Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Odkryliśmy, że HLA-I jest epigenetycznie regulowany w dół w subpopulacji komórek nowotworowych, które wykazują właściwości komórek macierzystych i zdolność inicjowania nowotworu. Regulacja w dół HLA-I jest bezpośrednio związana z ucieczką immunologiczną, zapewniając przewagę w przeżywalności nowotworowym komórkom macierzystym, co sprawia, że ujemność HLA-I jest dokładnym markerem funkcjonalnym dla tych komórek. Procedurę zademonstruje Sudeh Izadmehr, doktor habilitowany z naszego laboratorium.

Po pobraniu próbki umieść tkankę na 100-milimetrowej szalce Petriego w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj do naczynia 500 mikrolitrów sterylnego PBS. Użyj sterylnego skalpela, aby mechanicznie rozbić tkankę na małe kawałki, aż żaden fragment nie będzie większy niż 0,1 milimetra. Przenieś całą objętość PBS o pojemności 500 mikrolitrów przez sitko do komórek porowych o średnicy 35 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj kolejne 500 mikrolitrów PBS do fragmentów tkanek i ponownie zmielić tkanki. Następnie przefiltrować supernatant przez sitko do komórek do tej samej probówki zbiorczej i kontynuować mielenie kawałków tkanki, aż próbka zostanie całkowicie zdysocjowana. Po zebraniu ostatniej objętości komórek należy odwirować komórki nowotworowe przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do hemolizy.

Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zbierz komórki za pomocą kolejnego odwirowania i umyj granulki kolejnymi pięcioma mililitrami PBS. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS i policzyć żywe komórki. Rozcieńczyć komórki do 10 do siódmych komórek na 200 mikrolitrów stężenia PBS na lodzie i dodać 200 mikrolitrów macierzy błony podstawnej do komórek, delikatnie mieszając.

Następnie wstrzyknij podskórnie macierz błony zawiesinowej zawiesiny komórkowej w bok myszy gamma NOD scid i sprawdzaj wzrost guza w miejscu wstrzyknięcia dwa razy w tygodniu. Gdy guz osiągnie średnicę jednego centymetra, przetnij guz na pół i przymocuj połowę ksenoprzeszczepu za pomocą 4% paraformaldehydu przez noc do analizy histologicznej. Przetwórz drugą połowę guza, jak właśnie pokazano, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, i rozcieńczyć komórki do dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr PBS uzupełnionego stężeniem 5% FBS.

Utrzymuj komórki na lodzie przez 30 minut przed podzieleniem zawiesiny komórek między jedną kontrolną izotyp i jedną probówkę z przeciwciałem. Zanotować liczbę komórek w każdej probówce i zmieszać komórki w probówce z przeciwciałem anty-HLA, a komórki w probówce kontrolnej z odpowiednim przeciwciałem kontrolnym anty-izotypu przez 90-minutową inkubację na lodzie. Pod koniec inkubacji zbierz obie populacje komórek przez odwirowanie, a następnie dwa 10-mililitrowe płukania PBS przez odwirowanie.

Po drugim praniu ponownie zawiesić granulki w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr DAPI do stężenia jeden razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Następnie przefiltruj każdą zawiesinę komórek przez sitko porowe o długości 35 mikrometrów do pojedynczych rurek polistyrenowych o wymiarach 12 na 75 milimetrów. Po sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją rozcieńczyć HLA-I-ujemne i dodatnie populacje komórek, aby uzyskać indywidualne stężenia komórek jeden razy 10 do piątych w 15 mililitrach pożywki wzrostowej sarkosfery na podzestaw.

Seryjnie rozcieńczyć komórki do stężeń jeden razy 10 do czwartego, 10 do trzeciego i 10 do drugiego w 15 mililitrach świeżej pożywki wzrostowej sarkosfery na rozcieńczenie i dodać 100 mikrolitrów komórek z każdego rozcieńczenia do każdej studzienki jednej 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie na rozcieńczenie. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, codziennie monitorując tworzenie się sarkosfery za pomocą mikroskopii świetlnej i dodając świeży podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i naskórkowy czynnik wzrostu do każdej studzienki bez zmiany pożywki co trzy dni. Po trzech tygodniach policz liczbę dołków z dodatnim i ujemnym wynikiem sarkosfery dla każdego rozcieńczenia komórek zarówno HLA-I-ujemnych, jak i HLA-I-dodatnich, aby umożliwić obliczenie częstości tworzenia komórek sferycznych na podstawie rozkładu prawdopodobieństwa Poissona.

Zazwyczaj ksenoprzeszczepy mięsaka pochodzące od pacjentów składają się z dwóch odrębnych populacji HLA-I-dodatnich i ujemnych, o podobnej histologii do tej, którą wykazuje macierzysty guz pierwotny. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek komórek inicjujących ksenoprzeszczep pochodzących od pacjenta z mięsakiem, jak wykazano, ułatwia wzbogacenie dużej liczby komórek HLA-I-ujemnych z populacji komórek rodzicielskich. Komórki HLA-I-ujemne są w stanie tworzyć kule przy początkowym wprowadzeniu zaledwie 10 komórek i wykazują wyższą zdolność tworzenia guza niż komórki inicjujące ksenoprzeszczep u pacjenta z mięsakiem HLA-I-dodatnim.

Wstrzyknięcie tej samej liczby komórek HLA-I ujemnych i dodatnich podskórnie w przeciwległe boki tej samej myszy pokazuje, że komórki HLA-I-ujemne mają znacznie wyższą zdolność do tworzenia guza. Podczas gdy ksenoprzeszczepy utworzone zarówno przez subpopulacje HLA-I, ujemne, jak i dodatnie, są nowotworami niejednorodnymi komórkowo. Co więcej, analiza ekspresji genów w komórkach inicjujących nowotwór ujawnia, że komórki HLA-I-ujemne wyrażają markery różnicowania komórek macierzystych i mogą być indukowane do różnicowania się zarówno wzdłuż szlaków lipogennych, jak i osteogennych, wykazując silne barwienie i hodowlę Oil-Red-O i Alizarin-Red-S.

Metoda ta może być stosowana do izolowania nowotworowych komórek macierzystych w różnych nowotworach u ludzi. Karbonizacja molekularna, na przykład poprzez sekwencjonowanie nowej generacji, może ujawnić wspólne markery do terapeutycznego celowania w komórki. Nasze odkrycie pokazuje, że przywrócenie HLA-I jest kluczowym krokiem dla powodzenia strategii augmentacji komórek odpornościowych jednostek funkcjonalnych.