Name: Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Naucz się natywnej immunoprecypitacji chromatyny w mysich neurosferach guza mózgu. Ta metoda pozwala identyfikować modyfikacje histonów w gliomie bez utrwalania komórek, zachowując ich naturalny stan.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NIH/NINDS) Granty R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 dla M.G.C.; NIH/NINDS przyznaje R01-NS076991, R01-NS082311 i R01-NS096756 dla P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Klinika Neurochirurgii; Leah's Happy Hearts i Chad Though Foundation to M.G.C. and P.R.L. R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 dla M.G.C. F.M.M. jest wspierany przez F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. jest wspierany przez grant NIH/NIGMS 5T34GM007821-37.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
1. Powstawanie guza mózgu NS i warunki hodowli.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę dla neuronalnych komórek macierzystych (NSC) z suplementem Modified Eagle Medium/F12B27 firmy Dulbecco (1x), suplementem N2 (1x) i odczynnikiem przeciwdrobnoustrojowym. W dniu stosowania należy uzupełnić pożywkę NSC ludzkim rekombinowanym śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (EGF) i zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF) w końcowym stężeniu 20 ng/ml każdy.</li>
	<li>Indukuj guz mózgu u myszy za pomocą systemu transpozonów Śpiąca Królewna, w którym plazmidy kodujące onkogeny lub shRNA ukierunkowane na supresory guza są wstrzykiwane do bocznych komór noworodków w celu wygenerowania spontanicznych guzów mózgu9. Wybierz mysz z dużym guzem, co potwierdza obrazowanie bioluminescencyjne. 
	UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat Systemu Transpozonów Śpiącej Królewny i zastosowanych konstruktów plazmidowych można znaleźć w Calinescu et al.9.
	<ol>
		<li>Aby zobrazować myszy, wstrzyknij 100 μl roztworu lucyferyny 30 mg / ml dootrzewnowo za pomocą igły o rozmiarze 26.</li>
		<li>5 minut po wstrzyknięciu lucyferyny znieczulić zwierzę za pomocą komory anestezjologicznej z przepływem tlenu/izofluranu ustawionym na 2% izofluranu.</li>
		<li>Po znieczuleniu zwierząt (zwykle 2-3 min) umieść je w komorze bioluminescencyjnej z izofluranem tlenu ustawionym na 2% izofluranu. Jeśli zwierzęta będą pod narkozą dłużej niż 5 minut, użyj maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Zobrazuj myszy za pomocą systemu obrazowania optycznego in vivo o następujących parametrach: automatyczna ekspozycja, duże binning i przysłona f=1. Parametrem pozwalającym uznać go za duży nowotwór, jest bioluminescencja >106 fotonów/s/cm, 2/sr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania znieczulenia wziewnego izofluranu w zamkniętej komorze, sprawdź przez uszczypnięcie palca, czy zwierzę jest znieczulone i odetnij głowę myszy.</li>
	<li>Wyodrębnij mózg i przeprowadź jego sekcję zgodnie z wcześniejszym opisem w Calinescu i wsp.9.</li>
	<li>Umieść mózg na 10-centymetrowej szalce Petriego. Jeśli indukowany guz wykazuje ekspresję białka fluorescencyjnego, użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego ustawionego na odpowiedni kanał fluorescencyjny i powiększenie 0,3x, w przeciwnym razie zidentyfikuj masę guza na podstawie różnic w kolorze i teksturze tkanki. Użyj skalpela i kleszczy, aby oddzielić tkankę nowotworową od normalnego mózgu.</li>
	<li>Zmiel guz na małe kawałki na szalce Petriego. Umieść wypreparowany guz w probówce o pojemności 1,5 ml z 300 μl pożywki NSC.</li>
	<li>Użyj jednorazowego plastikowego tłuczka do granulek, który pasuje do ścianek stożkowej probówki do mikrowirówki, aby delikatnie homogenizować guz. Dodać 1 ml pożywki do oddzielania komórek i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Użycie tłuczka może zabić niektóre komórki. Jeśli czytelnik chce zmaksymalizować żywotność komórki, można pominąć użycie tłuczka.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.7 przez sitko do komórek o wielkości 70 μm i przemyć sitko 25 ml pożywki NSC.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 6 ml pożywki NSC.</li>
	<li>Zawiesinę komórek nowotworowych z kroku 1.9 umieścić na płytce w kolbie hodowlanej T-25 i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2. Zwykle po 3 dniach pojawi się mieszanina niektórych martwych komórek, komórek przylegających i niektórych komórek tworzących NS, które unoszą się w pożywce.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zebrać tylko te komórki, które opadają na dno, za pomocą mikropipety i ponownie umieścić je w kolbie do hodowli tkankowej T-75.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w stosunkowo dużej gęstości (1-3 X 10,6 komórek w T-25). Przejdź przez komórki, gdy się zlewają. 
	UWAGA: Konfluencja zależy od wielkości sfer. Czarne środki dużych kul oznaczają, że w środku znajdują się martwe komórki i wskazują, że komórki powinny zostać natychmiast przepuszczone.</li>
	<li>Dodawaj czynniki wzrostu (EGF i zasadowe-FGF; po 20 ng/ml każdy) co trzy dni. Zmień pożywkę, gdy komórki nie zlewają się, a podłoże zmienia kolor na jasnopomarańczowy.</li>
	<li>Aby zmienić pożywkę, zebrać starą pożywkę i odwirować ją przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce NSC z dodatkiem EGF i FGF w stężeniu określonym w kroku 1.1. 
	UWAGA: Jeśli kule znajdują się w średnim lub wysokim zbiegu, ale nie są gotowe do przejścia (rozmiar kuli jest mały < średnicy 100 μm), wówczas osad można podzielić na dwie kolby.</li>
	<li>W celu przejścia komórek należy odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdekantować supernatant i inkubować komórki w pożywce oddzielającej komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml zbilansowanego roztworu soli do rozcieńczenia pożywki oddzielającej i odwirować w sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 18 ml pożywki NSC i równo podzielić zawiesinę na trzy kolby T-25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zamrozić porcje komórek, należy rozdzielić komórki jak w kroku 1.15 i zamrozić komórki w 1 ml porcji 90% płodowej surowicy bydlęcej z 10% dimetylosulfotlenkiem. Powoli schładzaj komórki, umieszczając je na lodzie na 10 minut, a następnie utrzymuj komórki w temperaturze -20 °C przez 30 minut i -80 °C przez 1 dzień. Następnego dnia przenieś komórki do pojemnika do przechowywania ciekłego azotu.</li>
</ol>
2. Natywny ChIP
<ol>
	<li>Przygotowanie chromatyny
	<ol>
		<li>Po sporządzeniu zapasów pochodnych NS, hodować NS w T-75 w 15 ml pożywki NSC w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 aż do zlewania się NS. Jedna zlewająca się płytka T-75 da 3-5 X 106 komórek.</li>
		<li>Gdy komórki zaczną się zlewać, odwirować NS przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i dodać 1 ml pożywki do dysocjacji komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 5 ml pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru10. 
		UWAGA: 1 x 106 komórek jest potrzebnych na reakcję immunoprecypitacji (IP). Należy pamiętać, że należy również dołączyć surowicę przedimmunologiczną lub kontrolę IgG11.</li>
		<li>Odwirować NS w jednej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad NS z 1 ml zbilansowanego roztworu soli i przenieść zawiesinę do probówek mikrowirówek o niskiej wiązalności białka 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować NS przy 300 x g przez 5 min, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 95 μl buforu wytrawiającego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego) na 1 x 106 komórek uzupełnionych koktajlem inhibitorów proteazy w wysokim stężeniu (1:100). Natychmiast pipetuj komórki w górę iw dół, aby zapobiec zbrylaniu się i tworzeniu pęcherzyków.</li>
		<li>Ponownie zawiesić MNazę w 50% glicerolu, aby uzyskać roztwór 1 mg/ml (1,15 jednostki/μl, przechowywany w temperaturze -20 °C), który będzie określany jako "1x" zapas. Zrób zapas "0,1x", wykonując drugie rozcieńczenie 1:9 z 50% glicerolem (np. 900 μl "1x" MNazy i 100 μl 50% glicerolu) i przechowuj go w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wymieszać 5 μl "0,1x" MNazy i 145 μl buforu wytrawiającego. Utrzymuj enzym na lodzie przez cały czas. Dodać 5 μl rozcieńczonej MNazy do buforu wytrawiającego na 1 x 106 komórek. Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę w bloku o temperaturze 37 °C dokładnie na 12 minut. Przetwarzaj próbki pojedynczo, aby zapewnić dokładny czas inkubacji wynoszący 12 minut.</li>
		<li>Dodaj 10 μL 10x buforu zatrzymującego MNazę (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM EDTA) na 1 x 106 komórek. Począwszy od tego momentu, próbki muszą być przechowywane na lodzie.</li>
		<li>Dodać 110 μl "2x bufor RIPA" (280 mM NaCl, 1,8% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,2% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,2% Na-deoksycholanu, 5 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA); przechowywany w temperaturze 4 °C) uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy w wysokim stężeniu (1:100) na 1 x 106 komórek. Przesuń rurkę, aby wymieszać.</li>
		<li>Odwirować probówki przez 15 minut w mikrofugach w temperaturze 4 °C i 1700 x g. Przenieść supernatant do nowych zwykłych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (probówki do mikrowirówek o niskiej zawartości wiązania białek nie są już potrzebne) i przechowywać je na lodzie. Wyrzuć granulkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja (IP)
	<ol>
		<li>Wymieszaj kulki magnetyczne Białko A i Białko G w stosunku 1:1. Na każdy IP przygotuj 25 μl koralików.</li>
		<li>Przemyć kulki, dodając 1 ml buforu RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoksycholanu; przechowywanego w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000).</li>
		<li>Użyj magnesu, aby kulki oddzieliły się od roztworu myjącego i zdekantuj roztwór myjący (około 1 minuty). Wykonaj krok prania dwukrotnie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki do pierwotnej objętości za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000).</li>
		<li>W razie potrzeby rozcieńczyć chromatynę za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000) tak, aby każdy IP miał objętość 100-200 μL. Na wejście należy zarezerwować 10% objętości chromatyny zużytej na IP. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli stosuje się 200 μl na IP, 20 μl rozcieńczonej chromatyny powinno być zarezerwowane na wejście. W przypadku łącznie czterech IP całkowitą objętość chromatyny należy rozcieńczyć do 820 μl.</li>
		<li>Przygotuj dane wejściowe. Dodać 100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) do wejścia i inkubować wejście w temperaturze 55 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Kroki 2.2.6-2.2.7 można wykonać razem z krokami 2.3.4 i 2.4.1.</li>
		<li>Oczyścić wejście za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i wymyć w 50 μl buforu elucyjnego dostarczonego w zestawie.</li>
		<li>Zmierz stężenie materiału wejściowego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i zapisz wyniki w notatniku. Ślepa próba z buforem elucyjnym z zestawu. 
		UWAGA: W neurosferach myszy użyliśmy około 6 μg DNA dla każdego IP.</li>
		<li>Uruchom dane wejściowe na 1% żelu lub załaduj 1 μl do bioanalizatora DNA przy użyciu standardowych ustawień. Pozostałą część należy przechowywać do wykorzystania jako dane wejściowe w dalszych aplikacjach.</li>
		<li>Dodać 10 μl przemytych kulek magnetycznych białkowych A i G na każdy IP i inkubować IP przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Na przykład dodaj 30 μl kulek magnetycznych z białka A i G na trzy IP.</li>
		<li>Umieść próbki na magnesie i poczekaj, aż koraliki się rozdzielą. Podziel chromatynę, przenosząc wcześniej ustaloną ilość do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodaj przeciwciało i owiń nakrętki plastikową folią parafinową, aby uniknąć parowania. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min. 
		UWAGA: Stężenie należy określić empirycznie zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Następnego dnia wiruj probówki za pomocą mini wirówki w temperaturze pokojowej, 2000 x g, przez 10 s. Następnie dodać 10 μl kulek do każdego IP i inkubować IP przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z obrotem z prędkością 20 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie IP i trawienie białek
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubować IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i pozwolić kulkom magnetycznym rozdzielić się. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Powtórz to tep pięć prań.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% Na-deoksycholanu; przechowywać w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubować IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i odczekać, aż kulki magnetyczne się oddzielą. Za pomocą pipety usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodać 150 μl zimnego TE (bez inhibitorów proteazy) i inkubować próbkę w temperaturze 4 °C z rotacją z prędkością 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i odczekać, aż kulki magnetyczne się rozdzielą. Użyć pipety, aby usunąć supernatant.</li>
		<li>Po ostatnim etapie przemywania ponownie zawiesić próbkę w 100 μl buforu TE uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) i inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie DNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ChIP
	<ol>
		<li>Oczyść immunologicznie wytrącone DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Po dodaniu buforu wiążącego DNA z zestawu do każdej próbki, umieść probówkę na magnesie i poczekaj, aż kulki magnetyczne się zagregują, a następnie przenieś supernatant do kolumny czyszczącej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj 50 μl buforu elucyjnego znajdującego się w zestawie.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy adres IP się powiódł, wykonaj qPCR. Idealnie byłoby, gdyby startery były zaprojektowane dla regionów kontroli dodatniej i ujemnej. 
		UWAGA: Na przykład w przypadku IP wykonanego z H3K4me3 i H3K27me3 następujące próbki należy przeprowadzić na qPCR: H3K4me3, H3K27me3 i IgG ChIP DNA, wejściowe DNA i kontrolę bez matrycy (NTC) przy użyciu starterów dla regionów, które mają być wzbogacone H3K4me3 (kontrola pozytywna) i regionów, które mają być wzbogacone H3K4me3 (kontrola ujemna); podobnie jest w przypadku H3K27me3.</li>
		<li>Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami, aby wykonać qPCR12. Krótko mówiąc, wykonaj qPCR przy użyciu zielonej mieszanki wzorcowej SYBR, 0,5 μl 10 μM stężenia roboczego każdego startera do przodu i do tyłu oraz 2 μl ChIP lub wejściowego DNA. Odczyt płytek za pomocą systemu Real Time PCR. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 2. Sekwencje starterów Gapdh od Hwanga i wsp. były używane13.</li>
		<li>Analizuj dane ChIP względem danych wejściowych, tj. metody procentowego wprowadzania (% IP)14. Oblicz procentowy wkład, korzystając z następujących wzorów: 
		Skorygowane wejście = średnia ct(wejście)-log2(DF) 
		gdzie DF jest współczynnikiem rozcieńczenia początkowego wkładu i 
		DF = całkowita głośność adresu IP/ głośność wejścia 
		% IP = 100×2^(Skorygowane wejście - Ct (IP)) 
		gdzie Ct jest współczynnikiem progowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+B+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22">Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking</a>. , (2001).</li>
<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediumted+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+separable+roles+for+EZH2+in+neurogenic+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia.</a> Elife. 3, e02439(2014).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwi użytkownikowi wykonanie natywnego ChIP na NS pochodzącym z genetycznie modyfikowanych guzów mózgu. W przeciwieństwie do sieciowania ChIP, protokół ten jest ograniczony do badania białek, które ściśle wiążą się z DNA6. Liczba używanych komórek może być modyfikowana w razie potrzeby, a protokół może być skalowany w górę. Użyliśmy 1 X 106 komórek na adres IP, jednak natywny ChIP może być również wykonywany z zaledwie 4 x 104 komórkami<sup cl...

Zdarzenia epigenetyczne są częste w glejakach i prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w patogenezie guza. Rzeczywiście, w glejaku o wysokim stopniu złośliwości u dzieci mutacje w genach kodujących warianty histonów H3.3 i H3.1 występują często1. Mutacje wpływają na modyfikacje histonów i mają poważne konsekwencje epigenetyczne2,3. W spektrum od nastolatka do dorosłego występują nawracające mutacje w genie dehydrogenazy izocytrynianowej 1/2 (IDH1/2), mutacji hamującej zależne od α-KG histony i demetylazy DNA, oraz zmiany genetyczne w innych regulatorach chromatyny, takich jak ATRX i DAXX4. Dlatego niezwykle ważne jest zbadanie, w jaki sposób mutacje, które wpływają na regulatory epigenetyczne, zmieniają strukturę chromatyny i modyfikacje histonów regulatorowych, co z kolei ma dramatyczny wpływ na transkryptom komórek nowotworowych.
Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to potężne narzędzie używane do oceny wpływu modyfikacji epigenetycznych w genomie5,6,7. W natywnym ChIP chromatyna jest trawiona przez nukleazę mikrokokkową (MNazę), immunoprecypitowaną przy użyciu przeciwciała podniesionego przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania, a następnie DNA jest oczyszczane z immunoprecypitowanego kompleksu chromatyny6. Komórki nie są utrwalane podczas zabiegu, więc ta technika ma zastosowanie tylko do badania białek, które ściśle oddziałują z DNA6. Brak sieciowania wspomaga swoistość przeciwciał, ponieważ przeciwciała są zwykle wywoływane przeciwko nieustalonym peptydom lub białkom7. Ponadto, ponieważ nie ma etapu sieciowania, zmniejsza to szanse na naprawienie przejściowych interakcji białko-DNA, które są niespecyficzne i nie są regulacyjne7,8. ChIP może być używany do identyfikacji wzbogacania modyfikacji histonów w określonym regionie genomu. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wykonywania natywnego ChIP w neurosferach (NS) generowanych z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli glejaka.

<table><tbody><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R, chłodzony</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 mysz</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, Sól Potasowa Goldbio</td><td></td><td>LuckK-1g</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny DiaMag1.5</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>do mycia kulek magnetycznych</td></tr><tr><td>DiaMag Rotator EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td>rotator</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>Komponent NSC</td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>białko A kulki magnetyczne</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>białko G Koraliki magnetyczne</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>przygotuj 20 &mu; g/ml zapas w 0,1% BSA i podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>glikol etylenowy-bis(&beta;-aminoetylowy)-N,N,N',N'--kwas tetraoctowy) (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>odczynnik qPCR</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>Przygotuj 20 &mu; g/ml zapas w 0,1% BSA i podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>do rozwarstwiania guza</td></tr><tr><td>Glicerol, MB Grade</td><td>EMD- Milipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>zrównoważony roztwór soli</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>znieczulenie wziewne</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>system obrazowania optycznego in vivo</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>oddzielenia komórek</td></tr><tr><td>Odczynnik buforowy</td><td>chlorku litu</td><td>Sigma</td><td>L8895</td></tr><tr><td>Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>rurka do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania białek</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>zwykła probówka do mikrowirówek</td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>Każda partia może się różnić; Kup wystarczającą ilość do eksperymentów i podwielokrotności.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Składnik NSC</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>środek przeciwdrobnoustrojowy, stosować w dawce 0,1 mg/ml.</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td> <td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>Kimble Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & stopni C.</td></tr><tr><td>Protinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>przygotować zapas 10 mg/ml w wodzie; podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestaw</td> do <td>oczyszczania DNA</td><td>Qiagen</td><td>28104</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-16</td><td>do rozwarstwienia guza</td></tr><tr><td>Odczynnik buforowy</td><td>chlorku sodu</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu Dodecyl (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>odczynnik buforowy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>eter oktylofenylowy glikolu polietylenowego</td></tr><tr><td>Standardowa mini wirówka</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>standardowa mini wirówka</td></tr><tr><td>mikroskop SZX16</td> Mikroskop <td>fluorescencyjny</td> <td>Olympus</td><td>SZX16</td></tr><tr><td>System ViiA 7 do PCR w czasie rzeczywistym z szybkimi 96-dołkowymi biosystemami</td><td>blokowymi</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Modyfikacje epigenetyczne mogą być zaangażowane w rozwój i progresję glejaka. Zmiany w metylacji i acetylacji promotorów i regionów regulatorowych onkogenów i supresorów nowotworów mogą prowadzić do zmian w ekspresji genów i odgrywać ważną rolę w patogenezie nowotworów mózgu. Immunoprecypitacja chromatyny natywnej (ChIP) jest popularną techniką, która umożliwia wykrywanie modyfikacji lub innych białek ściśle związanych z DNA. W przeciwieństwie do usieciowanego ChIP, w natywnym ChIP komórki nie są traktowane formaldehydem w celu kowalencyjnego połączenia białka z DNA. Jest to korzystne, ponieważ czasami sieciowanie może naprawić białka, które tylko przejściowo oddziałują z DNA i nie mają funkcjonalnego znaczenia w regulacji genów. Ponadto przeciwciała są na ogół podnoszone przeciwko nieustalonym peptydom. W związku z tym swoistość przeciwciał jest zwiększona w natywnym ChIP. Należy jednak pamiętać, że natywny ChIP ma zastosowanie tylko do badania histonów lub innych białek, które ściśle wiążą się z DNA. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na mysich neurosferach guza mózgu.

Schematyczna reprezentacja NS guza wygenerowanego z guza mózgu, w którym komórki guza mózgu są dodatnie pod kątem Katushka, przedstawiona jest na Rysunku 1. Rysunek 2 stanowi schematyczną reprezentację całej techniki ChIP. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki dla chromatyny z NS guza mózgu trawionej MNazą przez 12 min, co pozwoliło na uzyskanie większości mono-, di- i trinukleosomów. Po ChIP ...

Mechanizmy epigenetyczne są często zmieniane w glejaku. Immunoprecypitacja chromatyny może być wykorzystana do badania konsekwencji zmian genetycznych w glejaku, które wynikają ze zmian w modyfikacjach histonów, które regulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na neurosferach mysiego guza mózgu.

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja wzbogacenia znaczników histonowych w określonej lokalizacji genomowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, w jaki sposób mutacje w regulatorach epigenetycznych, które zmieniają modyfikacje histonów, wpływają na transkryptom komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki nie są usieciowane, więc są w bardziej naturalnym stanie, co może wspomóc specyficzność przeciwciał.Zacznij od wypreparowania eksperymentalnie wywołanego guza z mózgu myszy na 10-centymetrowej szalce Petriego. Jeśli guz wykazuje ekspresję białka fluorescencyjnego, wizualizuj guz za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego ustawionego na odpowiedni kanał fluorescencyjny w powiększeniu 0,3 razy. Użyj skalpela i kleszczy, aby oddzielić tkankę nowotworową od normalnego mózgu i zmielić guz na małe kawałki na szalce Petriego.Przenieś wypreparowany guz do 1,5-mililitrowej probówki z 300 mikrolitrami pożywki NSC i użyj jednorazowej strzykawki, aby delikatnie homogenizować guz. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do oddzielania komórek i inkubuj próbkę przez pięć minut w temperaturze 37

native-chromatin-immunoprecipitation-using-murine-brain-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Źródło: Mendez, F. M.  i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Źródło: Núñez, F. J., et al. Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na zatopionych w parafinie kulturach neurosfery glejaka 3D. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia immunohistochemiczną technikę znakowania biomarkerów nowotworowych w neurosferach guza mózgu zanurzonych w parafinie. Skrawki neurosfery poddawane są usuwaniu parafiny i nawadnianiu, a następnie leczeniu w celu odsłonięcia miejsc biomarkerów. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w...

Barwienie immunohistochemiczne biomarkerów w skrawkach neurosfery guza mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Naucz się natywnej immunoprecypitacji chromatyny w mysich neurosferach guza mózgu. Ta metoda pozwala identyfikować modyfikacje histonów w gliomie bez utrwalania komórek, zachowując ich naturalny stan.

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Przeglądaj więcej filmów