Name: Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę testów opartych na przepływie laminarnym do badania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i płytkach krwi. Ta technika jest ekonomiczna, przyjazna użytkownikowi i wszechstronna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Martinowi M. Schmittowi i Line Fraemohs. Prace te były wspierane przez Niderlandzką Fundację Badań Naukowych (ZonMW VIDI 016.126.358), Fundację Landsteinera na rzecz Badań nad Transfuzjami Krwi (LSBR Nr. 1638) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) przyznaną R.R.K.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Radę ds. Etyki Medycznej i Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Maastricht.
1. Test oparty na przepływie z komórkami ludzkimi
<ol>
	<li>Izolacja płytek krwi z krwi ludzkiej
	<ol>
		<li>Pobrać krew żylną w antykoagulantach cytrynianowych (3,2%).</li>
		<li>Dodać 1/15 objętości kwaśnego cytrynianu dekstrozy (ACD: 80 mM cytrynian trisodowy, 52 mM kwas cytrynowy i 183 mM glukozy) do krwi.</li>
		<li>Wirować przy 350 x g bez hamulca przez 15 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP).</li>
		<li>Przenieść supernatant do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 1/20 objętości ACD.</li>
		<li>Wirować przy 1,110 g bez hamulca przez 15 minut w celu uzyskania osocza ubogiego w płytki krwi (PPP).</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Odciąć koniec końcówki pipety (P 1000), tworząc jej szeroki otwór, co pomaga w zapobieganiu aktywacji płytek krwi, i ostrożnie zawiesić osad płytek krwi w tej samej objętości co PRP w buforze płytkowym o pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% glukozy). Dodaj 1/20 objętości ACD i delikatnie wymieszaj.</li>
		<li>Płytki krwi w dawce 1 110 g granulować bez hamulca przez 15 minut.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany osad i ostrożnie zawiesić płytki krwi jak powyżej w 1 ml buforu płytek krwi (pH 7,5).</li>
		<li>Zmierzyć stężenie płytek krwi w rozcieńczeniu 1/10 za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Dostosuj objętość za pomocą buforu płytkowego (pH 7,5), aby uzyskać liczbę 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek wielojądrzastych z ludzkiej krwi (na podstawie Brinkmann i wsp.<klasa sup="odnośnik">11 )
	<ol>
		<li>Pobrać 24 ml krwi w heparynie (10 U/ml) jako antykoagulant.</li>
		<li>Dodaj 6 ml pożywki z diatrizoinianem polisarozy i sodu o gęstości 1,077 g/ml (patrz tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ostrożnie ułóż 5-6 ml krwi pełnej na wierzchu.</li>
		<li>Wirować przez 20 minut przy 800 x g bez hamulca.</li>
		<li>Odessać i odrzucić przezroczystą żółtawą warstwę wierzchnią i przenieść dolną czerwonawą fazę zawierającą granulocyty do świeżych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Przemyć komórki, dodając PBS zawierający 2 mM EDTA do końcowej objętości 14 ml i odwirować przez 10 minut przy 300 x g bez hamulca.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować roztwór roboczy o gradiencie gęstości (np. perkol, patrz Tabela Materiałów), mieszając 18 ml pożywki o gradiencie gęstości z 2 ml roztworu podstawowego 10x PBS. Rozcieńczyć ten roztwór roboczy PBS (1x), aby uzyskać po 4,25 ml roztworów pożywki o gradiencie 85%, 80%, 75%, 70% i 65%.</li>
		<li>Przygotuj 2 stożkowe probówki z gradientem gęstości, nakładając na siebie po 2 ml każdego procentu podłoża. Zacznij od najwyższego stężenia i kontynuuj w kolejności malejącej. Zaznacz warstwy na tubie wodoodpornym markerem.</li>
		<li>Ostrożnie nałóż 2 ml zawiesin komórkowych na każdy z dwóch przygotowanych gradientów.</li>
		<li>Wirować przez 20 minut przy 800 x g bez hamulca w starannie zbalansowanej wirówce.</li>
		<li>Po odwirowaniu usuń górną warstwę i większość warstwy 65% (pierwszy pierścień) z PBMC i zbierz do nowych probówek białe pozostałe interfazy aż do warstwy 85% (drugi pierścień, PMN).</li>
		<li>Przemyć komórki, napełniając probówki PBS 2 mM EDTA i odwirować przez 10 minut przy 300 x g bez hamulca.</li>
		<li>Usunąć supernatant i zawiesić osadzone komórki (zwykle ≥95% to PMN) w 1 ml buforu Hanka (pH 7,45), zawierającego 10 mM Hepes i 0,2% albuminy ludzkiej (bufor testowy).</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i zawieś komórki na poziomie 1 x 106/ml.</li>
		<li>Kontynuuj znakowanie fluorescencyjne i perfuzję leukocytów (krok 3.3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przylegających monowarstw komórek płytkowych i naczyniowych
	<ol>
		<li>Przygotowanie naczynia do hodowli komórkowych (hodowane komórki)
		<ol>
			<li>Wstępnie pokryj szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm 1 ml rozcieńczonego kolagenu z ogona szczura (30 μg/ml rozcieńczonego w PBS przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm).</li>
			<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wyrzucić roztwór kolagenu i raz umyć naczynie PBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hodowla komórek naczyniowych w szalkach hodowlanych
		<ol>
			<li>Odłącz pierwotne (np. HUVEC, HAoEC, HAoSMC) lub unieśmiertelnione komórki naczyniowe (np. EA. Hy926, SVEC) wyhodowane do zbiegu w kolbie T75 z 1,5 ml roztworu do oddzielania komórek (np. akutazy). Dodać 4,5 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować roztwór odłączający komórki i określić stężenie komórek za pomocą komory do liczenia komórek. Zawieś komórki w ilości 0,5 x 105 komórek/ml w odpowiednim pożywce wzrostowej (np. Kompletnej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka).</li>
			<li>Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej płytki o średnicy 35 mm. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do konfluencji (24–48 godzin, w zależności od typu komórki).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie szkiełka nakrywkowego (przylegające płytki krwi)
		<ol>
			<li>Zanurz szklane szkiełko nakrywkowe raz w HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).</li>
			<li>Opłucz szkiełko nakrywkowe 2 razy w ultraczystej wodzie.</li>
			<li>Wysuszyć szkiełko nakrywkowe podN2.</li>
			<li>Wstępnie pokryć szkiełko nakrywkowe 100 μl, zgodnie z położeniem kanału komory perfuzyjnej rozcieńczonego kolagenu typu I z ogona szczura (30 μg/ml rozcieńczonego w PBS przefiltrowanego przez filtr 0,2 μm).</li>
			<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić roztwór kolagenu i przemyć szkiełko nakrywkowe 3x PBS.</li>
			<li>Zablokuj szkiełko nakrywkowe pokryte kolagenem za pomocą 1% BSA w HEPES przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Umyj i osusz szkiełko nakrywkowe, a następnie umieść je w komorze perfuzyjnej. Wyizolować płytki krwi z krwi ludzkiej lub mysiej zgodnie z opisem odpowiednio w kroku 1.1 lub 2.1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Unieruchomienie płytek krwi
		<ol>
			<li>Dodać 70 μl zawiesiny płytek krwi 2 x 107/ml na kanał i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
			<li>Ostrożnie zastąpić nieprzylegające płytki krwi roztworem blokującym (5% BSA w HEPES) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuować znakowanie fluorescencyjne i perfuzję leukocytów (krok 3.3).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stymulacja monowarstwy komórek naczyniowych
		<ol>
			<li>Stymulować komórki naczyniowe, zastępując pożywkę świeżą pożywką zawierającą 10 ng/ml czynnika martwicy nowotworu α (TNFα) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test oparty na przepływie z komórkami mysimi
<ol>
	<li>Izolacja płytek krwi z krwi myszy
	<ol>
		<li>Pobrać krew przez nakłucie serca za pomocą igły 21 G (~ 1 ml) od znieczulonych (ketamina 80 mg / kg i medetomidyna 0,3 mg / kg) 6-8 tygodniowych myszy (C57Bl / 6) w cytrynianie (3,2 %) jako antykoagulant.</li>
		<li>Dodaj 1/6 objętości ACD.</li>
		<li>Odwirować przy 220 x g, średni hamulec przez 5 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP).</li>
		<li>Przenieś supernatant (~600 μl) plus 1/3 czerwonych krwinek do nowej probówki</li>
		<li>Wirować przy 95 x g bez hamulca przez 6 min.</li>
		<li>Przenieść supernatant (PRP) i zmierzyć stężenie płytek krwi w rozcieńczeniu 1:10 w buforze Tyrode'a (bufor TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4*H2O, 2 mM MgCl2, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% glukozy) za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Przemyć płytki krwi, dodając 1/25 objętości ACD + 0,1 U/ml apyrazy i odwirować przy 2 870 g, średni hamulec przez 2 minuty.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dodać 600 μl buforu TH, 1:10 objętości ACD i 0,1 U/ml apyrazy. Odciąć końcówkę pipety (P 1000), tworząc jej szeroki otwór, co pomaga w zapobieganiu aktywacji płytek krwi, i delikatnie zawiesić osad.</li>
		<li>Wirowanie przy 2 870 g, średni hamulec przez 2 min</li>
		<li>Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić płytki krwi w buforze TH.</li>
		<li>Dostosuj objętość za pomocą bufora TH, aby uzyskać liczbę 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przylegających monowarstw płytek krwi
	<ol>
		<li>Przygotować szklane szkiełko nakrywkowe (przylegające płytki krwi) zgodnie z ppkt 1.3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie płytek krwi
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny płytek krwi 2 x 107/ml na kanał i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Ostrożnie zastąpić nieprzylegające płytki krwi roztworem blokującym (5% BSA w HEPES) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuować znakowanie fluorescencyjne i perfuzję leukocytów (krok 3.3)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja monowarstwy płytek krwi myszy
	<ol>
		<li>Przed perfuzją leukocytów (krok 3.3) stymulować płytki krwi poprzez perfuzję trombiny (0,5 nM) w buforze HHHSA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znakowanie fluorescencyjne i perfuzja leukocytów (PMN lub THP-1 dla ludzi i RAW264.7 lub pierwotnych monocytów myszy do mysich testów opartych na przepływie)
<ol>
	<li>Etykietowanie fluorescencyjne
	<ol>
		<li>Oznacz leukocyty (1 x 106 / ml) za pomocą przepuszczalnego dla komórki zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego (1 μM). Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i zawiesić komórki do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml (5 ml na warunki badania, w zależności od szybkości przepływu) w buforze do oznaczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie testu w komorze przepływowej
	<ol>
		<li>W celu adhezji leukocytów na monowarstwie komórkowej należy wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej z naczynia i złożyć ją w komorze przepływowej. Podłączyć rurkę do strzykawki. W celu uzyskania adhezji leukocytów na unieruchomionych płytkach krwi należy podłączyć mikroszkiełko do strzykawki. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Weź strzykawkę perfuzyjną (50 ml), zainstaluj strzykawkę na uchwycie strzykawki i ustaw pompę w tryb wycofania. Ustawić objętość pompy na 0 ml i ustawić średnicę na 26,70 mm dla strzykawki 50 ml.</li>
		<li>Podłącz kolankowe złącze luer do jednego końca rurki. Umieścić złączkę typu luer lock w strzykawce i połączyć rurkę z kolankowym złączem luer ze złączką luer lock. Podłącz wolny koniec rurki do komory przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja i adhezja leukocytów
	<ol>
		<li>W celu adhezji leukocytów na monowarstwie komórkowej należy wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej z naczynia i złożyć ją w komorze przepływowej. Podłączyć rurkę do strzykawki. W celu uzyskania adhezji leukocytów na unieruchomionych płytkach krwi należy podłączyć mikroszkiełko do strzykawki.</li>
		<li>W celu perfuzji i adhezji leukocytów na monowarstwie naczyń krwionośnych lub płytek krwi, umieść drugą rurkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej bufor testowy i napełnij rurkę pipetą o pojemności 1 ml, a następnie ściśnij rurkę i podłącz ją do komory przepływowej.</li>
		<li>Przed perfuzją leukocytów dodać 3 mM CaCl2 i 2 mM MgCl2 do zawiesiny komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Bufor do oznaczania perfuzji przed perfuzją komórek w celu usunięcia ewentualnego powietrza z komory i przewodów.</li>
		<li>Zamknij końce probówki, ściskając je mocno i zmień rurkę z bufora testowego na zawiesinę komórek, zapobiegając uwięzieniu pęcherzyków powietrza. Perfuzjuj komórki z odpowiednim natężeniem przepływu/naprężeniem ścinającym, aż pojawią się pierwsze komórki.</li>
		<li>Perfekować komórki o odpowiednim natężeniu przepływu/naprężeniu ścinającym przez 2 minuty i uchwycić co najmniej 6 zdjęć w ciągu 2–6 minut toczących się i przylegających komórek za pomocą mikroskopu kontrastowego/fluorescencyjnego z odwróconą fazą (np. EVOS-FL) przy użyciu 100-krotnego powiększenia podłączonego do cyfrowej kamery CCD lub CMOS. 
		UWAGA: Natężenie przepływu/naprężenie ścinające zależy od wymiarów komory przepływowej i lepkości perfuzatu. Dla używanej tutaj komory perfuzyjnej (patrz tabela materiałów): 
		τ=η*97,1*Φ 
		τ: naprężenie ścinające (1 dyn / cm2) 
		η: lepkość (0,015 dyn*s/cm2) 
		Φ: Natężenie przepływu (0,67 ml/min)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie adhezji leukocytów
	<ol>
		<li>W celu usunięcia adhezji należy zmienić rurkę z zawiesiny komórek na bufor testowy, ściskając rurkę, zapobiegając uwięzieniu pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Odłączyć komórki przez perfuzję za pomocą buforu do oznaczania o odpowiednim natężeniu przepływu/naprężeniu ścinającym (patrz uwaga 3.3.7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmigracja leukocytów
	<ol>
		<li>W przypadku transmigracji leukocytów należy perfuzjować leukocyty (krok 3), aż do przylegania odpowiedniej ilości leukocytów (~50 komórek/pole widzenia).</li>
		<li>Zastąp zawiesinę leukocytów buforem testowym.</li>
		<li>Rejestruj transmigrujące komórki poklatkowo co 10–15 s przez 30–60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li>
<li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li>
<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
<li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016793170200494X">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li>
<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten test in vitro jest prostą metodą badania podstawowych mechanizmów rekrutacji leukocytów podczas zapalenia naczyń, ale należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów. Pierwszym wymogiem pomyślnego przeprowadzenia tego testu jest perfuzja leukocytów przez nienaruszoną i zlewającą się monowarstwę naczyniową lub płytkową. Można to osiągnąć poprzez wcześniejsze pokrycie powierzchni kolagenem typu I. Ogólnie rzecz biorąc, podczas pracy z pierwotnymi komórkami naczyniowymi ważne jest, aby delikatnie odłączyć kom...

Po urazie, zapaleniu lub infekcji, leukocyty szybko reagują na wzorce molekularne związane z patogenami lub uszkodzeniami (PAMPs, DAMPs), przechodzą w stan aktywowany i przemieszczają się z krwiobiegu do miejsc stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek. Zdolność leukocytów do interakcji ze środowiskiem komórkowym i molekularnym jest niezbędna do ich prawidłowego funkcjonowania jako komórek odpornościowych, co podkreślają zaburzenia genetyczne, takie jak niedobór adhezji leukocytów1. Adhezja leukocytów była przedmiotem intensywnych badań w ciągu ostatnich dziesięcioleci, co zaowocowało koncepcją kaskady adhezji leukocytów na początku lat 90. XX wieku2,3. Adhezja leukocytów jest inicjowana przez wychwytywanie leukocytów do śródbłonka za pośrednictwem selektoryny, powodując przetaczanie się komórek po powierzchni naczynia. To zwijanie umożliwia leukocytom skanowanie w poszukiwaniu sygnałów migracyjnych związanych ze śródbłonkiem, np. chemokin, które indukują aktywację integryn. Następnie aktywowane integryny pośredniczą w wiązaniu się z ligandami śródbłonka, co powoduje mocne zatrzymanie leukocytów. Leukocyty mogą następnie przygotowywać się do wynaczynienia, pełzając i rozprzestrzeniając się, zanim przenikną do monowarstwy śródbłonka i przejdą do leżącej poniżej tkanki. Podstawowa koncepcja kanonicznej kaskady leukocytów pozostała w dużej mierze niezmieniona od czasu jej wprowadzenia, z kilkoma dodanymi etapami pośrednimi4. Niemniej jednak dokładne mechanizmy molekularne i role wielu graczy zaangażowanych w rekrutację leukocytów nie zostały do tej pory wyjaśnione, a rekrutacja leukocytów pozostaje ważnym tematem w dziedzinie badań nad infekcjami, stanami zapalnymi i (auto)odpornością.
Na przykład, podczas chorób zapalnych naczyń krwionośnych, takich jak miażdżyca, zwiększona rekrutacja leukocytów do ściany naczynia napędza rozwój blaszki miażdżycowej. Niestabilne blaszki miażdżycowe mogą pękać, prowadząc do masywnej aktywacji płytek krwi i układu krzepnięcia, a następnie do niedrożności naczynia5. Może to spowodować poważne skutki sercowo-naczyniowe, takie jak zawał mięśnia sercowego lub udar mózgu. Ponadto obnażenie śródbłonka w postaci, w jakiej występuje klinicznie, np. po stentowaniu tętnicy wieńcowej, prowadzi do wielości oddziaływań leukocytów i płytek krwi z odsłoniętym wnętrzem ściany naczynia (np. składników macierzy i komórek mięśni gładkich) oraz leukocytów z płytkami krwi pokrywającymi uszkodzenie naczyniowe. Interakcje te są ważne dla dalszego rozwoju choroby, ponieważ interakcje monocyta-płytka krwi mogą napędzać powstawanie neointima6,7. Ponadto interakcje płytk-leukocyty, w których pośredniczy integryna leukocytów Mac-1 (αMβ2) i płytki krwi GPIbα, zostały niedawno zidentyfikowane jako nowe czynniki powodujące zakrzepicę u myszy8.
Biorąc pod uwagę szeroką dostępność krwi ludzkiej i zwierzęcej jako źródła leukocytów i płytek krwi do badań, a także szerokie spektrum izolowanych cząsteczek matrycy i unieśmiertelnionych linii komórkowych pochodzenia leukocytowego i naczyniowego, możliwe jest symulowanie interakcji leukocytów pod przepływem w warunkach laboratoryjnych, przy użyciu specjalnie zaprojektowanych komór perfuzyjnych. W ciągu ostatnich dziesięcioleci zaprojektowano wiele wariantów, od napędzanych podciśnieniem po samoprzylepne komory perfuzyjne. Wszystkie warianty mają wspólną cechę polegającą na tym, że część nieruchoma (np. hodowane komórki naczyniowe lub białka macierzy) jest montowana w większej, szczelnej komorze wyposażonej w predefiniowany kanał umożliwiający perfuzję płynów przez część nieruchomą. Ponadto postęp w technologii formowania umożliwił opracowanie niestandardowych rozwiązań opartych na polimerach krzemionkowych9. Lepkość i natężenie przepływu perfundowanych płynów oraz wysokość kanału decydują głównie o charakterystyce naprężeń ścinających urządzenia do perfuzji przepływu10. W artykule przedstawiono metodę in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw adhezji, deadhezji i transmigracji leukocytów w reżimie przepływu żylnego i tętniczego. Zaletą przedstawionych tu metod jest to, że można je wykonywać przy użyciu zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego podłączonego do kamery i nie wymagają od eksperymentatora wysokiej biegłości technicznej. Test in vitro może być manipulowany na wiele sposobów (np. poprzez dodawanie inhibitorów lub blokowanie przeciwciał), a zatem ma zastosowanie w różnych modelach zapalenia naczyń krwionośnych i umożliwia badanie funkcji białek adhezyjnych lub ocenę określonych związków.

<table><tbody><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny, np. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa np. model: 210-CE&</td><td>nbsp; światowe instrumenty precyzyjne</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 50 ml</td><td>Rurka silikonowa Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Złącze kolankowe Luer męskie</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Żeńskie złącze Luer Lock</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Komora przepływowa</td><td>Szpital Uniwersytecki RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Chen. 2005 r.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi Szkiełko samoprzylepne VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do szkiełek samoprzylepnych&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A Aktywator receptora trombiny</td><td></td></tr><tr><td>dla peptydu 6 (TRAP - 6)</td> <td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Zrównoważony roztwór soli 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES 1M, płyn</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumina, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Woda do wstrzykiwań</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (gotowa do użycia)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże z komórek naczyniowych&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzrostu komórek śródbłonka-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzrostu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa śródbłonka, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórek śródbłonka myszy, transformacja SV 40 (SVEC4-10)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórek monocytowych, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z ultra-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Mosimy monocyt/makrofag RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Plastikowe probówki do pobierania krwi Vacutainer z heparyną sodową</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>PROBÓWKA VACUETTE 9 ml 9NC Koagulacja cytrynian sodu 3,2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina HCl/EtOH (1,2 mol/L HCl i 50% etanolu) w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Przygotować przez zmieszanie 0,3 l HCl (4 mol/L) z 0,7 l etanolu 70% v/v w dygestoriach</td><td></td></tr></tbody></table>

testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Rekrutacja leukocytów po urazie lub stanie zapalnym do miejsc urazu lub uszkodzenia tkanek była badana w ostatnich dziesięcioleciach i zaowocowała koncepcją kaskady adhezji leukocytów. Jednak dokładne mechanizmy molekularne zaangażowane w rekrutację leukocytów nie zostały jeszcze w pełni zidentyfikowane. Ponieważ rekrutacja leukocytów pozostaje ważnym tematem w dziedzinie badań nad infekcjami, stanami zapalnymi i (auto)immunologią, przedstawiamy prosty test oparty na przepływie laminarnym w celu zbadania podstawowych mechanizmów adhezji, deadhezji i transmigracji leukocytów w reżimach przepływu żylnego i tętniczego. Test in vitro może być wykorzystany do badania mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi w różnych modelach zapalenia naczyń krwionośnych. Protokół ten opisuje test oparty na przepływie laminarnym przy użyciu komory o przepływie równoległym i mikroskopu kontrastowego z odwróconą fazą połączonego z kamerą w celu zbadania interakcji leukocytów i komórek śródbłonka lub płytek krwi, które można wizualizować i rejestrować, a następnie analizować w trybie offline. Komórki śródbłonka, płytki krwi lub leukocyty można wstępnie potraktować inhibitorami lub przeciwciałami w celu określenia roli określonych cząsteczek podczas tego procesu. Warunki ścinania, tj. tętnicze lub żylne naprężenia ścinające, można łatwo dostosować na podstawie lepkości i natężenia przepływu perfundowanych płynów oraz wysokości kanału.

W celu zbadania adhezji leukocytów do śródbłonka, fluorescencyjnie znakowane komórki THP-1 przepływano nad monowarstwą komórek śródbłonka stymulowaną TNFα lub niestymulowaną przez 2 min przy wartości 3 dyne/cm2. Całkowitą liczbę przylegających komórek monocytarnych określono po 2 min perfuzji, rejestrując 6 niezależnych pól w czasie od 2 do 6 min. Liczbę przyległych komórek oszacowano na co najmniej 6 zdjęciach wykonanych za pomocą odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego/fl...

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie mechanizmów stojących za interakcjami leukocytów z przylegającymi komórkami naczyniowymi lub płytkami krwi w warunkach przepływu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, w jaki sposób leukocyty są rekrutowane do miejsc zapalenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest opłacalna, przyjazna dla użytkownika i umożliwia badanie wielu różnych warunków eksperymentalnych.Ta metoda może zapewnić wgląd w adhezję leukocytów. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak adhezja komórek nowotworowych do unieruchomionych komórek lub substratów w warunkach przepływu. Procedurę zademonstruje Annemiek Dickhout, inżynier i doktorantka pracująca w moim laboratorium.Po pobraniu próbek krwi dodać do krwi 1/15 objętości kwaśnego dekstrozy cytrynianu. Następnie odwirować próbkę krwi, wyłączając hamulce na 350 razy g na 15 minut, aby uzyskać osocze bogatopłytkowe. Następnie przenieś otrzymany supernatant do 15-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj do niej 1/10 objętości dekstrozy kwaśnego cytrynianu.Ponownie odwirować zawiesinę, wyłączając hamulce na 1 120 g na 15 minut, aby uzyskać oso

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Ten film demonstruje test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować interakcję leukocytów i partnerów komórkowych, takich jak komórki śródbłonka. Metoda ta zapewnia dynamiczny wgląd w adhezję, martwość i transmigrację leukocytów po perfuzji przez nienaruszoną i zlewającą się warstwę komórek naczyniowych.

Test oparty na przepływie laminarnym do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Poznaj metodę testów opartych na przepływie laminarnym do badania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i płytkach krwi. Ta technika jest ekonomiczna, przyjazna użytkownikowi i wszechstronna.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi (Wideo) | JoVE Journal

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Przeglądaj więcej filmów