Name: Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj izolację komórek inicjujących nowotwór z mięsaka przy użyciu sortowania FACS i markera HLA-I. Ta metoda umożliwia identyfikację komórek macierzystych nowotworu o właściwościach inicjujących nowotwór.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NCI-P01-CA087497 (do C.C.-C. i D.H.) oraz NIH-U 54-0OD020353 (do C.C.-C., D.H. i J.D.-D.), Agilent Thought Leader Award (dla C.C.-C.) oraz Fundację Martel (dla C.C.-C. i J.D.-D.).

Wszystkie omawiane tutaj protokoły eksperymentów na myszach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Mount Sinai Medical Center, Institutional Human Research Ethics Committee oraz Animal Care and Use Committee.
1. Przetwarzanie próbki tkanki mięsaka i tworzenie PDX
<ol>
	<li>Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną, personel patomorfologii powinien przygotować próbki mięsaka z próbek chirurgicznych i natychmiast umieścić każdą próbkę na lodzie na szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umieść próbkę w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml z 6 ml zimnej pożywki hodowlanej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Natychmiast przetworzyć próbkę tkanki.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Tylko w przypadku kostniakomięsaka wykonaj następujące kroki, które można pominąć w przypadku mięsaka tkanek miękkich.
	<ol>
		<li>Pokrój tkankę na 20 mm3 kawałki za pomocą skalpela. Przenieść fragmenty tkanek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml roztworu kolagenazy (RPMI 1640 z 1 mg/ml kolagenazy).</li>
		<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj probówkę, a następnie dodaj 3 ml RPMI 1640 uzupełnionego 10% FBS, aby zneutralizować aktywność kolagenazy.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieść próbkę tkanki na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Dodać 500 μl sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do tkanki. Za pomocą sterylnego skalpela mechanicznie rozdrobnij tkankę na małe kawałki, aż żaden widoczny fragment tkanki nie będzie większy niż 0,1 mm.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek o objętości 500 μl do sitka o pojemności 35 μm i zebrać przefiltrowaną zawiesinę za pomocą probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml. Umieść tę probówkę polistyrenową o pojemności 50 ml z zawiesiną komórek na lodzie.</li>
	<li>Dodaj kolejne 500 μl PBS do tkanki. Rozcierać po raz drugi, przenieść zawiesinę przez sitko do komórek i zebrać ją do tej samej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powtarzaj te kroki (kroki 1.5–1.6), aż wycinek tkanki zostanie całkowicie zdysocjowany, zwykle 6x - 8x.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad za pomocą 5 ml buforu do hemolizy (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA) i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia czerwonych krwinek.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej i usunąć bufor do hemolizy. Umyj granulki 5 ml PBS. Ponownie odwirować przez 5 minut przy 350 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml PBS i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru lub innej alternatywnej metody. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 107 komórek w 200 μl PBS. Pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie.</li>
	<li>Pozostaw matrycę błony podstawnej na lodzie, aby mogła się stopić. Dodać 200 μl macierzy błony podstawnej do zawiesiny komórek o objętości 200 μl. Delikatnie wymieszaj i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć mieszaninę zawiesiny komórkowej i macierzy błony podstawnej (1:1) dwóm myszom NOD scid gamma (NSG) w ich boki. Do każdego wstrzyknięcia należy użyć 200 μl.</li>
	<li>Monitoruj tworzenie się PDX, sprawdzając miejsce wstrzyknięcia myszy 2 razy w tygodniu. Usuń ksenoprzeszczep guza, gdy osiągnie 1 cm średnicy.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek inicjujących nowotwór przez FACS z PDX
<ol>
	<li>Chirurgicznie usuń PDX z myszy, jak opisano wcześniej12.</li>
	<li>Przetnij guz na pół. Utrwal połowę ksenoprzeszczepu za pomocą 4% paraformaldehydu przez noc. Służy do analizy histologicznej. Przetwórz drugą połowę tkanki zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.3–1.8), aby uzyskać zawiesinę komórek nowotworowych.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad za pomocą PBS i policzyć liczbę żywotnych komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek w PBS uzupełnionym 5% FBS do stężenia 2 x 106 komórek/ml. Pozostawić zawiesinę komórkową na lodzie na 30 minut. Podzielić zawiesinę komórek na dwie probówki. Oznacz probówki odpowiednio kontrolą izotopową i przeciwciałem. Zwróć uwagę na liczbę komórek w każdej probówce.</li>
	<li>Przygotować 2x przeciwciało HLA-1-PE, rozcieńczając przeciwciało PBS uzupełnionym 5% FBS (1:250). Rozcieńczyć ujemne przeciwciało kontrolne izotypu w tym samym stanie. Zmieszać zawiesinę komórkową z probówki z "przeciwciałem" z rozcieńczonym przeciwciałem (1:1), aby uzyskać końcowe rozcieńczenie przeciwciała w stosunku 1:500. Zmieszać zawiesinę komórek z probówki "kontrola izotopów" z kontrolą izotopową (1:1). Zawiesiny komórek umieścić na lodzie na 90 minut.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Dodaj 10 ml PBS, aby umyć granulkę 2x.</li>
	<li>Dodać 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) do PBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dodaj ten roztwór DAPI do osadu komórkowego, aby uzyskać zawiesinę komórek o stężeniu 107 komórek/ml (używając numerów komórek z kroku 2.4).</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez nasadki sitkowe 35 μm do probówek polistyrenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm.</li>
	<li>Użyj cytometru przepływowego, aby posortować subpopulację TIC HLA-1-ujemną6. Bramkować żywe komórki (DAPI-ujemne) i zbierać zarówno HLA-ujemne, jak i -dodatnie subpopulacje do dwóch probówek zbiorczych o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 4 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640.</li>
</ol>
3. Charakterystyka komórek inicjujących nowotwór
<ol>
	<li>Powstawanie sarkosfery
	<ol>
		<li>Zrób pożywkę do wzrostu sarkosfery, używając pożywki do hodowli komórek alfa-MEM. Dodaj suplementy, aby uzyskać końcowe stężenie suplementów B-27 (1x), suplementów N2 (1x), podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (20 ng / ml) i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (20 ng / ml) i penicyliny / streptomycyny (100 IU / ml). Przed użyciem przefiltrować pożywkę za pomocą filtra do hodowli komórkowych 0,2 μm.</li>
		<li>Zebrać posortowaną subpopulację HLA-1-ujemną i -dodatnią z kroku 2.9 i policzyć liczbę komórek każdej subpopulacji.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1,5 x 106 komórek w 15 ml pożywki wzrostowej sarkosfery, aby rozcieńczyć komórki 1 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Seryjnie rozcieńczyć komórki świeżą pożywką wzrostową sarkosfery, aby uzyskać 15 ml z każdej komórki rozcieńczenia 10,4, 10,3 i 10,2 komórek/ml. Następnie przygotuj cztery 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyłączeniu, każda do rozcieńczenia komórek.</li>
		<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej z rozcieńczenia 10 5 komórek/ml do każdej studzienki pierwszej 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyłączeniu. Ta płytka ma 104 komórek w każdym dołku.</li>
		<li>Użyj pozostałych trzech 96-dołkowych płytek do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie do pozostałych trzech rozcieńczeń komórek: 104, 103 i 102 komórki/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyczepie. Te trzy płytki hodowlane mają odpowiednio 1,000 komórek / dołek, 100 komórek / dołek i 10 komórek / dołek.</li>
		<li>Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Dodawać nowe bFGF i EGF bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej (końcowe stężenie 20 ng/ml) co trzy dni bez zmiany pożywki, aby uniknąć utraty komórek w hodowli zawiesinowej.</li>
		<li>Używając mikroskopu świetlnego, monitoruj formowanie się sarkosfery codziennie przez trzy tygodnie, jak pokazano na Rysunek 2A.</li>
		<li>Po trzech tygodniach policz liczbę dołków sarkosfero-dodatnich i dołków ujemnych sarkosfery w każdym rozcieńczeniu komórek zarówno dla komórek HLA-1-ujemnych, jak i HLA-1-dodatnich.</li>
		<li>Oblicz częstość komórek tworzących sferę na podstawie rozkładu prawdopodobieństwa Poissona13. Porównaj HLA-1-ujemne TIC z HLA-1-dodatnimi komórkami masowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test tworzenia się guza w seryjnym rozcieńczeniu
	<ol>
		<li>Policz subpopulacje HLA-1-ujemne i -dodatnie z kroku 2.9.</li>
		<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia komórek PBS do stężeń 106, 105, 104 i 103 komórek/ml. Użyj 1 ml każdego rozcieńczenia do tworzenia guza u 10 myszy.</li>
		<li>Dodać 1 ml matrycy błony podstawnej do zawiesiny komórek o objętości 1 ml z każdego rozcieńczenia (1:1). Trzymaj 2 ml każdej mieszaniny na lodzie.</li>
		<li>Podskórnie wstrzyknąć 200 μl mieszaniny macierzy komórka: błona podstawna na boki myszy NGS, używając komórek HLA-1-ujemnych na jednym boku i komórek HLA-1-dodatnich na drugim boku tej samej myszy. Do każdego rozcieńczenia użyj 10 myszy. Do wstrzykiwań należy używać strzykawek 25G z igłą.</li>
		<li>Monitoruj powstawanie guza u myszy przez cztery do ośmiu tygodni, w zależności od tempa wzrostu guza.</li>
		<li>Oblicz częstość komórek inicjujących nowotwór przez procent powstawania guza przy różnych liczbach komórek wejściowych. Porównaj HLA-1-ujemne TIC z HLA-1-dodatnimi komórkami masowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukowane różnicowanie wzdłuż szlaków mezenchymalnych
	<ol>
		<li>Użyj sarkosfer utworzonych w poprzednich krokach (krok 3.1.9). Przenieś sarkosfery na nową 6-dołkową płytkę. Hoduj sarkosferę z 2,5 ml alfa-MEM uzupełnionym 10% FBS, aby komórki mogły przyczepić się do powierzchni płytki hodowlanej.</li>
		<li>Po przyłączenia przez dwa dni zmień pożywkę hodowlaną z alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS na mieszaninę 1:1 alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS i pożywką wzrostową ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC).</li>
		<li>Po dwóch dniach zmień na kompletną pożywkę wzrostową hMSC.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, odessać pożywkę hMSC i dodać pożywkę różnicującą. W celu różnicowania kościogennego dodać pożywkę do różnicowania osteogennego (pożywka wzrostowa hMSC uzupełniona 10 nM deksametazonem, 5 mM β-glicerofosforanu, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego i 10 mM chlorku litu). W celu różnicowania lipogennego dodać pożywkę do różnicowania adipocytów (pożywka wzrostowa hMSC uzupełniona 0,5 μM deksametazonem, 0,5 μM izobutylometyloksantyny i 50 μM indometacyny).</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę różnicującą co trzy dni.</li>
		<li>Po trzech do czterech tygodniach przerwij różnicowanie i umyj komórki PBS. Następnie odessaj PBS i dodaj 2 ml 10% formaliny do komórek w celu utrwalenia. Pozostaw komórki na 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj je wodą dejonizowaną. Komórki są teraz gotowe do barwienia czerwienią Alizaryny S (krok 3.3.6.1) lub barwienia czerwienią olejową O (krok 3.3.6.2).
		<ol>
			<li>Aby wykryć różnicowanie osteogenne, należy wykonać barwienie czerwienią S alizaryny. Odessać wodę i dodać 2 ml roztworu roboczego Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6,0) do komórek i pozostawić je na 5 minut w celu barwienia. Umyj komórki wodą dejonizowaną i obserwuj reakcję pod mikroskopem.</li>
			<li>Aby wykryć różnicowanie adipogenne, należy wykonać barwienie czerwienią olejową O.
			<ol>
				<li>Przygotuj roztwór czerwieni olejowej O. Przygotować roztwór podstawowy, dodając 300 mg proszku Oil Red O do 100 ml izopropanolu.</li>
				<li>W ciągu 2 godzin przed użyciem wymieszać trzy części (30 ml) roztworu podstawowego Oil Red O z dwiema częściami (20 ml) wody dejonizowanej. Pozostaw mieszaninę na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
				<li>Przefiltruj roztwór roboczy przed użyciem.</li>
				<li>Usunąć wodę z komórek przygotowanych zgodnie z krokiem 3.3.6. Dodaj 2 ml 60% izopropanolu, aby pokryć monowarstwę komórek, a komórki pozostają przez 2 minuty.</li>
				<li>Usuń izopropanol i dodaj 2 ml roztworu roboczego Oil Red O. Pozostaw komórki na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
				<li>Opłucz komórki wodą dejonizowaną i obserwuj reakcję pod mikroskopem świetlnym.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka krytycznych etapów, które ograniczają powodzenie tego protokołu w celu wyizolowania i scharakteryzowania komórek inicjujących nowotwór z ludzkich mięsaków PDX. Mięsak ludzki obejmuje wiele różnych podtypów. Zaobserwowaliśmy, że powstawanie PDX jest silnie zależne od podtypów mięsaków. Kliniczne agresywne mięsaki o histologicznie niezróżnicowanym fenotypie (np. pleomorficzne mięsaki niezróżnicowane [wskaźnik sukcesu 100%, n = 2], niezróżnicowane tłuszczakomięsaki [wskaźnik sukcesu 100%, n = 2] i mięsaki maziowe [wskaźnik sukcesu 100%, n = 3]) mają wysoki wskaźnik powodzenia w tworzeniu PDX. Tymczasem mięsaki o zróżnicowanych fenotypach (np. dobrze zróżnicowane tłuszczakomięsaki [wskaźnik sukcesu 0%, n = 3]) wykazują niższe wskaźniki tworzenia PDX. Możliwe, że komórki inicjujące nowotwór są obecne w bardziej złośliwych podtypach w większym procencie niż w mniej złośliwych, zróżnicowanych podtypach. Ponadto zalecamy zakończenie procedury izolacji komórek inicjujących nowotwór w ciągu jednego dnia bez żadnej przerwy, aby zminimalizować utratę żywotności komórek.
Stwierdziliśmy, że komórki HLA-1-ujemne występują powszechnie w mięsakach ludzkich. Ale procent komórek HLA-1-ujemnych może się różnić w zależności od próbek od różnych pacjentów. Dzięki tej metodzie udało nam się wyizolować komórki inicjujące nowotwór z próbek, które zawierają komórki HLA-1-ujemne w zakresie od mniej niż 0,5% do ponad 30%12. Ważne jest, aby funkcjonalnie scharakteryzować komórki HLA-1-ujemne poprzez tworzenie kul i testy tworzenia guza, aby potwierdzić tożsamość komórek inicjujących nowotwór izolowanych komórek HLA-1-ujemnych.
Prezentowany tutaj protokół ma jednak również ograniczenia. Wcześniejsze dane wykazały, że ekspresja HLA-1 jest regulowana epigenetycznie, co jest zgodne z obserwacją niejednorodności komórkowej ekspresji HLA-1 w obrębie tego samego guza12. Mutacje genomowe HLA-1 wykryto w mięsakach i innych typach nowotworów. Mutacje w genach HLA-1 mogą prowadzić do całkowitej utraty HLA-1 na powierzchni komórki w całym guzie lub do ekspresji niefunkcjonalnego zmutowanego HLA-1. W obu przypadkach negatywność HLA-1 nie może być wykorzystana do identyfikacji TIC w guzie.
Używając HLA-1 jako markera ujemnego, z powodzeniem wyizolowaliśmy TIC z różnych podtypów mięsaka ludzkiego i zweryfikowaliśmy nasze wyniki za pomocą analizy funkcjonalnej. W związku z tym byliśmy w stanie przeprowadzić badania molekularne, w tym analizę ekspresji genów na TICs, w celu opracowania specyficznego leczenia ukierunkowanego na te TICs.

Wewnątrznowotworowa heterogeniczność komórkowa nowotworów u ludzi została poparta rosnącą liczbą dowodów w ciągu ostatniej dekady1. Podobnie jak normalna tkanka, tkanka rakowa składa się z niewielkiej subpopulacji TIC (zwanych również rakowymi komórkami macierzystymi), które wykazują zdolność do tworzenia guza; Tymczasem większość komórek rakowych wykazuje zróżnicowane fenotypy<klasa SUP = "xref">2. Te TIC wykazują właściwości podobne do komórek macierzystych, w tym ekspresję markera komórek macierzystych oraz zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i asymetrycznego podziału komórek, a zatem mogą inicjować tworzenie komórkowego heterogenicznego nowotworu3. Ostatnie badania wykazały, że TIC są nie tylko odpowiedzialne za inicjację nowotworu, ale są również związane z agresywnością guza4, metastasis5 i lekooporność6. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć biologię TIC, a tym samym opracować specyficzną strategię leczenia ukierunkowaną na te TIC.
Metody oparte na FACS zostały użyte do identyfikacji TIC za pomocą znaczników TICs, w tym CD133, CD24 i CD441. Większość z tych markerów ulega również ekspresji w normalnych komórkach macierzystych7. Jednak żaden z tych markerów nie oznacza wyłącznie TIC. Rola, jaką te cząsteczki odgrywają w złośliwości TIC, nadal nie jest jasna. Na przykład, CD133 może być często inaktywowany przez metylację DNA, a zatem ta międzynowotworowa heterogeniczność może sprawić, że dokładność tych markerów będzie miała znaczenie8. ALDH1 jest markerem, który również działa w celu utrzymania macierzystej TICs9. Wydaje się, że jest bardziej skuteczny w identyfikacji TIC raka piersi, ale nadal jest wątpliwy w przypadku innych typów nowotworów9. Niektóre szlaki sygnałowe odgrywają ważną rolę w biologii komórek macierzystych, w tym Wnt (miejsce integracji związane z bezskrzydłymi), TGF-β (transformujący czynnik wzrostu beta) i Hedgehog1. Trudno jest jednak udowodnić, że szlaki te są specyficzne dla TIC i wykorzystać aktywność tych szlaków do wyizolowania TIC z guzów pierwotnych. W związku z tym pilnie potrzebny jest niezawodny nowy marker TIC.
Ludzki MHC klasy I, zwany także HLA-1, jest białkiem powierzchniowym komórki wyrażającym się w prawie wszystkich komórkach jądrzastych10. HLA-1 funkcjonuje jako antygen prezentujący cząsteczkę, która jest specyficznie rozpoznawana przez limfocyty T CD810. Cytotoksyczne działanie limfocytów T CD8 może być aktywowane, gdy komórki rakowe prezentują antygen nowotworowy przez HLA-1. Dlatego brak HLA-1 na powierzchni komórek nowotworowych może prowadzić do ucieczki immunologicznej z cytotoksycznych limfocytów T CD8. Obniżenie poziomu HLA-1 zostało opisane w różnych typach nowotworów u ludzi i jest skorelowane ze złym rokowaniem, przerzutami i opornością na leki11. Wykazaliśmy, że utrata ekspresji HLA-1 na powierzchni komórki może być wykorzystana do identyfikacji TIC w mięsakach, a także w raku prostaty6,12.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji TIC z ludzkich mięsaków PDX za pomocą FACS, używając HLA-1 jako markera ujemnego, oraz dalszego walidacji i charakteryzowania tych HLA-1-ujemnych TICs.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m filtr do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka polistyrenowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych o bardzo niskim przyłączeniu</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało HLA-1-PE</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>pożywka wzrostowa hMSC</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>indometacyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>izobutylometyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>chlorek litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matryca membrany podstawnej</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NSG</td><td>Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Istnienie i znaczenie komórek inicjujących nowotwór (TIC) zostało poparte coraz większą ilością dowodów w ciągu ostatniej dekady. Wykazano, że te TIC są odpowiedzialne za inicjację guza, przerzuty i oporność na leki. Dlatego ważne jest, aby opracować specyficzną terapię ukierunkowaną na TIC jako dodatek do obecnych strategii chemioterapii, które koncentrują się głównie na większości pacjentów niebędących TIC. Aby lepiej zrozumieć mechanizm stojący za złośliwością TICs, opisujemy metodę izolacji i charakterystyki TIC w mięsakach ludzkich. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) ludzkich mięsaków oraz izolowania TIC przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytarnego klasy I (HLA-1) jako markera ujemnego. Opisujemy również, jak funkcjonalnie scharakteryzować te TIC, w tym test tworzenia kuli i test tworzenia guza, oraz indukować różnicowanie wzdłuż szlaków mezenchymalnych. Izolacja i charakterystyka TIC PDX dostarczają wskazówek do odkrycia potencjalnych odczynników terapii celowanej. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że protokół ten może być dalej rozszerzany w celu izolowania i charakteryzowania TIC z innych typów nowotworów u ludzi.

Wygenerowano i zabarwiono ludzki model PDX mięsaka. Heterogeniczność wewnątrznowotworową wykazano za pomocą immunohistochemii z użyciem przeciwciała HLA-1. Ksen przeszczep składał się z dwóch odrębnych subpopulacji, mianowicie HLA-1 dodatniej i ujemnej (Rycina 1A)12. PDX mięsaka wykazywał podobieństwa histologiczne do macierzystego guza pierwotnego (Rycina 1A). TICs z PDX mięsaka wyizolowano za pomocą metody FACS. Stosując metodę podwójnego sortowania, znacznie wzbogacono populację komórek HLA-1-ujemnych z populacji komórek macierzystych (Rycina 1B)12.
Stwierdzono, że geny wyrazone w komórkach macierzystych (np. Oct4, Nanog oraz Myc) wykazują wysoką ekspresję w wyizolowanych komórkach HLA-1-ujemnych w porównaniu do ich odpowiedników HLA-1-dodatnich (Rycyna 1C). Sox-9, gen rozwojowy, o którym wiadomo, że odgrywa istotną rolę w innych komórkach macierzystych nowotworów, takich jak w raku piersi, był specyficznie wyrazony w komórkach HLA-1-ujemnych (Rycina 1D).
W celu walidacji wyizolowanej subpopulacji HLA-1-ujemnej przeprowadzono test formowania sarkosfer, aby zbadać zdolność komórek do samoodnawiania. Komórki HLA-1-ujemne były w stanie tworzyć sfery przy początkowej liczbie zaledwie 10 komórek (Rycina 1E)12. Aby zbadać zdolność do tworzenia nowotworów, wykonano test tworzenia guzów z seryjnym rozcieńczeniem. Taka sama liczba komórek HLA-1-ujemnych i -dodatnich została wstrzyknięta podskórnie w każdy bok tej samej myszy. Komórki HLA-1-ujemne wykazały znacznie wyższą zdolność do tworzenia nowotworów (Rycina 1F)12, podczas gdy ksenoprzeszczepy utworzone przez obie subpopulacje, HLA-1-ujemną i -dodatnią, były nowotworami heterogennymi komórkowo (Rycina 1H).
Przeprowadziliśmy analizę ekspresji genów wyizolowanych TIC-ów negatywnych pod kątem HLA-112. Geny związane z prawidłowym różnicowaniem komórek mezenchymalnych były podwyższone w TIC-ach12. W związku z tym zbadaliśmy również, czy TIC-y HLA-1 można zindukować do różnicowania terminalnego, co doprowadzi do zmniejszenia zdolności do tworzenia guzów. Wyniki wykazały, że komórki negatywne pod kątem HLA-1 mogą ulegać różnicowaniu zarówno na drodze lipogennej, jak i osteogennej, wykazując silne barwienie Oil Red O oraz Alizarin Red S (Rysunek 1G). Z kolei komórki pozytywne pod kątem HLA-1 nie różnicują się w tych samych warunkach. Wyniki te wskazują zatem na obiecującą strategię terapii różnicującej, która może być wykorzystana do celowania w TIC-i mięsaka.
<img alt="Analiza ekspresji HLA-I; obrazy mikroskopowe (barwienie H&amp;E, barwienie HLA-I) oraz wykresy danych z cytometrii przepłyewej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja komórek HLA-1-ujemnych z wewnątrznowotworowych heterogennych PDX mięsaka. (A) Komórki HLA-1-ujemne (strzałki) stwierdzono w różnych podtypach mięsczaków u ludzi za pomocą immunohistochemii (IHC). (a i b) Mięszak jasnokomórkowy. (c i d) Pleomorficzny mięszak tłuszczowy. (e i f) Mięszak gładkokomórkowy. (g i h) Złośliwy guz pochewki nerwu obwodowego. (i i j) Mięsak tłuszczowy, nieokreślony. (k i l) Odróżnicowany mięsak tłuszczowy. Pasek skali = 100 µm. (B) Modele PDX mięsaka były histologicznie podobne do guza macierzystego (hematoksylina i eozyna [H&amp;E] barwienie) oraz wykazały heterogeniczność komórkową w ekspresji HLA-1 w badaniu IHC. Przedstawione są reprezentatywne obrazy PDX mięszaków, w tym mięsza komórkowego (CCS), odróżnicowanego chrzęstniakomięsaka (DCS) oraz odróżniczonego tłuszczakomięsaka (DDL). Pasek skali = 100 µm. (C) Subpopulacja komórek HLA-1-ujemnych została wyizolowana za pomocą cytometrii przepływowej z zastosowaniem metody podwójnej sortowności. Od góry do dołu: pierwszy sort, drugi sort oraz kontrola czystości. Wyizolowane komórki HLA-1-ujemne i HLA-1-dodatnie poddano dalszej analizie funkcjonalnej, w tym testowi tworzenia guzów. Wyniki przedstawione na tej rycince pochodzą z poprzedniej publikacji.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tworzenie sfer przez HLA-I, badanie na myszach, poziomy mRNA, barwienie histologiczne, obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka TICs negatywnych pod kątem HLA-1 za pomocą testów funkcjonalnych. (A) Test tworzenia sfer wykazał, że zaledwie 10 komórek HLA-1-ujemnych było w stanie utworzyć sfery mięsaka. Po lewej: reprezentatywne zdjęcia sfer mięsaka. Po prawej: częstotliwość tworzenia sfer; średnia ± SD. Pasek skali = 100 µm. (B) Komórki HLA-1-ujemne wyizolowane z modelu PDX mięsaka wykazały wysoką zdolność do tworzenia guzów. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia guzów powstałych z komórek HLA-1-ujemnych i -dodatnich z DDL. Tysiąc komórek HLA-1-ujemnych oraz tysiąc komórek HLA-1-dodatnich DDL wstrzyknięto w oddzielne boki tej samej myszy. (C) Poziomy mRNA genów komórek macierzystych Oct4, Nanog, i Myc wykazano na wyższym poziomie w komórkach HLA-1-ujemnych w porównaniu do komórek HLA-1-dodatnich. Dane przedstawiają średnią ± SD (n = 5). (DSilne pozytywne barwienie Oil Red O oraz Alizarin Red S wskazuje na różnicowanie końcowe wzdłuż szlaków lipogennych i osteogennych, indukowanych z komórek inicjujących guza (TICs) mięsaka.E) Immunobarwienie HLA-1 w modelach PDX utworzonych przez subpopulacje HLA-1-dodatnie (lewo) i -ujemne (prawo). Pasek skali = 100 µmWyniki przedstawione na tym rysunku pochodzą z wcześniejszej publikacji.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Odkryliśmy, że HLA-I jest epigenetycznie regulowany w dół w subpopulacji komórek nowotworowych, które wykazują właściwości komórek macierzystych i zdolność inicjowania nowotworu. Regulacja w dół HLA-I jest bezpośrednio związana z ucieczką immunologiczną, zapewniając przewagę w przeżywalności nowotworowym komórkom macierzystym, co sprawia, że ujemność HLA-I jest dokładnym markerem funkcjonalnym dla tych komórek. Procedurę zademonstruje Sudeh Izadmehr, doktor habilitowany z naszego laboratorium.Po pobraniu próbki umieść tkankę na 100-milimetrowej szalce Petriego w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj do naczynia 500 mikrolitrów sterylnego PBS. Użyj sterylnego skalpela, aby mechanicznie rozbić tkankę na małe kawałki, aż żaden fragment nie będzie większy niż 0,1 milimetra. Przenieś całą objętość PBS o pojemności 500 mikrolitrów przez sitko do komórek porowych o średnicy 35 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj kolejne 500 mikrolitrów PBS do fragmentów tkanek i ponownie zmielić tkanki. Następnie przefiltrować supernatant przez sitko do komórek do tej samej probówki zbiorczej i kontynuować mielenie kawałków tkanki, aż próbka zostanie całkowicie zdysocjowana. Po zebraniu ostatniej objętości komórek należy odwirować komórki nowotworowe przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do hemolizy.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zbierz komórki za pomocą kolejnego odwirowania i umyj granulki kolejnymi pięcioma mililitrami PBS. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS i policzyć żywe komórki. Rozcieńczyć komórki do 10 do siódmych komórek na 200 mikrolitrów stężenia PBS na lodzie i dodać 200 mikrolitrów macierzy błony podstawnej do komórek, delikatnie mieszając.Następnie wstrzyknij podskórnie macierz błony zawiesinowej zawiesiny komórkowej w bok myszy gamma NOD scid i sprawdzaj wzrost guza w miejscu wstrzyknięcia dwa razy w tygodniu. Gdy guz osiągnie średnicę jednego centymetra, przetnij guz na pół i przymocuj połowę ksenoprzeszczepu za pomocą 4% paraformaldehydu przez noc do analizy histologicznej. Przetwórz drugą połowę guza, jak właśnie pokazano, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, i rozcieńczyć komórki do dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr PBS uzupełnionego stężeniem 5% FBS.Utrzymuj komórki na lodzie przez 30 minut przed podzieleniem zawiesiny komórek między jedną kontrolną izotyp i jedną probówkę z przeciwciałem. Zanotować liczbę komórek w każdej probówce i zmieszać komórki w probówce z przeciwciałem anty-HLA, a komórki w probówce kontrolnej z odpowiednim przeciwciałem kontrolnym anty-izotypu przez 90-minutową inkubację na lodzie. Pod koniec inkubacji zbierz obie populacje komórek przez odwirowanie, a następnie dwa 10-mililitrowe płukania PBS przez odwirowanie.Po drugim praniu ponownie zawiesić granulki w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr DAPI do stężenia jeden razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Następnie przefiltruj każdą zawiesinę komórek przez sitko porowe o długości 35 mikrometrów do pojedynczych rurek polistyrenowych o wymiarach 12 na 75 milimetrów. Po sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją rozcieńczyć HLA-I-ujemne i dodatnie populacje komórek, aby uzyskać indywidualne stężenia komórek jeden razy 10 do piątych w 15 mililitrach pożywki wzrostowej sarkosfery na podzestaw.Seryjnie rozcieńczyć komórki do stężeń jeden razy 10 do czwartego, 10 do trzeciego i 10 do drugiego w 15 mililitrach świeżej pożywki wzrostowej sarkosfery na rozcieńczenie i dodać 100 mikrolitrów komórek z każdego rozcieńczenia do każdej studzienki jednej 96-dołkowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie na rozcieńczenie. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, codziennie monitorując tworzenie się sarkosfery za pomocą mikroskopii świetlnej i dodając świeży podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i naskórkowy czynnik wzrostu do każdej studzienki bez zmiany pożywki co trzy dni. Po trzech tygodniach policz liczbę dołków z dodatnim i ujemnym wynikiem sarkosfery dla każdego rozcieńczenia komórek zarówno HLA-I-ujemnych, jak i HLA-I-dodatnich, aby umożliwić obliczenie częstości tworzenia komórek sferycznych na podstawie rozkładu prawdopodobieństwa Poissona.Zazwyczaj ksenoprzeszczepy mięsaka pochodzące od pacjentów składają się z dwóch odrębnych populacji HLA-I-dodatnich i ujemnych, o podobnej histologii do tej, którą wykazuje macierzysty guz pierwotny. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek komórek inicjujących ksenoprzeszczep pochodzących od pacjenta z mięsakiem, jak wykazano, ułatwia wzbogacenie dużej liczby komórek HLA-I-ujemnych z populacji komórek rodzicielskich. Komórki HLA-I-ujemne są w stanie tworzyć kule przy początkowym wprowadzeniu zaledwie 10 komórek i wykazują wyższą zdolność tworzenia guza niż komórki inicjujące ksenoprzeszczep u pacjenta z mięsakiem HLA-I-dodatnim.Wstrzyknięcie tej samej liczby komórek HLA-I ujemnych i dodatnich podskórnie w przeciwległe boki tej samej myszy pokazuje, że komórki HLA-I-ujemne mają znacznie wyższą zdolność do tworzenia guza. Podczas gdy ksenoprzeszczepy utworzone zarówno przez subpopulacje HLA-I, ujemne, jak i dodatnie, są nowotworami niejednorodnymi komórkowo. Co więcej, analiza ekspresji genów w komórkach inicjujących nowotwór ujawnia, że komórki HLA-I-ujemne wyrażają markery różnicowania komórek macierzystych i mogą być indukowane do różnicowania się zarówno wzdłuż szlaków lipogennych, jak i osteogennych, wykazując silne barwienie i hodowlę Oil-Red-O i Alizarin-Red-S.Metoda ta może być stosowana do izolowania nowotworowych komórek macierzystych w różnych nowotworach u ludzi. Karbonizacja molekularna, na przykład poprzez sekwencjonowanie nowej generacji, może ujawnić wspólne markery do terapeutycznego celowania w komórki. Nasze odkrycie pokazuje, że przywrócenie HLA-I jest kluczowym krokiem dla powodzenia strategii augmentacji komórek odpornościowych jednostek funkcjonalnych.

isolation-characterization-tumor-initiating-cells-from-sarcoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Ten protokół opisuje powtarzalną metodę izolacji komórek pierwotnych mięsaka prążkowanokomórkowego u myszy, tworzenia i leczenia guza oraz przeszczepu allogenicznego, zaczynając od hodowli guzów.

Wyprowadzanie i leczenie guza z pierwotnych komórek nowotworowych wyizolowanych z mięsaków prążkowanokomórkowych myszy

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Poznaj izolację komórek inicjujących nowotwór z mięsaka przy użyciu sortowania FACS i markera HLA-I. Ta metoda umożliwia identyfikację komórek macierzystych nowotworu o właściwościach inicjujących nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Przeglądaj więcej filmów