Name: Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę hodowli mózgów larw Drosophila w macierzy fibrynowej do wielodniowego obrazowania fluorescencji zegarów okołodobowych w rozdzielczości pojedynczej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Michaelowi Rosbashowi za jego mentoring i wsparcie podczas początkowej fazy rozwoju tej metody. Prace te zostały sfinansowane przez program JST PRESTO, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (31003A_149893 i 31003A_169548), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-StG-311194), Fundację Novartis na rzecz Badań Medyczno-Biomedycznych (13A39) oraz Uniwersytet Genewski.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych pod kapturem hodowlanym
<ol>
	<li>Przygotuj 400 ml 1x Schneider Active Medium (SAM) zoptymalizowanego pod kątem hodowli ex vivo mózgów larw (zmodyfikowane z odniesienia24,25) (Tabela 1). Podwielokrotność do 5 ml i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie (LN2), przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1x roztwór soli fizjologicznej do preparowania (DSS), rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (zmodyfikowany z reference26) (Tabela 2).</li>
	<li>Podwielokrotność fibrynogenu do 10 mg i przechowywać w temperaturze 4 °C do jednorazowego użytku. 
	Uwaga: Zważ fibrynogen pod przepływem laminarnym, w rękawiczkach, ponieważ jest szkodliwy.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy trombiny w SAM (1500 NIH jednostki/mg) i podwielokrotności do 10 μl, błyskawicznie zamrozić w LN2 i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z trombiną należy nosić rękawice, ponieważ jest ona szkodliwa.</li>
	<li>Podwielokrotny roztwór podstawowy 100x penicylina-streptomycyna. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wytnij kółka membrany politetrafluoroetylenowej (PTFE) (patrz tabela materiałów) do rozmiaru, który pasuje do wnętrza naczynia ze szklanym dnem. Opłucz je w 70% EtOH, a następnie w autoklawizowanym dH2O. Wysterylizuj i wysusz pod wpływem laminarnym promieniowaniem UV. Przechowywać na sterylnej szalce Petriego. Jednorazowego użytku. 
	UWAGA: PTFE to porowata, elastyczna membrana, która umożliwia wymianę gazową i zapobiega parowaniu medium podczas długotrwałego nagrywania.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopii poklatkowej
UWAGA: Poniższa konfiguracja dotyczy odwróconego mikroskopu konfokalnego ze skanerem tandemowym (patrz Tabela Materiałów) wyposażonego w skaner rezonansowy (8 000 Hz). System zawiera bardzo czuły detektor fotopowielaczy, który wraz ze skanerem rezonansowym zapobiega fototoksyczności i fotowybielaniu. Temperatura i wilgotność są kontrolowane w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz tabela materiałów), która obejmuje większą część mikroskopu.
<ol>
	<li>Umieść komorę wilgotnościową na górze sceny.</li>
	<li>Włącz regulatory temperatury i wilgotności, aby zrównoważyć komorę mikroskopu do 25 °C i 80% wilgotności.</li>
	<li>Aby przeprowadzać eksperymenty w ciągłej ciemności (DD), przykryj komorę środowiskową mikroskopu nieprzezroczystą szmatką (chyba że komora mikroskopu jest wykonana z nieprzezroczystego materiału).</li>
	<li>Jeśli używasz obiektywu do zanurzenia w wodzie, umieść mikrodozownik zanurzenia w wodzie na górze obiektywu i zaprogramuj protokół za pomocą oprogramowania Autoimmersion Objective Controller, aby dozować wodę ze stałą szybkością podczas obrazowania poklatkowego. 
	UWAGA: Obiektywy zanurzone w wodzie wraz z dozownikiem wody lub suchą soczewką obiektywową są zalecane do długotrwałego obrazowania na żywo, ponieważ inne rodzaje medium zanurzeniowego wyschłyby.</li>
	<li>Umieść uchwyt na szalkę Petriego na stoliku, wewnątrz komory wilgotnościowej.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie mikroskopu i wybierz tryb skanera rezonansowego w pierwszym oknie dialogowym. Wybierz przycisk OK, aby zainicjować etap po wyświetleniu monitu. Przejdź do zakładki Konfiguracja i do Konfiguracja sprzętowa, aby włączyć odpowiednie linie laserowe.</li>
	<li>Przejdź do zakładki Pobieranie i do panelu XY, aby wybrać tryb dwukierunkowy i ustawić parametry akwizycji obrazu. 
	UWAGA: Przedstawiony tutaj opisany układ obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i film 1) jest zoptymalizowany do obserwacji okołodobowej ekspresji określonych reporterów fluorescencyjnych. Następujące parametry zostały dobrane tak, aby jak najlepiej pasowały do naszych specyfikacji: obiektyw 40-krotny zanurzony w wodzie, 8-krotna średnia liniowa z rozdzielczością obrazu 512 × 512. W przypadku obrazowania wielobarwnego sekwencyjna akwizycja obrazu jest wymagana, gdy długość fali emisji jednego fluoroforu i długość fali wzbudzenia innego nakładają się na siebie (w tym przypadku długości fal emisji żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) i wzbudzenia pomidora nakładają się na siebie). Wybierz tryb sekwencyjny "pomiędzy stosem", ponieważ jest on najszybszy, a ruch neuronów zegarowych jest znikomy podczas pozyskiwania stosu Z. Ustawienia mikroskopii powinny być dostosowane do celu każdego eksperymentu.</li>
</ol>
3. Konfiguracja hodowli eksplantatów mózgu larwalnego
UWAGA: Cała procedura od sekcji do osadzenia eksplantatów mózgu zajmuje ~30 min.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników pod kapturem hodowlanym.
	<ol>
		<li>Rozmrozić porcję trombiny i przechowywać w temperaturze pokojowej aż do etapu zatapiania (etap 3.3). Jednorazowego użytku.</li>
		<li>Szybko rozmrozić porcję SAM w temperaturze 37 °C i przechowywać na lodzie przez jednorazowe użycie.</li>
		<li>Dodać SAM do 10 mg podwielokrotności fibrynogenu do 10 mg/ml, delikatnie strzepnąć i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut oraz podczas etapu zatapiania (etap 3.3). Jednorazowego użytku. 
		UWAGA: Nie inkubować roztworu fibrynogenu dłużej niż 2 godziny, gdy zaczyna polimeryzować.</li>
		<li>Rozmrozić porcję 100x zapasowej penicyliny-streptomycyny. Przygotuj 2,5 ml SAM zawierającego 1x penicylina-streptomycyna (SAM/antybiotyki). Przechowywać w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Przechowuj pozostałe 100x zapasu penicyliny-streptomycyny w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przygotować podwielokrotność 500 μl z pozostałego SAM. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>W przypadku długotrwałego obrazowania nałóż autoklawowany smar próżniowy na plastikową część dna szklanego naczynia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i sterylizuj pod wpływem laminarnego przepływu UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie ośrodkowego układu nerwowego i brzusznego rdzenia nerwowego.
	<ol>
		<li>Oczyść kleszcze i 2 x trzydołkowe szklane naczynia preparacyjne 70% EtOH. Wlej 400 μl DSS do 4 studzienek i 400 μl SAM do jednego dołka. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Zgarnij podłoże muchowe zawierające larwy i wybierz kleszcze niewędrujące larwy 3. stadium (L3). Opłucz je kolejno w 2 studzienkach wypełnionych DSS. Trzymaj je w 3. studzience wypełnionej DSS na lodzie, który znieczula larwy. 
		UWAGA: L3 wystarcza na około 2 dni w temperaturze 25 °C. Aby obserwować mózg w fizjologicznie istotnych ramach czasowych, zdecydowaliśmy się użyć niewędrujących larw L3. Inne podgrupy neuronów zegarowych, takie jak l-LNvs i DN3, zaczynają się tworzyć na etapie wędrówki L3, ale niekoniecznie jeszcze cyklicznie (dane nie pokazane). Dlatego, chociaż na tym etapie możliwe jest zobrazowanie cyklicznych neuronów zegarowych (dane nie pokazane), ważne jest, aby dokładnie odróżnić już funkcjonalne neurony zegara larwalnego od neuronów rozwijających się do analizy danych. Niewędrujące L3 pojawiają się około 4 do 4,5 dnia po złożeniu jaj w temperaturze 25 °C. Aby wykorzystać ten protokół do badania rytmów okołodobowych, należy zsynchronizować (porwać) rozwijające się larwy w 12 godzinnych/12-godzinnych cyklach LD w temperaturze 25 °C przez 3 dni przed pobraniem larw L3.</li>
		<li>Wypreparuj mózgi larw za pomocą cienkich kleszczy w czwartej studni wypełnionej DSS, która nie była używana do płukania larw, przy użyciu metody inside-out27.
		<ol>
			<li>Krótko przetnij larwę na dwie części, delikatnie ściśnij haczyki do ust parą kleszczy i zwiń na lewą stronę ściany ciała za pomocą drugiej pary kleszczy, odsłaniając w ten sposób mózg. Uwolnij mózg, wycinając wszystkie tchawice i nerwy, które łączą go z resztą ciała.</li>
			<li>Zassać mózg w około 3 μl DSS za pomocą pipety 20 μl (wstępnie przepłukanej DSS) i dozować do studzienki wypełnionej SAM. Powtórz procedurę dla maksymalnie 7 mózgów. 
			UWAGA: Sekcja powinna być wykonywana na zimnej powierzchni, aby larwy były znieczulone, a mózg schłodzony. Na przykład umieść naczynie rozwarstwiające na bloku chłodzącym podłączonym do pompy, aby cyrkulować lodowatą wodę. Procedura preparacji trwa ~30 s na mózg. Ważne jest, aby krążki wyobrażeniowe oka/czułków były przyczepione do mózgu i brzusznego rdzenia nerwowego w stanie nienaruszonym. Oderwanie tych części uszkodzi mózg i obniży jakość hodowli. Unikaj również wystawiania mózgów na działanie powietrza. Przed zasysaniem pierwszego mózgu należy pipetować w górę i w dół DSS zawierającego części wypreparowanych larw, ponieważ zapobiega to przywieraniu mózgu do ścianki końcówki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzenie eksplantatów mózgu w matrycy 3D i montaż (~20 min).
	<ol>
		<li>Zanurz wypreparowany mózg w roztworze roboczym fibrynogenu (końcowe stężenie fibrynogenu ~ 3,3 mg / ml, 10,5 μl na mózg) w następujący sposób:</li>
		<li>Odessać 3,5 μl SAM/antybiotyków (tą samą końcówką, co w sekcji 3.2.3). Odessać wypreparowany mózg z sekcji do tej samej końcówki pipety bez dozowania pożywki SAM/antybiotyków do końcówki.</li>
		<li>Dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Dodaj kolejne 3,5 μl SAM/antybiotyków i 3,5 μl ciepłego roztworu fibrynogenu/SAM 10 mg/ml na kroplę zawierającą mózg. Delikatnie wymieszać roztwór wokół mózgu, pipetując końcówką do pipety o pojemności 20 μl. 
		UWAGA: Używanie pipety zamiast kleszczy na tym etapie pozwala uniknąć stresu dla mózgu.</li>
		<li>Weź 2 μl roztworu roboczego fibrynogenu z kropli i nałóż go na szkiełko nakrywkowe naczynia ze szklanym dnem jako małe kółko. Dodać 0,8 μl trombiny i bardzo szybko wymieszać końcówką pipety. Fibrynogen przekształca się w fibrynę i zaczyna polimeryzować.</li>
		<li>Weźmy mózg, który znajduje się w roztworze roboczym fibrynogenu (krok 3.3.1) między parą kleszczy i umieść go na matrycy, gdy widoczna jest biała matryca fibryny. Zorientuj mózg przednią stroną do dołu (do obrazowania neuronów zegarowych). Dociśnij go jak najbliżej szkła nakrywkowego. Skrzep fibrynowy składa się z warstw fibryny. Wybierz jedną warstwę i złóż ją na mózgu małymi i delikatnymi ruchami, nie odrywając matrycy.
		<ol>
			<li>Powtórz 2 do 3 razy z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg. 
			UWAGA: Podczas obchodzenia się z mózgiem za pomocą kleszczy należy uważać, aby go nie wysuszyć ani nie wywierać na niego fizycznego stresu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodaj 20 μl SAM/antybiotyków na wierzch osadzonego mózgu, aby zatrzymać działanie trombiny.</li>
		<li>Powtórz procedurę, aby zamontować pozostałe mózgi. Możliwe jest osadzenie od 5 do 6 mózgów na naczyniu ze szklanym dnem.</li>
		<li>W przypadku długotrwałego obrazowania na żywo dodaj 600 μl SAM/antybiotyków do wewnętrznej studzienki (szklanej części). Umieść wstępnie przyciętą membranę PTFE na wierzchu medium i przyklej ją do smaru próżniowego nałożonego na plastikową część dna (3.1.5) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>W przypadku testów farmakologicznych napełnij naczynie 2 ml SAM/antybiotyków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać parowania pożywki, ponieważ osmolalność pożywki ma kluczowe znaczenie dla żywotności neuronów. Dlatego w przypadku długotrwałych eksperymentów obrazowych konieczne jest uszczelnienie naczynia hodowlanego membraną PTFE. Natomiast w przypadku eksperymentów krótkoterminowych membrana uszczelniająca nie jest wymagana, o ile naczynie jest wypełnione 2 ml pożywki i monitorowane w wilgotnej komorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akwizycja zdjęć poklatkowych
<ol>
	<li>Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie szalki Petriego w komorze wilgotnościowej stage-top.</li>
	<li>Przejdź do panelu z-stack w zakładce Acquire i ustaw kroki przekroju z poziomu oprogramowania mikroskopu (2 μm × ~40 w eksperymentach pokazanych w Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i Film 1). Ustaw początek stosu z w płaszczyźnie najbardziej oddalonej od szkiełka nakrywkowego, a koniec na powierzchni eksplantatu mózgu, blisko szkiełka nakrywkowego. Chociaż ruchy mózgu są znikome, dodaj dodatkowe sekcje z na początku i na końcu stosu z.</li>
	<li>Przejdź do panelu Mark & Find i skonfiguruj wielopozycyjne pobieranie obrazów. Dzięki obiektywowi 40X można uchwycić 1 półkulę mózgu w polu widzenia</li>
	<li>Przejdź do panelu Tryb akwizycji i wybierz xyzt (z-stack time-lapse). Przejdź do panelu Akwizycja czasu i ustaw preferowany przedział czasowy i parametry częstotliwości. 
	UWAGA: Uzyskuj obrazy poklatkowe z żądaną częstotliwością. Należy zauważyć, że długoterminowe obrazowanie na żywo (24-72 godziny) z odstępem poklatkowym krótszym niż 2 godziny ma tendencję do zmniejszania liczby neuronów cyklicznych, prawdopodobnie dlatego, że zmniejsza żywotność neuronów. Ilość danych zwiększa się wraz ze wzrostem szybkości pozyskiwania obrazów, co sprawia, że analiza i przechowywanie danych jest trudniejsze.</li>
</ol>
5. Farmakologiczne leczenie eksplantatów mózgu za pomocą krótkotrwałego obrazowania na żywo
UWAGA: Poniższa procedura jest zasadniczo taka sama jak w przypadku obrazowania długoterminowego, ale nie wymaga membrany PTFE. Aby uniknąć wystawiania mózgów na działanie niebieskiego światła, gdy substancja chemiczna jest dodawana do kultury, mikroskop należy umieścić w ciemnym pomieszczeniu z czerwonym światłem.
<ol>
	<li>Przejdź do panelu Time Acquisition i ustaw żądany przedział czasu i liczbę skanowania, aby uzyskać dane wyjściowe przed zastosowaniem leku. Rozpocznij skanowanie.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania linii bazowej podnieś głowicę skanującą systemu mikroskopu. Zdejmij pokrywę regulatora wilgotności stage-top i bardzo ostrożnie zdejmij pokrywkę naczynia ze szklanym dnem, nie przesuwając jej.</li>
	<li>W razie potrzeby usunąć odpowiednią ilość pożywki hodowlanej. Dodać roztwór doświadczalny do pożywki i ostrożnie i bardzo delikatnie wymieszać sterylną pipetą Pasteura, nie dotykając eksplantatów mózgu. 
	UWAGA: Do aplikacji PDF w kąpieli należy użyć roztworu podstawowego PDF 2 μM (w 10% DMSO).</li>
	<li>Załóż pokrywki naczynia ze szklanym dnem i wilgotnej komory oraz głowicy skanującej. Jeśli używasz, zmień położenie czarnej nieprzezroczystej tkaniny wokół komory mikroskopu.</li>
	<li>Sprawdź, czy mózgi są w swoich pierwotnych pozycjach w trybie skanowania na żywo. W razie potrzeby dostosuj.</li>
	<li>Przejdź do panelu Time Acquisition (Pobieranie czasu) i ustaw żądany przedział czasu oraz liczbę skanowań. Uruchom Scan. 
	UWAGA: Tutaj testowaliśmy zdjęcia poklatkowe robione co godzinę przez maksymalnie 10 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit%3A+Pas+De+Deux+or+Tarantella%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li>
<li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clock+shop%3A+coupled+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22Insect+molecular+biology+and+biochemistry%22">Insect molecular biology and biochemistry</a>. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).</li>
<li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li>
<li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+clocks+in+the+brain%3A+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li>
<li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li>
<li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560(2017).</li>
<li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li>
<li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G+protein-coupled+receptor%2C+groom-of-PDF%2C+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li>
<li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li>
<li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699(2014).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li>
<li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+entrainment+of+Drosophila%27s+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fluminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li>
<li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca%282%29%28%2B%29+rhythms+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li>
<li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li>
<li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains%3A+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327(2015).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497(2015).</li>
<li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li>
<li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy metodę długotrwałej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej hodowanych mózgów larwalnych. Powodzenie tego typu eksperymentów zależy od wielu czynników, takich jak stan zdrowia hodowli, metoda unieruchomienia eksplantu mózgu, intensywność fluorescencji i stosunek sygnału do szumu reportera, rozdzielczość czasowa i przestrzenna oraz dostępność eksplantatu. Czynniki te mogą się wzajemnie wykluczać. Na przykład rosnąca częstotliwość filmów poklatkowych wpływa na zdrowie kultury, a unieruchomienie ek...

Zegary okołodobowe pomagają organizmom przystosować się do okresowych zmian środowiskowych generowanych przez 24-godzinny obrót Ziemi. Powiązane pętle transkrypcyjno-translacyjnego sprzężenia zwrotnego często leżą u podstaw molekularnej maszynerii zegarów okołodobowych u różnych gatunków1. Obwód okołodobowego rozrusznika serca, składający się z neuronów zawierających zegar, integruje informacje o porze dnia przekazywane przez sygnały środowiskowe, takie jak cykle światła/ciemności (LD) i temperatury, aby koordynować rytmy mnóstwa codziennych procesów fizjologicznych i behawioralnych2,3. Koordynacja rytmów molekularnych z wejściami i wyjściami neuronów jest niezwykle ważna dla działania obwodu okołodobowego, ale pozostaje tylko częściowo poznana.
U Drosophila, w sercu zegara molekularnego, heterodimer CLOCK/CYCLE (CLK/) aktywuje transkrypcję okresu (per) i bezczasowości (tim). PER i TIM tworzą kompleks i dostają się do jądra, gdzie hamują aktywność transkrypcyjną CLK/, a w konsekwencji własną transkrypcję. Regulacje potranskrypcyjne i potranslacyjne powodują opóźnienia między transkrypcją za pośrednictwem CLK/a represją przez PER/TIM, zapewniając generowanie około 24-godzinnych oscylacji molekularnych1,3,4. Około 150 neuronów zawierających te zegary molekularne tworzy obwód kontrolujący okołodobowe zachowanie dorosłych muszek5. Znacznie prostszy, ale w pełni funkcjonalny obwód okołodobowy składający się z 3 grup neuronów zegarowych - 5 brzusznych neuronów bocznych (LNvs; 4 PDF-dodatnie LNv i jeden PDF-ujemny LNv, patrz poniżej), 2 neurony grzbietowe 1s (DN1s) i 2 neurony grzbietowe 2s (DN2s) - jest obecny w mózgu larwy 6,7.
Prosty larwalny obwód okołodobowy stanowi doskonały model do badania interakcji między komunikacją międzyneuronalną a mechanizmem molekularnym. Korzystając z naszego nowo opracowanego fluorescencyjnego reportera PER-TDT, który naśladuje poziomy białka PER i jego subkomórkową lokalizację, staraliśmy się scharakteryzować dynamikę mechanizmu zegarowego w różnych podgrupach neuronów zegarowych w obwodzie okołodobowym larw 8. Ponadto, znając kluczową rolę czynnika dyspersyjnego pigmentu neuropeptydowego (PDF) wytwarzanego przez 4 LNvs w regulacji rytmów okołodobowych na poziomie neuronalnym9,10,11, chcieliśmy zbadać bezpośredni wpływ PDF na zegary molekularne. W tym celu opracowaliśmy metodę monitorowania okołodobowych rytmów ekspresji genów w eksplantacji mózgu larw przez wiele dni za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Protokół został również dostosowany do testów farmakologicznych w celu zbadania wpływu PDF lub innych związków na poziom PER-TDT. W związku z tym adaptacja polega na udostępnieniu hodowli eksplantatów mózgu do stosowania leków, zwiększeniu rozdzielczości czasowej i obrazowaniu przez krótszy czas.
Hodowla ex vivo mózgów Drosophila o różnych stadiach rozwojowych została wcześniej ustalona12,13,14,15,16,17,18. Podczas gdy protokoły te były używane do obrazowania różnych zjawisk biologicznych, niektóre z nich nie są kompatybilne z obrazowaniem w rozdzielczości pojedynczej komórki lub nie wspierają hodowli przez więcej niż kilka godzin. Alternatywne metody wykonywania długoterminowego obrazowania na żywo neuronów okołodobowych u Drosophila obejmują bioluminescencyjne obrazowanie rytmów molekularnych19,20,21 oraz obrazowanie fluorescencyjne wskaźnika wapnia za pomocą mikroskopii arkuszowej22,23. Chociaż obrazowanie bioluminescencyjne może osiągnąć wyższą rozdzielczość czasową, a mikroskopia arkuszy świetlnych może być przystosowana do obrazowania in vivo, są one ograniczone pod względem rozdzielczości przestrzennej i wymagają specjalistycznych systemów mikroskopowych.
Opisana tutaj metoda jest dostosowana do wizualizacji sygnałów fluorescencyjnych w całej kulturze mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki przez wiele dni. Ta łatwa i wszechstronna metoda może zostać zaadaptowana do obrazowania mózgów dorosłych much oraz do eksperymentów farmakologicznych w celu zbadania wielu różnych problemów w neurobiologii Drosophila.

<table><tbody><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Nie jestem pewien, czy są to dokładnie te same, które mamy w laboratorium. Wybrałem "odpowiedni do hodowli komórek owadów", jeśli jest dostępny</td></tr><tr><td>2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-trehaloza dwuwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fumarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-kwas ketoglutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Nieinaktywowana termicznie, surowica cielęca płodu (FCS) Badania przesiewowe w kierunku Mykoplazmy i wirusów</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7,4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z osocza bydlęcego</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>UWAGA: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Manipulować pod przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>UWAGA: Zagrożenie dla zdrowia, używać rękawic</td></tr><tr><td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie, nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekane</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr butelkowy z gwintem 500 ml Steritop-GP 33 mm, 0,22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Folia politetrafluoroetylenowa (PTFE)</td><td>Dupont</td><td>200A Teflonowa folia</td><td></td>FEP</tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45&nbsp; &mikro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, sterylizowany promieniami gamma</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0.22&nbsp; &mikro; m, PVDF, 33&nbsp; mm, sterylizowane promieniami gamma</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Trzydołkowe szklane naczynie preparacyjne</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze, rozmiar 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Skaner tandemowy odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5, ze skanerem rezonansowym i detektorami fotopowielacza HyD</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora kontroli temperatury</td><td>Usługi obrazowania życia</td><td>CUBE & System kontroli temperatury BOX, specjalnie zaprojektowany</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top regulator wilgotności</td> Life <td>Imaging Services</td><td>wykonane na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Mikro dozownik zanurzenia w wodzie: dozownik, rozszerzona mikropompa serii MP6 i oprogramowanie Autoimmersion Objective Controller</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tworzenie stosu SUM i wtyczka dryfu korekcji 3D</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ10x iteracyjna dekonwolucja,</td> oprogramowanie <td></td><td></td><td>AutoQuant i Imaris</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych drosophila w hodowli mózgu larw

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Obwód okołodobowego rozrusznika serca koordynuje rytmiczne behawioralne i fizjologiczne wyjścia skoordynowane ze wskazówkami środowiskowymi, takimi jak cykle dnia i nocy. Zegar molekularny w każdym neuronie rozrusznika generuje rytmy okołodobowe w ekspresji genów, które leżą u podstaw rytmicznych funkcji neuronalnych niezbędnych do działania obwodu. Badanie właściwości poszczególnych oscylatorów molekularnych w różnych podklasach neuronów rozrusznika serca i ich interakcji z sygnalizacją neuronalną pozwala lepiej zrozumieć obwód okołodobowego rozrusznika serca. W tym miejscu przedstawiamy podejście do poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej opracowane w celu monitorowania mechanizmu molekularnego w neuronach zegarowych hodowanego mózgu larwalnego Drosophila. Metoda ta pozwala na wielodniowe rejestrowanie rytmów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów okołodobowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tę konfigurację można połączyć z manipulacjami farmakologicznymi w celu dokładnej analizy reakcji zegara molekularnego w czasie rzeczywistym na różne związki. Poza rytmami okołodobowymi, ta wielofunkcyjna metoda w połączeniu z potężnymi technikami genetycznymi Drosophila oferuje możliwość badania różnych procesów neuronalnych lub molekularnych w żywej tkance mózgowej.

W niniejszym materiale przedstawiamy reprezentatywne wyniki długoterminowego obrazowania okołodobowego reportera fluorescencyjnego w kulturze mózgu larw ex vivo oraz wyniki obrazowania na żywo wpływu aplikacji PDF do kąpieli na ekspresję reportera.
Larwy L3 o niskiej mobilności, wykazujące ekspresję reportera zegara molekularnego PER-TDT oraz UAS-mCD8::YFP sterowanego przez driver neuronów zegarowych Clk(856)-gal4</...

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla mózgów larw Drosophila do wielodniowej poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenetyki Drosophila, takie jak zmiany ekspresji genów, które zachodzą w określonych populacjach neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie sond fluorescencyjnych z rozdzielczością pojedynczej komórki w żywym mózgu w ciągu kilku godzin lub dni.Przygotowując odczynniki do tej procedury, pracuj pod kapturem hodowlanym. Zarówno podwielokrotność pożywki SAM, jak i trombiny muszą zostać rozmrożone, aby rozpocząć. Odłóż trombinę.Weź 2,5 mililitrową porcję SAM, a pozostałą część SAM połóż na lodzie i odłóż na bok. Następnie umieść penicylinę streptomycynę w podzielonym SAM i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałych eksperymentów obrazowych przygotuj komorę obrazowania, nałóż autoklawowany smar próżniowy na plastikowe obszary wokół studzienki naczynia ze szklanym dnem.Następnie wysterylizuj natłuszczone naczynie światłem UV pod maską. Teraz wymieszaj porcję SAM z fibrynogenem i przenieś mieszaninę do 37 stopni Celsjusza, gdzie nie będzie polimeryzować przez dwie godziny. Do sekcji wyczyść kleszcze w dwóch trzydołkowych szklanych naczyniach preparacyjnych z 70% etanolem.Następnie załaduj cztery studzienki 400 mikrolitrami DSS i jedną studzienkę 400 mikrolitrami SAM. Trzymaj naczynia do sekcji na schłodzonym talerzu. Z fiolki z rozmnażającymi się muchami zgarnij pożywkę zawierającą niewędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego i przenieś do siedmiu za pomocą kleszczy do studni z zimnym DSS.Następnie przepuść larwy przez trzy z czterech studzienek załadowanych DSS, aby je oczyścić. Pozostaw je w ostatniej studzience, aż zostaną wypreparowane. Użyj czwartej studzienki DSS, aby wypreparować mózgi larw za pomocą pary czystych, cienkich kleszczy.Użyj sprawdzonej metody inside-out. Przy wprawie każdą larwę można przetworzyć w około 30 sekund. Po każdej sekcji użyj końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, wstępnie przepłukanej DSS, aby przenieść mózg w około trzech mikrolitrach DSS do dobrze wypełnionego SAM.Przygotuj do siedmiu mózgów do procedury osadzania. Po przeniesieniu mózgu do roztworu roboczego, dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Następnie dodaj kolejne 3,5 mikrolitra SAM z antybiotykami i dodaj 3,5 mikrolitra ciepłego SAM z fibrynogenem.Ważne jest, aby przez cały czas trwania zabiegu utrzymywać pożywkę SAM z fibrynogenem w temperaturze 37 stopni. Następnie wymieszaj roztwór wokół mózgu, delikatnie pipetując tą samą końcówką pipety i odessaj dwa mikrolitry roztworu, aby umieścić go na szkiełku nakrywkowym do naczynia ze szklanym dnem. Następnie dodaj 0,8 mikrolitra trombiny do kropli i bardzo szybko wymieszaj, aby zainicjować polimeryzację, która będzie wyglądać na białą.Następnie za pomocą kleszczy delikatnie wybierz mózg i umieść go na polimeryzującej matrycy fibryny. Myślę, że trombina, po przeniesieniu mózgu do kropelki, nie jest zalecana, ponieważ bardzo komplikuje procedurę. Zorientuj mózg w razie potrzeby i bardzo delikatnie popchnij mózg jak najbliżej szkiełka nakrywkowego.Następnie wybierz warstwę spolimeryzowanej fibryny i złóż ją na mózgu, wykonując małe i delikatne ruchy, które nie odrywają matrycy. Kontynuuj składanie warstw spolimeryzowanej fibryny nad mózgiem z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg. Następnie umieść 20 mikrolitrów SAM z antybiotykami na osadzonym mózgu, aby zatrzymać aktywność trombiny.Korzystając z tej procedury, kontynuuj osadzanie pięciu do sześciu mózgów na naczyniu ze szklanym dnem. W przypadku długotrwałego obrazowania zanurz osadzone mózgi w 600 mikrolitrach SAM z antybiotykami. Następnie połóż kawałek membrany PTFE na podłożu i przyklej krawędzie membrany do natłuszczonych części naczynia.W przypadku krótkich testów napełnij naczynie dwoma mililitrami SAM antybiotykami, zanurzając mózg i pomijając użycie membrany PTFE. Korzystając z opisanych procedur, mózgi wyrażające reporter zegara molekularnego sterowany przez sterownik neuronów zegarowych, zostały porwane w ciemności światła, a następnie przygotowane jako kultury eksplantatów. Długoterminowe hodowle zakładano w fazie światła, tuż przed zmrokiem.Stos SUM zawierający neuron będący przedmiotem zainteresowania został utworzony w średnim natężeniu fluorescencji obszaru odpowiadającego neuronowi, mierzono po odjęciu tła. Do określenia rytmiczności ekspresji reporterowej zastosowano zarówno analizę spektralną maksymalnej entropii, jak i inspekcję manualną. Następnie larwy o tym samym genotypie zostały wypreparowane albo godzinę po subiektywnym świcie, albo godzinę po subiektywnym zmierzchu.Mózgi zostały zobrazowane dwa razy w ciągu godziny, aby uzyskać punkt odniesienia. Następnie do pożywki hodowlanej dodano plik PDF lub nośnik, a mózgi obrazowano co godzinę przez sześć godzin. W mózgach pobranych krótko po zmroku profil ekspresji PER-TDT w LNvs wykazał zależny od pory dnia wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu PDF.Miało to miejsce również w DN1 i w mniejszym stopniu w DN2. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić hodowlę mózgu ex vivo z larw Drosophila przy użyciu matrycy 3D fibryny. Po opanowaniu cała procedura trwa około 30 minut, od sekcji do osadzenia.Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować zestaw do obrazowania, aby mózg mógł zostać zobrazowany natychmiast po osadzeniu. Po tej procedurze dorosłe mózgi Drosophila mogą być również hodowane w celu fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Źródło: Sabado, V., et al.,  }Nagoshi, E. Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki Drosophila Zegary okołodobowe w mózgu larw Kultura. J. Vis. exp. (2018).  Ten film demonstruje procedurę osadzania mózgu  Drosophila{} w matrycy fibryny, a następnie obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe neuronów zegara okołodobowego w celu analizy rytmicznej aktywności zsynchronizowanej z cyklami światła/ciemności.

Osadzenie mózgu Drosophila w matrycy w celu obrazowania poklatkowego neuronów zegara okołodobowego

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę hodowli mózgów larw Drosophila w macierzy fibrynowej do wielodniowego obrazowania fluorescencji zegarów okołodobowych w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Przeglądaj więcej filmów