków z każdego cyklu podziału jądrowego i o określonym statusie cyklu komórkowego z bardzo wysoką czystością. Protokół może być również dostosowany do sortowania starszych zarodków poza gastrulacją. Posortowane zarodki są wykorzystywane jako dane wejściowe do badania in situ Hi-C. Wszystkie eksperymenty, w tym przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, można ukończyć w ciągu pięciu dni. Protokół ma niskie wymagania dotyczące nakładów i działa niezawodnie przy użyciu 20 zarodków w stadium blastodermy jako materiału wejściowego. Efektem końcowym jest biblioteka sekwencjonowania dla sekwencjonowania nowej generacji. Po sekwencjonowaniu dane można przetworzyć na mapy interakcji chromatyny w całym genomie, które można analizować przy użyciu szerokiej gamy dostępnych narzędzi w celu uzyskania informacji o strukturze domeny topologicznie asocjacyjnej (TAD), pętlach chromatyny i przedziałach chromatyny podczas rozwoju Drosophila.

Posortowane populacje embrionów w cyklach jądrowych 12, 13 i 14 (odpowiednio 1:30, 1:45 i 2:10 godziny po zapłodnieniu12) oraz 3–4 h po zapłodnieniu (hpf) uzyskano zgodnie z procedurami opisanymi w protokole. Dzięki wykonaniu zdjęć sygnału eGFP-PCNA dla każdej posortowanej partii embrionów możliwe jest udokumentowanie dokładnego stadium i stanu cyklu komórkowego każdego pojedynczego embrionu wykorzystanego w dalszych eksperymentach. Przykładowe zdjęcia embrionów z posortowanych populacji przedstawiono na Rysunku 1B-E. Wynikiem protokołu in situ Hi-C jest biblioteka nukleotydowa gotowa do sekwencjonowania na platformach sekwencjonowania następnej generacji. W tym celu zazwyczaj wymagane jest końcowe stężenie biblioteki na poziomie co najmniej 2–4 nM. Stosując zalecane ilości materiału wejściowego, stężenie to jest osiągane w sposób niezawodny (Tabela 1).
Oczekiwany rozkład wielkości fragmentów DNA po selekcji wielkości wynosi od 300–600 bp, z maksimum w okolicach 500 bp (Rycina 2A), w zależności od dokładnych parametrów fragmentacji i selekcji wielkości. Do sekwencjonowania zalecamy odczyty typu paired-end o długości co najmniej 75 bp, aby zminimalizować liczbę nieprzypisywalnych fragmentów restrykcyjnych w genomie. Mapy o wysokiej rozdzielczości z wielkością bin 1–2 kb można uzyskać z 400 milionów odczytów. Zalecamy sekwencjonowanie wielu powtórzeń biologicznych przy niższej głębokości ok. 150 milionów odczytów dla każdego z nich, zamiast sekwencjonowania pojedynczego powtórzenia przy bardzo wysokiej głębokości. Pozwala to na ocenę zmienności biologicznej i prowadzi do mniejszej liczby odrzuconych odczytów z powodu duplikacji PCR. Do reprezentacji wizualnej powtórzenia można połączyć. Przed podjęciem decyzji o sekwencjonowaniu próbki przy wysokiej głębokości, zalecamy przeprowadzenie sekwencjonowania płytkiego (kilka milionów odczytów na próbkę), aby określić podstawowe parametry jakości biblioteki, jak pokazano na Rycina 2B.
Analiza danych Hi-C wymaga znacznych zasobów obliczeniowych oraz wiedzy z zakresu bioinformatyki. W uproszczeniu, odczyty sparowane są niezależnie mapowane do genomu referencyjnego, a otrzymane dopasowania są filtrowane pod kątem jakości i orientacji; następnie z przefiltrowanych dopasowań można wygenerować macierz kontaktów dla określonej rozdzielczości binów lub na poziomie fragmentów. Macierz kontaktów stanowi podstawę wszystkich dalszych analiz w celu badania domen TAD, pętli i przedziałów (compartments). Do wstępnej analizy odczytów sekwencjonowania dostępnych jest kilka potoków bioinformatycznych, które umożliwiają przetwarzanie surowych odczytów w macierze kontaktów bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy bioinformatycznej18,19,20,21,22,23. Sposób przeprowadzenia dalszych analiz zależy w dużej mierze od konkretnego pytania biologicznego i może wymagać znacznego doświadczenia w programowaniu i tworzeniu skryptów w językach R lub Python. Dostępnych jest jednak kilka narzędzi i algorytmów do identyfikacji TAD5,24,25,26,27,28, a także oprogramowanie do analizy i eksploracji danych Hi-C w przeglądarce internetowej oraz jako samodzielne aplikacje desktopowe29,30,31,32.
Po przetworzeniu jakość biblioteki można określić za pomocą różnych parametrów (Rycina 2B). Po pierwsze, wskaźnik duplikacji PCR, czyli liczba zsekwencjonowanych par odczytów pochodzących z tej samej oryginalnej cząsteczki, powinien być jak najniższy, aby ograniczyć ilość zmarnowanych odczytów sekwencji. Niemniej jednak, nawet biblioteki z duplikacją PCR &gt;40% mogą zostać przetworzone na wysokiej jakości mapy kontaktów, pod warunkiem odfiltrowania duplikatów. Po drugie, odsetek odczytów odfiltrowanych ze względu na ich orientację, zgodnie z opisem w4, powinien być konsekwentnie niższy niż 10% dopasowanych par odczytów.
Podczas rozwoju przedgastrulacyjnego Drosophila pomiędzy 12. a 14. cyklem jądrowym architektura jądra ulega drastycznej przebudowie33 (Rysunek 3). W 12. cyklu jądrowym wykrywa się niewiele domen TAD, a ogólny rozkład kontaktów jest bardzo jednorodny, bez wielu wyraźnych cech. Sytuacja ta ulega gwałtownej zmianie w 13. i 14. cyklu jądrowym, kiedy TAD stają się coraz bardziej wyraźne, a niespecyficzne kontakty dalekiego zasięgu ulegają redukcji.
<img alt="Schemat etapów rozwoju zarodka; cykle jądrowe 12-14; faza mitotyczna; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne zdjęcia zarodków eGFP-PCNA podczas sortowania. (A) sygnał eGFP-PCNA z niesortowanej populacji zarodków po 60 min zbierania i 2 h inkubacji w 25 °C (B-E) przykłady zarodków z populacji sortowanych w cyklu jądrowym 12 (B), cyklu jądrowym 13 (C), cyklu jądrowym 14 (D) oraz zarodków przechodzących synchroniczną mitozę (E). Paski skali = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza fragmentów DNA: wykres sygnału fluorescencji oraz wykres słupkowy dopasowania par odczytów dla bibliotek 1 i 2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykłady wskaźników jakości bibliotek Hi-C in situ. (A) Ślady z Bioanalizatora pokazujące rozkład wielkości fragmentów DNA z prawidłowej biblioteki Hi-C (Biblioteka 1, góra) oraz z biblioteki wykazującej szczyt fragmentów zbyt dużych do sekwencjonowania (Biblioteka 2, dół). Biblioteka 2 została pomyślnie zsekwencjonowana, jednak jeszcze większe ilości niepożądanych fragmentów DNA mogą prowadzić do zmniejszenia wydajności sekwencjonowania. (B) Statystyki filtrowania dwóch bibliotek Hi-C: przedstawiono liczbę dopasowanych par odczytów, które zostały wykluczone z dalszej analizy ze względu na orientację i odległość odczytów (do wewnątrz, na zewnątrz)4 lub duplikację PCR (duplicate). Na każdym słupku naniesiono liczbę odczytów, które przeszły przez filtr (remaining) oraz tych, które zostały odrzucone (filtered). Procent odczytów przechodzących przez filtr został dodatkowo wskazany w formie tekstu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapy ciepła prawdopodobieństwa kontaktów chromosomowych; cykle jądrowe 12-14; stadia rozwoju zarodkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Mapy interakcji Hi-C z zarodków na różnych stadiach rozwoju. Mapy interakcji Hi-C zostały podzielone na przedziały o rozdzielczości 10 kb i zbalansowane zgodnie z wcześniejszym opisem33. Przedstawiono region na chromosomie 2L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biblioteka</td>
			<td>Etap</td>
			<td>Liczba embrionów</td>
			<td>Ilość DNA przed fragmentacją (ng)</td>
			<td>Cykle PCR</td>
			<td>Końcowe stężenie biblioteki (nM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>cykl jądrowy 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>cykl jądrowy 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>cykl jądrowy 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>cykl jądrowy 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>cykl jądrowy 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>cykl jądrowy 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>cykl jądrowy 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>cykl jądrowy 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>cykl jądrowy 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>3–4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>3–4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista reprezentatywnych statystyk bibliotek sekwencjonowania. Dla każdej biblioteki na liście wskazano liczbę embrionów wykorzystanych do jej wytworzenia, ilość całkowitego DNA przed wyciąganiem biotynowym i fragmentacją zmierzoną za pomocą Qubit, liczbę cykli PCR użytych do amplifikacji oraz końcowe stężenie biblioteki sekwencjonowania po oczyszczaniu i selekcji wielkości.

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie architektury chromatyny, takie jak to, w jaki sposób struktura 3D chromatyny może wpływać na ekspresję i rozwój genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona widok w wysokiej rozdzielczości architektury chromatyny i precyzyjnie zainscenizowanych zarodków much. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację i rozwój chromatyny, można również wykorzystać istniejące linie z bibliotek muszek transgenicznych do przetestowania ich wpływu na organizację chromatyny.Aby rozpocząć protokół, dostosuj całkowitą objętość wcześniej pobranych zarodków do dwóch mililitrów za pomocą PBST. Dodaj sześć mililitrów heptanu i 100 mikrolitrów 37% formaldehydu do wody. Po dodaniu formaldehydu energicznie potrząsaj rurką w górę iw dół przez minutę.Faza wodna i organiczna połączą się, tworząc konsystencję przypominającą szampon. Mieszaj mieszaninę na mieszalniku obrotowym przez 10 minut. Odwirować probówkę o masie 500 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać zarodki na dnie probówki.Odessać cały płyn przypominający szampon i wyrzucić go, uważając, aby nie zassać żadnych zarodków. 15 minut po dodaniu formaldehydu ponownie zamieszaj zarodki w pięciu mililitrach PBST ze 125-milimolową glicyną. Potrząsaj energicznie zarodkami w górę iw dół przez jedną minutę.Po odwirowaniu odessać supernatant. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś partię 100 zarodków do małego szklanego naczynia odpowiedniego do sortowania, najlepiej na ciemnym tle i umieść ją na lodzie. Sortuj zarodki według gęstości jądrowej i statusu cyklu komórkowego za pomocą końcówki igły lub strzykawki.Usuń wszystkie zarodki mitotyczne rozpoznawalne po ich rozproszonym, niejądrowym rozmieszczeniu EGFP PCNA oraz zarodki, które częściowo wykazują niejądrowy sygnał GFP. Aby ułatwić sortowanie, należy ustawić zarodki referencyjne w cyklach jądrowych 12, 13 i 14 w każdej partii, aby dopasować zarodki do jednego z zarodków referencyjnych. Odpipetować pożądane zarodki za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów.Przełóż je do świeżej probówki i połóż na lodzie. Kontynuuj, aż zostanie posortowana wystarczająca liczba zarodków do planowanego eksperymentu. Krótko zakręć rurki 100 razy g w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant i upewnić się, że zarodki są tak suche, jak to możliwe, aby można je było zamrozić. Błyskawiczne zamrażanie zarodków poprzez zanurzenie probówek w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść probówki z zamrożonymi zarodkami na lodzie.Ponownie zawiesić zarodki w 500 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy. Odczekaj minutę, aby zarodek osiadł na dnie probówki. Następnie zmiel zarodki metalowym mikrotłuczkiem wstępnie schłodzonym na lodzie, który jest zaprojektowany tak, aby ściśle pasował do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.Aby uniknąć potrząsania zarodkami, wkładaj tłuczek powoli, aż dotknie dna probówki. Dociśnij, a następnie zmiel, obracając tłuczek dwukrotnie w obu kierunkach. Podnieś tłuczek bardzo lekko.Ponownie dociśnij do dna probówki i powtórz procedurę mielenia 10 razy lub do momentu, gdy zarodki zostaną całkowicie zlizowane. Roztwór powinien być jednorodny i nie powinny pozostać żadne resztki dużych kawałków zarodków. Inkubować homogenizowaną zawiesinę na lodzie przez 15 minut.Wiruj z prędkością 1 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad, ponownie zawieszając w 500 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy i pipetując w górę iw dół. Po kolejnym wirowaniu wyrzuć supernatant.Ponownie zawiesić umyty granulat w 100 mikrolitrach 0,5% dodecylosiarczanu sodu lub SDS. Następnie przepuszczaj jądra, inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X100 i 120 mikrolitrów wody.Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w bloku grzewczym. Dodaj 25 mikrolitrów 10-krotnego buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 20 jednostek po pięć jednostek na mikrolitr MBO1. Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubować probówkę w bloku grzewczym, aby strawić DNA.Dodaj kolejne 20 jednostek MBO1. Kontynuuj inkubację przez 90 minut. Po drugiej 90-minutowej inkubacji należy inkubować próbkę w temperaturze 62 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby unieaktywnić MBO1.Następnie dodaj 18 mikrolitrów 0,4 milimolowej biotyny 14-dATP, 2,25 mikrolitra niezmodyfikowanej 3,3 milimolowej mieszanki dCTP-dGTP-dTTP i osiem mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitrową polimerazę DNA I fragment Klenowa. Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Następnie dodaj 657 mikrolitrów wody, 120 mikrolitrów bufora ligazy DNA 10X T4, 100 mikrolitrów 10% Triton X100, sześć mikrolitrów 20 miligramów na mililitr albuminy surowicy bydlęcej i na koniec pięć mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4.Następnie delikatnie obracaj rurkę z prędkością 20 obr./min w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Dodaj kolejne pięć mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4. Kontynuuj obracanie przez kolejne dwie godziny, a następnie obracaj jądra z prędkością 2 500 razy g przez pięć minut.Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego i dodać 20 mikrolitrów 20 miligramów na mililitr proteinazy K. Przesuń probówkę i inkubuj probówkę w celu strawienia białka. Dodaj 130 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i inkubuj przez noc w celu usunięcia sieciowania.Następnego dnia odpipetuj próbkę do nowej dwumililitrowej probówki o niskiej charakterystyce wiązania DNA. Dodaj 0,1X objętość trzech molowych octanu sodu i dwa mikrolitry po 15 miligramów na mililitr GlycoBlue. Dodać 1,6 objętości czystego absolutnego etanolu i odwrócić zawartość, a następnie inkubować próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po inkubacji odwirować zawartość. Zlokalizuj osad DNA, który może być zauważony tylko przez GlycoBlue. Ostrożnie usunąć supernatant, przesuwając końcówkę pipety do probówki wzdłuż przeciwnej ścianki od osadu DNA.Umyj granulat 800 mikrolitrami 70% etanolu. Wymieszać próbkę przez odwrócenie i odwirować ją 20 000 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usuń pozostałe kropelki podczas tego etapu i kolejnych prań, wypychając je z tubek za pomocą końcówki P10, a następnie otwórz pokrywę, aby wyschnąć na powietrzu przez maksymalnie pięć minut.Gdy nie pozostanie żaden płyn, dodaj 50 mikrolitrów 10-milimolowego chlorku tris. Kilkakrotnie pipetuj roztwór nad obszarem, w którym znajdowała się osadka, aby rozpuścić DNA. Dodaj jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr RNazy A. Wymieszaj, przesuwając probówkę.Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby strawić RNA. Na koniec przechowuj próbkę w zamrażarce lub lodówce do czasu przygotowania biblioteki. Obrazy sygnału EGFP PCNA każdej posortowanej partii zarodków ujawniają dokładne statusy etapu i cyklu komórkowego każdego pojedynczego zarodka do dalszych eksperymentów.Ślady bioanalizatora pokazują, że rozkład wielkości fragmentów DNA po doborze wielkości wynosi od 300 do 700 par zasad, a maksimum wynosi około 450 par zasad. Mapy oddziaływań Hi-C pokazują, że w 12 cyklu jądrowym wykrywanych jest niewiele topologicznie powiązanych domen (TAD), co zmienia się dramatycznie w cyklach jądrowych 13 i 14, kiedy TAD są coraz bardziej widoczne, a niespecyficzne kontakty dalekiego zasięgu są wyczerpane. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym umyciu koralików i niepotrzebnym przedłużaniu czasu inkubacji, zwłaszcza w wysokich temperaturach, ponieważ może to prowadzić do niskiej jakości bibliotek Hi-C.Ta technika łącząca dokładną ocenę stopnia zaawansowania i mapowanie potwierdzenia chromatyny w wysokiej rozdzielczości utorowała drogę naukowcom z dziedziny epigenetyki do zbadania roli trójwymiarowej organizacji chromatyny w warunkach rozwojowych in vivo.

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

W ostatnim czasie technologia sekwencjonowania wysokoprzepustowego znacznie zwiększyła czułość eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), co przyczyniło się do ich zastosowania z użyciem oczyszczonych komórek lub wyselekcjonowanych tkanek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę wykorzystania techniki ChIP w tkankach Drosophila, która pozwala na badanie endogennego stanu chromatyny w dobrze scharakteryzowanym systemie biologicznym.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

Poznaj protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości z wczesnych zarodków Drosophila melanogaster. Ta metoda pozwala badać wpływ trójwymiarowej architektury chromatyny na ekspresję genów i rozwój.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Przeglądaj więcej filmów