Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja wzbogacenia znaczników histonowych w określonej lokalizacji genomowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, w jaki sposób mutacje w regulatorach epigenetycznych, które zmieniają modyfikacje histonów, wpływają na transkryptom komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki nie są usieciowane, więc są w bardziej naturalnym stanie, co może wspomóc specyficzność przeciwciał.

Zacznij od wypreparowania eksperymentalnie wywołanego guza z mózgu myszy na 10-centymetrowej szalce Petriego. Jeśli guz wykazuje ekspresję białka fluorescencyjnego, wizualizuj guz za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego ustawionego na odpowiedni kanał fluorescencyjny w powiększeniu 0,3 razy. Użyj skalpela i kleszczy, aby oddzielić tkankę nowotworową od normalnego mózgu i zmielić guz na małe kawałki na szalce Petriego.

Przenieś wypreparowany guz do 1,5-mililitrowej probówki z 300 mikrolitrami pożywki NSC i użyj jednorazowej strzykawki, aby delikatnie homogenizować guz. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do oddzielania komórek i inkubuj próbkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikronów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie przemyć sitko 25 mililitrami pożywki NSC i odwirować zawiesinę o sile 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po dekantacji supernatantu ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach pożywki NSC i przenieść zawiesinę komórek nowotworowych do kolby hodowlanej T25. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowej z atmosferą 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla, aż uformują się neurosfery.

Po zebraniu neurosfer odwirować jeden razy 10 do sześciu komórek neurosfery na wytrącenie aminokwasów w ilości 300 razy G przez pięć minut. Po odwirowaniu zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad neurosfery w jednym mililitrze zbilansowanego roztworu soli. Przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych o niskiej wiązalności białka, a następnie odwiruj jak poprzednio.

Następnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 95 mikrolitrach buforu wytrawiającego, uzupełnionym od jednego do 100 koktajlem inhibitorów proteazy na jeden raz 10 na sześć komórek. Natychmiast odpipetuj komórki w górę i w dół, aby zapobiec zbrylaniu się i tworzeniu pęcherzyków. Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów 0,1X nukleazy mikrokokowej w 145 mikrolitrach buforu wytrawiającego i dodaj pięć mikrolitrów rozcieńczonej nukleazy mikrokokowej na jeden razy 10 do sześciu komórek.

Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie na 12 minut. Trawienie nukleazy mikrokokowej w celu fragmentacji chromatyny jest najbardziej krytycznym krokiem. Właściwa fragmentacja chromatyny jest ważna dla osiągnięcia wysokiej rozdzielczości dla ChIP.

Aby upewnić się, że etap zakończy się sukcesem, inkubuj wiele próbek pojedynczo, aby upewnić się, że nie dojdzie do nadmiernego trawienia. Po 12 minutach dodaj 10 mikrolitrów buforu zatrzymującego nukleazę mikrokokową 10X na jeden raz 10 do sześciu komórek. Począwszy od tego momentu, próbki muszą być przechowywane na lodzie.

Analiza bioanalizatora próbki strawionej przez nukleazę mikrokokową pokazuje, że większość DNA została podzielona na mono, di i trinukleosomy. Następnie dodaj 110 mikrolitrów buforu 2X ripa uzupełnionego od 1 do 100 koktajlem inhibitorów proteazy na jeden raz 10 do sześciu komórek. Przesuń probówkę, aby wymieszać, a następnie odwiruj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 1700 razy G. Przenieś supernatant zawierający chromatynę do zwykłej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i umieść na lodzie.

Użyj buforu ripa uzupełnionego inhibitorami proteazy w ilości od jednego do 1000, aby rozcieńczyć chromatynę, tak aby każdy IP miał objętość od 100 do 200 mikrolitrów. Następnie należy usunąć podwielokrotność odpowiadającą 10% objętości ChIP jako próbkę wejściową. Przygotuj wejście, dodając 100 mikrolitrów buforu TE uzupełnionego proteinazą K i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po oczyszczeniu wkładu za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, zmierz stężenie wejścia za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Zapisz wyniki w notesie. Dodaj 10 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych białka A i G na IP, które zostaną wykonane na każdej próbce, i inkubuj przez godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem przy 20 obr./min.

Umieść próbkę na uchwycie magnetycznym i pozwól kulkom się rozdzielić, a następnie przenieś wymaganą objętość do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj pożądane przeciwciało do każdej probówki, a następnie owiń nakrętki plastikową folią parafinową, aby uniknąć parowania. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją jak poprzednio.

Następnego dnia wiruj probówki z prędkością 2000 razy G przez 10 sekund, a następnie dodaj 10 mikrolitrów koralików do każdego IP i inkubuj przez 3 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza z obrotem z prędkością 20 obr./min. Następnie umieść próbki na stojaku magnetycznym i pozwól kulkom magnetycznym się rozdzielić. Za pomocą pipety usuń supernatant, a następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu ripa z inhibitorami proteazy do każdego IP i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy 20 obr./min przez pięć minut.

Po okresie inkubacji umieść próbki na stojaku magnetycznym i pozwól kulkom magnetycznym oddzielić się. Za pomocą pipety usunąć supernatant, następnie dodać 150 mikrolitrów buforu chlorku litu uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu do każdego IP i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją przy 20 obr./min przez pięć minut. Po okresie inkubacji umieścić próbki na stojaku magnetycznym i pozwolić kulkom magnetycznym oddzielić się, a następnie użyć pipety, aby usunąć supernatant.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów zimnego TE bez inhibitorów proteazy do kulek i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza z rotacją z prędkością 20 obr./min przez pięć minut. Po ostatnim etapie płukania ponownie zawiesić próbkę w 100 mikrolitrach buforu TE uzupełnionego końcowym stężeniem 0,5 miligrama na mililitr proteinazy K i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Na koniec oczyść wytrącone aminowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.

Następnie, aby sprawdzić, czy IP się powiodło, wykonaj qPCR ze starterami ukierunkowanymi na pozytywne i negatywne regiony kontrolne. qPCR przeprowadzono z IGG ChIP DNA, histone-3-lycen-4-trimetylowanym DNA ChIP i histon-3-lycenem-27-trymetylowanym DNA ChIP, używając starterów dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej. Reprezentatywne wyniki pokazują, że Gapdh, gen porządkowy, jest wzbogacony tylko o modyfikację H3K4me3 związaną z aktywną transkrypcją, a nie modyfikację H3K27me3 związaną z represjonowaną chromatyną.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak ChIP-C, w celu identyfikacji zmian w znakach histonowych w całym genomie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać natywny ChIP w neurosferach, aby zidentyfikować znacznik histonowy w określonych miejscach genów.