Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla mózgów larw Drosophila do wielodniowej poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenetyki Drosophila, takie jak zmiany ekspresji genów, które zachodzą w określonych populacjach neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie sond fluorescencyjnych z rozdzielczością pojedynczej komórki w żywym mózgu w ciągu kilku godzin lub dni.

Przygotowując odczynniki do tej procedury, pracuj pod kapturem hodowlanym. Zarówno podwielokrotność pożywki SAM, jak i trombiny muszą zostać rozmrożone, aby rozpocząć. Odłóż trombinę.

Weź 2,5 mililitrową porcję SAM, a pozostałą część SAM połóż na lodzie i odłóż na bok. Następnie umieść penicylinę streptomycynę w podzielonym SAM i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałych eksperymentów obrazowych przygotuj komorę obrazowania, nałóż autoklawowany smar próżniowy na plastikowe obszary wokół studzienki naczynia ze szklanym dnem.

Następnie wysterylizuj natłuszczone naczynie światłem UV pod maską. Teraz wymieszaj porcję SAM z fibrynogenem i przenieś mieszaninę do 37 stopni Celsjusza, gdzie nie będzie polimeryzować przez dwie godziny. Do sekcji wyczyść kleszcze w dwóch trzydołkowych szklanych naczyniach preparacyjnych z 70% etanolem.

Następnie załaduj cztery studzienki 400 mikrolitrami DSS i jedną studzienkę 400 mikrolitrami SAM. Trzymaj naczynia do sekcji na schłodzonym talerzu. Z fiolki z rozmnażającymi się muchami zgarnij pożywkę zawierającą niewędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego i przenieś do siedmiu za pomocą kleszczy do studni z zimnym DSS.

Następnie przepuść larwy przez trzy z czterech studzienek załadowanych DSS, aby je oczyścić. Pozostaw je w ostatniej studzience, aż zostaną wypreparowane. Użyj czwartej studzienki DSS, aby wypreparować mózgi larw za pomocą pary czystych, cienkich kleszczy.

Użyj sprawdzonej metody inside-out. Przy wprawie każdą larwę można przetworzyć w około 30 sekund. Po każdej sekcji użyj końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, wstępnie przepłukanej DSS, aby przenieść mózg w około trzech mikrolitrach DSS do dobrze wypełnionego SAM.

Przygotuj do siedmiu mózgów do procedury osadzania. Po przeniesieniu mózgu do roztworu roboczego, dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Następnie dodaj kolejne 3,5 mikrolitra SAM z antybiotykami i dodaj 3,5 mikrolitra ciepłego SAM z fibrynogenem.

Ważne jest, aby przez cały czas trwania zabiegu utrzymywać pożywkę SAM z fibrynogenem w temperaturze 37 stopni. Następnie wymieszaj roztwór wokół mózgu, delikatnie pipetując tą samą końcówką pipety i odessaj dwa mikrolitry roztworu, aby umieścić go na szkiełku nakrywkowym do naczynia ze szklanym dnem. Następnie dodaj 0,8 mikrolitra trombiny do kropli i bardzo szybko wymieszaj, aby zainicjować polimeryzację, która będzie wyglądać na białą.

Następnie za pomocą kleszczy delikatnie wybierz mózg i umieść go na polimeryzującej matrycy fibryny. Myślę, że trombina, po przeniesieniu mózgu do kropelki, nie jest zalecana, ponieważ bardzo komplikuje procedurę. Zorientuj mózg w razie potrzeby i bardzo delikatnie popchnij mózg jak najbliżej szkiełka nakrywkowego.

Następnie wybierz warstwę spolimeryzowanej fibryny i złóż ją na mózgu, wykonując małe i delikatne ruchy, które nie odrywają matrycy. Kontynuuj składanie warstw spolimeryzowanej fibryny nad mózgiem z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg. Następnie umieść 20 mikrolitrów SAM z antybiotykami na osadzonym mózgu, aby zatrzymać aktywność trombiny.

Korzystając z tej procedury, kontynuuj osadzanie pięciu do sześciu mózgów na naczyniu ze szklanym dnem. W przypadku długotrwałego obrazowania zanurz osadzone mózgi w 600 mikrolitrach SAM z antybiotykami. Następnie połóż kawałek membrany PTFE na podłożu i przyklej krawędzie membrany do natłuszczonych części naczynia.

W przypadku krótkich testów napełnij naczynie dwoma mililitrami SAM antybiotykami, zanurzając mózg i pomijając użycie membrany PTFE. Korzystając z opisanych procedur, mózgi wyrażające reporter zegara molekularnego sterowany przez sterownik neuronów zegarowych, zostały porwane w ciemności światła, a następnie przygotowane jako kultury eksplantatów. Długoterminowe hodowle zakładano w fazie światła, tuż przed zmrokiem.

Stos SUM zawierający neuron będący przedmiotem zainteresowania został utworzony w średnim natężeniu fluorescencji obszaru odpowiadającego neuronowi, mierzono po odjęciu tła. Do określenia rytmiczności ekspresji reporterowej zastosowano zarówno analizę spektralną maksymalnej entropii, jak i inspekcję manualną. Następnie larwy o tym samym genotypie zostały wypreparowane albo godzinę po subiektywnym świcie, albo godzinę po subiektywnym zmierzchu.

Mózgi zostały zobrazowane dwa razy w ciągu godziny, aby uzyskać punkt odniesienia. Następnie do pożywki hodowlanej dodano plik PDF lub nośnik, a mózgi obrazowano co godzinę przez sześć godzin. W mózgach pobranych krótko po zmroku profil ekspresji PER-TDT w LNvs wykazał zależny od pory dnia wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu PDF.

Miało to miejsce również w DN1 i w mniejszym stopniu w DN2. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić hodowlę mózgu ex vivo z larw Drosophila przy użyciu matrycy 3D fibryny. Po opanowaniu cała procedura trwa około 30 minut, od sekcji do osadzenia.

Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować zestaw do obrazowania, aby mózg mógł zostać zobrazowany natychmiast po osadzeniu. Po tej procedurze dorosłe mózgi Drosophila mogą być również hodowane w celu fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.