Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie architektury chromatyny, takie jak to, w jaki sposób struktura 3D chromatyny może wpływać na ekspresję i rozwój genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona widok w wysokiej rozdzielczości architektury chromatyny i precyzyjnie zainscenizowanych zarodków much. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację i rozwój chromatyny, można również wykorzystać istniejące linie z bibliotek muszek transgenicznych do przetestowania ich wpływu na organizację chromatyny.

Aby rozpocząć protokół, dostosuj całkowitą objętość wcześniej pobranych zarodków do dwóch mililitrów za pomocą PBST. Dodaj sześć mililitrów heptanu i 100 mikrolitrów 37% formaldehydu do wody. Po dodaniu formaldehydu energicznie potrząsaj rurką w górę iw dół przez minutę.

Faza wodna i organiczna połączą się, tworząc konsystencję przypominającą szampon. Mieszaj mieszaninę na mieszalniku obrotowym przez 10 minut. Odwirować probówkę o masie 500 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać zarodki na dnie probówki.

Odessać cały płyn przypominający szampon i wyrzucić go, uważając, aby nie zassać żadnych zarodków. 15 minut po dodaniu formaldehydu ponownie zamieszaj zarodki w pięciu mililitrach PBST ze 125-milimolową glicyną. Potrząsaj energicznie zarodkami w górę iw dół przez jedną minutę.

Po odwirowaniu odessać supernatant. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś partię 100 zarodków do małego szklanego naczynia odpowiedniego do sortowania, najlepiej na ciemnym tle i umieść ją na lodzie. Sortuj zarodki według gęstości jądrowej i statusu cyklu komórkowego za pomocą końcówki igły lub strzykawki.

Usuń wszystkie zarodki mitotyczne rozpoznawalne po ich rozproszonym, niejądrowym rozmieszczeniu EGFP PCNA oraz zarodki, które częściowo wykazują niejądrowy sygnał GFP. Aby ułatwić sortowanie, należy ustawić zarodki referencyjne w cyklach jądrowych 12, 13 i 14 w każdej partii, aby dopasować zarodki do jednego z zarodków referencyjnych. Odpipetować pożądane zarodki za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów.

Przełóż je do świeżej probówki i połóż na lodzie. Kontynuuj, aż zostanie posortowana wystarczająca liczba zarodków do planowanego eksperymentu. Krótko zakręć rurki 100 razy g w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i upewnić się, że zarodki są tak suche, jak to możliwe, aby można je było zamrozić. Błyskawiczne zamrażanie zarodków poprzez zanurzenie probówek w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść probówki z zamrożonymi zarodkami na lodzie.

Ponownie zawiesić zarodki w 500 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy. Odczekaj minutę, aby zarodek osiadł na dnie probówki. Następnie zmiel zarodki metalowym mikrotłuczkiem wstępnie schłodzonym na lodzie, który jest zaprojektowany tak, aby ściśle pasował do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Aby uniknąć potrząsania zarodkami, wkładaj tłuczek powoli, aż dotknie dna probówki. Dociśnij, a następnie zmiel, obracając tłuczek dwukrotnie w obu kierunkach. Podnieś tłuczek bardzo lekko.

Ponownie dociśnij do dna probówki i powtórz procedurę mielenia 10 razy lub do momentu, gdy zarodki zostaną całkowicie zlizowane. Roztwór powinien być jednorodny i nie powinny pozostać żadne resztki dużych kawałków zarodków. Inkubować homogenizowaną zawiesinę na lodzie przez 15 minut.

Wiruj z prędkością 1 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad, ponownie zawieszając w 500 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy i pipetując w górę iw dół. Po kolejnym wirowaniu wyrzuć supernatant.

Ponownie zawiesić umyty granulat w 100 mikrolitrach 0,5% dodecylosiarczanu sodu lub SDS. Następnie przepuszczaj jądra, inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X100 i 120 mikrolitrów wody.

Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w bloku grzewczym. Dodaj 25 mikrolitrów 10-krotnego buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 20 jednostek po pięć jednostek na mikrolitr MBO1. Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubować probówkę w bloku grzewczym, aby strawić DNA.

Dodaj kolejne 20 jednostek MBO1. Kontynuuj inkubację przez 90 minut. Po drugiej 90-minutowej inkubacji należy inkubować próbkę w temperaturze 62 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby unieaktywnić MBO1.

Następnie dodaj 18 mikrolitrów 0,4 milimolowej biotyny 14-dATP, 2,25 mikrolitra niezmodyfikowanej 3,3 milimolowej mieszanki dCTP-dGTP-dTTP i osiem mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitrową polimerazę DNA I fragment Klenowa. Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Następnie dodaj 657 mikrolitrów wody, 120 mikrolitrów bufora ligazy DNA 10X T4, 100 mikrolitrów 10% Triton X100, sześć mikrolitrów 20 miligramów na mililitr albuminy surowicy bydlęcej i na koniec pięć mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4.

Następnie delikatnie obracaj rurkę z prędkością 20 obr./min w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Dodaj kolejne pięć mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4. Kontynuuj obracanie przez kolejne dwie godziny, a następnie obracaj jądra z prędkością 2 500 razy g przez pięć minut.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego i dodać 20 mikrolitrów 20 miligramów na mililitr proteinazy K. Przesuń probówkę i inkubuj probówkę w celu strawienia białka. Dodaj 130 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i inkubuj przez noc w celu usunięcia sieciowania.

Następnego dnia odpipetuj próbkę do nowej dwumililitrowej probówki o niskiej charakterystyce wiązania DNA. Dodaj 0,1X objętość trzech molowych octanu sodu i dwa mikrolitry po 15 miligramów na mililitr GlycoBlue. Dodać 1,6 objętości czystego absolutnego etanolu i odwrócić zawartość, a następnie inkubować próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji odwirować zawartość. Zlokalizuj osad DNA, który może być zauważony tylko przez GlycoBlue. Ostrożnie usunąć supernatant, przesuwając końcówkę pipety do probówki wzdłuż przeciwnej ścianki od osadu DNA.

Umyj granulat 800 mikrolitrami 70% etanolu. Wymieszać próbkę przez odwrócenie i odwirować ją 20 000 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usuń pozostałe kropelki podczas tego etapu i kolejnych prań, wypychając je z tubek za pomocą końcówki P10, a następnie otwórz pokrywę, aby wyschnąć na powietrzu przez maksymalnie pięć minut.

Gdy nie pozostanie żaden płyn, dodaj 50 mikrolitrów 10-milimolowego chlorku tris. Kilkakrotnie pipetuj roztwór nad obszarem, w którym znajdowała się osadka, aby rozpuścić DNA. Dodaj jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr RNazy A. Wymieszaj, przesuwając probówkę.

Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby strawić RNA. Na koniec przechowuj próbkę w zamrażarce lub lodówce do czasu przygotowania biblioteki. Obrazy sygnału EGFP PCNA każdej posortowanej partii zarodków ujawniają dokładne statusy etapu i cyklu komórkowego każdego pojedynczego zarodka do dalszych eksperymentów.

Ślady bioanalizatora pokazują, że rozkład wielkości fragmentów DNA po doborze wielkości wynosi od 300 do 700 par zasad, a maksimum wynosi około 450 par zasad. Mapy oddziaływań Hi-C pokazują, że w 12 cyklu jądrowym wykrywanych jest niewiele topologicznie powiązanych domen (TAD), co zmienia się dramatycznie w cyklach jądrowych 13 i 14, kiedy TAD są coraz bardziej widoczne, a niespecyficzne kontakty dalekiego zasięgu są wyczerpane. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym umyciu koralików i niepotrzebnym przedłużaniu czasu inkubacji, zwłaszcza w wysokich temperaturach, ponieważ może to prowadzić do niskiej jakości bibliotek Hi-C.

Ta technika łącząca dokładną ocenę stopnia zaawansowania i mapowanie potwierdzenia chromatyny w wysokiej rozdzielczości utorowała drogę naukowcom z dziedziny epigenetyki do zbadania roli trójwymiarowej organizacji chromatyny w warunkach rozwojowych in vivo.