Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Ogólnym celem tej techniki fotokonwersji jest odróżnienie pojedynczych komórek w pojedynczym zwierzęciu od innych populacji komórek fluorescencyjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania rozwojowe w tej dziedzinie i pozwolić nam na wizualizację migracji pojedynczych komórek w czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest minimalnie inwazyjna i może być używana do znakowania pojedynczych komórek lub większych populacji.

Dodatkowo użytkownik może wybrać konkretny region zainteresowania i przekonwertować zdjęcie na żądany cel. Po kryciu samców i samic transgenicznego danio pręgowanego wykazujących ekspresję białka fotokonwertowalnego i zebraniu jaj zgodnie z protokołem tekstowym, użyj mikroskopu preparacyjnego ze źródłem światła 488 nanometrów i zestawami filtrów GFP do badania przesiewowego 24 zarodków hpf. Za pomocą igły lub pęsety ręcznie usuń zarodki.

Przygotuj w kuchence mikrofalowej pięć mililitrów 0,8% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Gdy agaroza schłodzi się w dotyku, umieść trzy do czterech znieczulonych transgenicznych ryb sox10 eos dodatnich 48 hpf na środku dziesięciomilimetrowej szklanej płytki Petriego na dnie. Dodać około jednego milimetra lub tyle agarozy, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego.

Następnie za pomocą igły sondy ułóż ryby na bokach, dostosowując je w razie potrzeby, podczas gdy agaroza zestala się, co zajmie około dwóch minut. Po zestaleniu się agarozy przez dwie minuty, powoli dodawać do naczynia pożywkę zarodkową zawierającą 0,02% ester kwasu aminobenzoesowego trikainę, aż dolna powierzchnia agaru i naczynia zostanie zanurzona. Aby przeprowadzić mikroskopię konfokalną, otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ostrości.

Aby przeprowadzić obrazowanie przed konwersją, w oknie przechwytywania i na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania wybierz parametry obrazowania. Oto ustawienie stosu specyficzne dla laboratorium, które nazywa się obrazowaniem ryb. Umieść preparat w mikroskopie konfokalnym i użyj pokręteł regulacji zgrubnej i precyzyjnej, aby ustawić ostrość.

Następnie otwórz okno ostrości i zlokalizuj żądany obszar zainteresowania, taki jak zwój korzenia grzbietowego. W menu zestawu filtrów wybierz laser c488, ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75. Następnie w sekcji typu przechwytywania zaznacz pole 3D.

W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na jeden. Wybierz bieżącą lokalizację, a następnie kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.

Przed procesem fotokonwersji należy dwukrotnie i trzykrotnie sprawdzić parametry lasera. Czasami konieczne jest ponowne dostosowanie ustawień konwersji, gdy okno konwersji jest otwarte. W oknie przechwytywania, na karcie rozwijanej ustawień okna przechwytywania, wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium.

Tutaj nazywa się to ustawieniem specyficznym dla laboratorium, ryba abluje pełny chip. Z zestawu menu filtrów wybierz lasery c488 i c541. Ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75, co wytworzy wystarczającą ilość sygnału fluorescencyjnego bez powodowania fotowybielania lub toksyczności.

W oknie ostrości kliknij kartę fotomanipulacji i zmień moc laserstack na dwa, a następnie kliknij przejdź. Zmień rozmiar bloku rastrowego na jeden i kliknij przycisk Ustaw. Następnie zmień rozmiar dwukrotnego kliknięcia na cztery, a linię lasera na v405.

Następnie w oknie przechwytywania otwórz zaawansowane ustawienia przechwytywania. Wybierz kartę manipulacji zdjęciami i zmień powtórzenia dwukrotnego kliknięcia na dwa, a następnie kliknij OK. Wybierz kartę xy w oknie fokusu.

W zakładce fotomanipulacji dokładnie sprawdź parametry lasera. Następnie ustaw ustawienia lasera, aby fotokonwertować interesującą Cię komórkę, bez fotokonwersji otaczających komórek. W obszarze Typ przechwytywania zaznacz pole timelapse, a następnie kliknij przycisk Start.

Gdy otworzy się okno timelapse na żywo, wybierz narzędzie okrąg na górnym pasku narzędzi. Narysuj okrąg w najbardziej środkowym obszarze komórki, a następnie kliknij narysowany okrąg prawym przyciskiem myszy, wybierz Region FRAP i poczekaj trzy sekundy. Wybrany obszar powinien stać się ciemniejszy, gdy kliknie zatrzymaj przechwytywanie.

Jeśli obrazujesz więcej niż jedno zwierzę, wróć do zakładki xy w menu ostrości i wybierz pozycję drugą. Następnie powtórz fotokonwersję. Aby przekonwertować populację komórek, postępuj zgodnie z protokołem i perametrami lasera, otwierając okno timelapse.

Teraz, zamiast rysować okrąg, aby FRAP obszar zainteresowania, użyj narzędzia linii, aby narysować linię w obszarze zainteresowania. Następnie FRAP region przy użyciu tych samych parametrów, które właśnie zademonstrowano. Po fotokonwersji wszystkich punktów na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania w oknie przechwytywania wybierz standardowe ustawienie stosu specyficzne dla laboratorium opisane wcześniej w tym filmie.

Wybierz laser c488 i ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75. Wybierz laser c541 i ustaw ekspozycję na 500 milisekund, moc lasera na dziesięć, a intensyfikację na 75. W sekcji typu przechwytywania zaznacz pole 3D.

W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na jeden. Liczba zakresu może się zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do żądanej głębokości obrazowania.

Jeśli na karcie fokus xy znajdują się punkty mnożenia, w oknie przechwytywania wybierz opcję listy punktów wielokrotnych. Jeśli nie, wybierz bieżącą lokalizację. Na koniec u dołu okna przechwytywania kliknij start, aby uzyskać obraz.

Panele te pokazują pojedynczą komórkę konwersyjną przed zdjęciem, w zwoju transgenicznego danio pręgowanego, wyrażającą fotokonwertowalne białko eos, pod kontrolą sekwencji regulatorowej sox10. Po fotokonwersji eos był wyraźnie obecny w obszarze zainteresowania, podczas gdy żadne sąsiednie komórki nie zostały oznaczone. Aby zademonstrować użyteczność tej techniki fotokonwersji, populację komórek w brzusznej stronie rdzenia kręgowego wystawiono na działanie światła UV za pomocą linii.

Następnie wykonano zdjęcia pokazujące fotokonwertowane białko eos w obszarze linii. Niefotokonwertowane białko eos było widoczne we wszystkich innych obszarach. Kilka godzin po fotokonwersji wykonano identyczne obrazy, które pokazały fotoprzekształcone komórki eos dodatnie rozproszone w całym obszarze rdzenia kręgowego, zarówno w miejscu grzbietowym, jak i brzusznym.

Odkrycie to jest zgodne z hipotezą, że brzuszne komórki rdzenia przeniosły się do lokalizacji grzbietowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 do 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o zrobieniu zdjęcia po konwersji, aby potwierdzić, że region zainteresowania doświadczył fotokonwersji.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie poklatkowe, w celu obserwacji migracji komórek i dynamiki w czasie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odróżnić pojedyncze komórki w populacji komórek fluorescencyjnych. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować niezbędne środki ostrożności.

Na przykład, nigdy nie wpatruj się bezpośrednio w światło.