Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie mechanizmów stojących za interakcjami leukocytów z przylegającymi komórkami naczyniowymi lub płytkami krwi w warunkach przepływu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, w jaki sposób leukocyty są rekrutowane do miejsc zapalenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest opłacalna, przyjazna dla użytkownika i umożliwia badanie wielu różnych warunków eksperymentalnych.

Ta metoda może zapewnić wgląd w adhezję leukocytów. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak adhezja komórek nowotworowych do unieruchomionych komórek lub substratów w warunkach przepływu. Procedurę zademonstruje Annemiek Dickhout, inżynier i doktorantka pracująca w moim laboratorium.

Po pobraniu próbek krwi dodać do krwi 1/15 objętości kwaśnego dekstrozy cytrynianu. Następnie odwirować próbkę krwi, wyłączając hamulce na 350 razy g na 15 minut, aby uzyskać osocze bogatopłytkowe. Następnie przenieś otrzymany supernatant do 15-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj do niej 1/10 objętości dekstrozy kwaśnego cytrynianu.

Ponownie odwirować zawiesinę, wyłączając hamulce na 1 120 g na 15 minut, aby uzyskać osocze ubogie w płytki krwi. Następnie wyrzuć supernatant. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić osad płytek krwi w buforze płytkowym utrzymywanym na poziomie pH 6,6 za pomocą pipety Pasteura z szerokim otworem.

Następnie dodaj do niego 1/10 objętości dekstrozy kwaśnego cytrynianu i delikatnie wymieszaj. Następnie odwirować płytki krwi w ilości 1,120 g przez 15 minut, aby uformować osad. Po zakończeniu wirowania odrzucić supernatant i ponownie zawiesić płytki krwi w jednym mililitrze buforu płytek krwi utrzymywanego na pH 7,5.

Następnie użyj automatycznego analizatora hematologicznego, aby zmierzyć stężenie płytek krwi w rozcieńczeniu 1/10. Na koniec dostosuj liczbę komórek za pomocą buforu płytkowego utrzymywanego na poziomie pH 7,5. Aby zabezpieczyć przylegające płytki krwi, zanurz szklane szkiełko nakrywkowe w 1,2 molowym 50% objętościowym mieszaninie etanolu z kwasem solnym.

Po zanurzeniu umyj szkiełko nakrywkowe dwukrotnie ultraczystą wodą. Następnie użyj azotu do wysuszenia szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj 100 mikrolitrów po 30 mikrogramów na mililitr kolagenu szczurzego typu pierwszego, aby wstępnie pokryć szklane szkiełko nakrywkowe.

Po pokryciu szkiełka nakrywkowego należy inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie wydalić roztwór kolagenu i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Następnie użyj 1% albuminy surowicy bydlęcej w buforze HEPES, aby zablokować szkiełka nakrywkowe pokryte kolagenem na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach umyj szkiełka nakrywkowe, a następnie wysusz je do zamontowania w komorze perfuzyjnej. Po zamontowaniu szkiełek nakrywkowych należy przygotować płytki krwi. Aby unieruchomić płytki krwi, przenieś 70 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi do kanału i inkubuj przez 1-1/2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie zastąp nieprzylegające płytki krwi buforem blokującym na 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj jednego mikromola barwnika kwasem nukleinowym z zielonej fluorescencji przenikającego komórkę, aby fluorescencyjnie oznaczyć leukocyty. Po znakowaniu inkubować leukocyty przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut, aby granulować komórki. Ponownie zawiesić w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby przepłukać komórki. Następnie odwiruj komórki w ilości 300 razy g przez pięć minut.

W zależności od natężenia przepływu zawiesić pięć mililitrów komórek w buforze testowym. Następnie podgrzej łaźnię wodną, aby utrzymać 37 stopni Celsjusza. Następnie odłóż na bok 50-mililitrową strzykawkę perfuzyjną i zainstaluj ją na uchwycie strzykawki.

Następnie włącz pompę w trybie poboru z objętością pompy na poziomie zero mililitrów i średnicą na 26,70 milimetra. Następnie podłącz złączkę Luer lock do strzykawki i połącz rurkę ze złączem kolankowym Luer ze złączką Luer lock. Następnie przymocuj wolny koniec rurki do komory przepływowej.

Aby przylgnąć leukocyty do unieruchomionych płytek krwi, należy połączyć mikroszkiełko ze strzykawką. Aby perfuzji leukocytów, a następnie przylgnąć do złoża monowarstwy naczyniowej lub płytkowej, podłącz drugą rurkę do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej bufor do testu, a następnie napełnij rurkę za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po napełnieniu rurki ściśnij ją i podłącz do komory przepływowej.

Przed perfuzją leukocytów dodaj trzy milimole chlorku wapnia i dwa milimole chlorku magnezu do zawiesiny komórki. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby usunąć ewentualne powietrze, które utknęło w komorze i rurkach, przed perfuzją komórek należy przeprowadzić perfuzję z buforem testowym.

Następnie ściśnij probówki, aby zamknąć koniec i przełącz rurkę z bufora testowego na zawiesinę komórki, zapobiegając w ten sposób uwięzieniu w środku pęcherzyków powietrza. Aby dotarły pierwsze komórki, należy je przetopić z odpowiednią szybkością przepływu i naprężeniem ścinającym. Kontynuuj perfuzję komórek, utrzymując natężenie przepływu i naprężenia ścinające przez dwie minuty.

Następnie uchwyć sześć obrazów toczących się i przylegających komórek w ciągu dwóch do sześciu minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z 10-krotnym powiększeniem podłączonego do kamery cyfrowej. W tym teście analizowano adhezję komórek THP1 znakowanych na zielono fluorescencyjnie z komórkami śródbłonka w obecności lub braku stymulacji wektora martwicy nowotworu alfa. Wykres i uzyskane obrazy fluorescencyjne wykazują znaczny wzrost zatrzymania komórek THP1 po stymulacji komórek śródbłonka wektorem martwicy nowotworu alfa w porównaniu z kontrolą.

Po zarejestrowaniu w upływku czasu można monitorować transśródbłonkową migrację pierwotnych monocytów w czasie. Następnie analizowano adhezję znakowanych fluorescencyjnie neutrofili z unieruchomioną monowarstwą płytek krwi w komorze przepływowej w obecności lub braku stymulacji TRAP-6. Uzyskany wykres wykazuje gwałtowny wzrost adhezji neutrofili do płytek krwi stymulowanych TRAP-6 w porównaniu z kontrolą.

Następnie uzyskano płytki krwi od myszy z niedoborem JAM-A w celu zbadania jego adhezji z surowym monocytem myszy 264,7 w obecności inhibitorów receptora powierzchniowego. Uzyskany wykres i uzyskane obrazy fluorescencyjne wykazują znaczne zmniejszenie adhezji monocytów myszy z płytkami krwi w porównaniu z kontrolą. Ponadto, aby zbadać adhezję surowych komórek 264,7 z płytkami krwi, myszy z dodatnim i niedoborem JAM-A były narażone na stopniowy wzrost naprężeń ścinających.

Z wykresu jasno wynika, że adhezja surowych komórek 264,7 z płytkami krwi uzyskanymi od myszy z niedoborem JAM-A jest bardziej odporna na stres ścinający niż płytki krwi dodatnie JAM-A. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby bardzo delikatnie umyć płytki krwi podczas izolacji, aby płytki krwi nie uległy wstępnej aktywacji lub zagregowaniu.

Ważne jest również, aby upewnić się, że w układzie przepływu nie ma żadnych pęcherzyków powietrza, ponieważ system może być przeciążony oraz aby zapewnić stabilne i równomierne naprężenie ścinające. Po tej procedurze można zbadać podstawowe mechanizmy rekrutacji leukocytów podczas zapalenia naczyń krwionośnych.