Name: Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj technikę fotokonwersji pojedynczych komórek u żywych nienaruszonych danio pręgowanych. Ta metoda umożliwia wizualizację migracji komórkowej w czasie rzeczywistym i pomaga odpowiadać na kluczowe pytania rozwojowe w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bernardowi Kulemace i członkom laboratorium Smitha za pomocne komentarze i wskazówki dotyczące odczynników, Samowi Connellowi i Brentowi Redfordowi z 3i za odpowiedzi na pytania dotyczące obrazowania oraz Deborah Bang, Karen Heed i Kay Stewart za opiekę nad danio pręgowanym. Prace te były wspierane przez Uniwersytet Notre Dame, rodzinę Elizabeth i Michaela Gallagherów, Fundację Alfreda P. Sloana, Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre oraz Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Notre Dame. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z IACUC Uniwersytetu Notre Dame pod kierownictwem dr Cody'ego Smitha.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame.
1. Przygotowanie okazu danio pręgowanego
<ol>
	<li>Umieść jednego dorosłego samca i jedną dorosłą samicę Tg (białko konwertowalne) w komorze krycia zgodnie ze standardowymi procedurami13. W tym manuskrypcie użyj Tg(sox10:eos) fish9 ze względu na dostęp, ale inne linie transgeniczne z białkiem fotokonwertowalnym mogą być równie dobrze stosowane. Ustaw więcej niż jedną komorę na wypadek, gdyby ryby nie leżały. Pozostaw rybę na noc w komorze</li>.
	<li>Następnego ranka zbierz jajka na 100-milimetrowe szalki Petriego. Pozwól jajom dojrzeć do 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) przed badaniem przesiewowym.</li>
	<li>Jeśli zwierzęta powyżej były heterozygotami pod względem transgenu, przebadaj 24 szalki hpf pod kątem zarodków Tg(sox10:eos)+ za pomocą źródła światła 488 nm i zestawów filtrów GFP pod mikroskopem preparacyjnym. Wyizoluj zarodki Tg(sox10:eos)+ i pozwól im dojrzeć do 48 hpf.</li>
	<li>Dekorionuj zarodki ręcznie za pomocą igły lub pęsety.</li>
	<li>Przygotować i podgrzać w kuchence mikrofalowej 5 ml 0,8% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
	<ol>
		<li>Gdy agaroza ostygnie w dotyku, umieść 3-4 znieczulone ryby Tg (sox10: eos) + 48 hpf na środku 10 mm szklanej płytki Petriego.</li>
		<li>Dodać tyle agarozy, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego, około 1 ml. Użyj igły sondy, aby ułożyć ryby na bokach. Pozwól agarozie zastygnąć, aby zapewnić dosiadanie zwierząt. Może być konieczne ciągłe przestawianie danio pręgowanego, aż agar zastygnie14. Krzepnięcie trwa około 2 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zestaleniu się agarozy przez 2 minuty, powoli dodawać pożywkę zarodkową zawierającą 0,02% ester kwasu aminobenzoesowego (trikainę) do naczynia, aż dolna powierzchnia agaru i szalki zostanie zanurzona. Powinno to być około 3 ml.</li>
</ol>
2. Montaż mikroskopu i obrazowanie przed konwersją
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ustawiania ostrości [<silna klasa="xfig">Rysunek 1]. W oknie przechwytywania wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania [Rysunek 1]. W tym przypadku ustawienie specyficzne dla laboratorium nazywa się "obrazowaniem ryb".</li>
	<li>Umieść preparat na lunecie konfokalnej i ustaw ostrość za pomocą pokręteł kursu i precyzyjnej regulacji.</li>
	<li>Otwórz okno ostrości i zlokalizuj żądany obszar zainteresowania (np. zwoje korzenia grzbietowego).</li>
	<li>Wybierz laser c488 z menu Filter Set (Zestaw filtrów). Ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i intensyfikację na 75 [<silna klasa="xfig">Rysunek 2].</li>
	<li>Zaznacz pole 3D w sekcji typu przechwytywania. W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na 1. Zakres można zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do głębokości obszaru obrazowania. Dla rdzenia kręgowego zazwyczaj wystarcza wartość zakresu między 35-40 stosów [Rysunek 5].</li>
	<li>Wybierz bieżącą lokalizację [Rysunek 5].</li>
	<li>Kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.</li>
</ol>
3. Fotokonwersja pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ustawiania ostrości [<silna klasa="xfig">Rysunek 1]. W oknie przechwytywania wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania [Rysunek 1]. W tym przypadku ustawienie specyficzne dla laboratorium nazywa się "Ryba abluje pełny chip".</li>
	<li>Wybierz laser c488 i c541 z menu Filter Set (Zestaw filtrów). Jeśli nie używasz tego samego oprogramowania mikroskopu, znajdź menu, aby wybrać różne lasery i wybierz lasery 488 nm i 541 nm. Ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i intensyfikację na 75 [<silna klasa="xfig">Rysunek 2]. Te ustawienia lasera są wybierane na podstawie wytworzenia wystarczającej ilości sygnału fluorescencyjnego bez powodowania fotowybielania lub toksyczności. Jeśli zostanie uwidoczniona toksyczność lub fotowybielanie, zmniejsz moc lasera lub ekspozycję.</li>
	<li>Otwórz okno ostrości i kliknij kartę fotomanipulacji w oknie ostrości. Dostosuj odpowiednio parametry lasera. Zmień moc stosu laserowego na 2, a następnie kliknij przycisk Przejdź. Zmień rozmiar bloku rastrowego na 1 i kliknij przycisk Ustaw. Zmień rozmiar dwukrotnego kliknięcia na 4. Zmień linię lasera na v405 [<silna klasa="xfig">Rysunek 3].</li>
	<li>Otwórz zaawansowane ustawienia przechwytywania w oknie przechwytywania. Wybierz kartę fotomanipulacji i zmień Powtórzenia dwukrotnego kliknięcia na 2. Kliknij OK [Rysunek 4].</li>
	<li>Wybierz zakładkę XY w oknie fokusu. Dokładnie sprawdź parametry lasera z kroku 2 w zakładce fotomanipulacji [<silna klasa="xfig">Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Rysunek 4]. Ustaw ustawienia lasera, aby fotokonwertować interesującą komórkę bez fotokonwersji otaczających komórek.
	<ol>
		<li>Jeśli występuje fotokonwersja sąsiednich komórek, zmniejsz moc lasera. Jeśli fotokonwersja komórek nie zachodzi, moc lasera może zostać zwiększona. Optymalnie ustaw moc lasera tak, aby fotokonwertowała tylko obszar zainteresowania, a nie otaczające obszary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaznacz pole timelapse w sekcji typ przechwytywania. Następnie kliknij Start [<silna klasa="xfig">Rysunek 6A].</li>
	<li>Gdy otworzy się okno timelapse na żywo, wybierz narzędzie okrąg na górnym pasku narzędzi [Rysunek 7]</li>
	<li>Narysuj okrąg w najbardziej środkowym obszarze komórki. Kliknij prawym przyciskiem myszy narysowany okrąg, wybierz region FRAP i poczekaj 3 sekundy. Wybrany obszar powinien stać się ciemniejszy [<silna klasa="xfig">Rysunek 8]. Kliknij przycisk Zatrzymaj przechwytywanie.</li>
	<li>Jeśli obrazujesz więcej niż jedno zwierzę, wróć do zakładki XY w menu ostrości i wybierz pozycję 2. Następnie powtórz kroki 4.1-4.6.</li>
	<li>Aby przekonwertować populację komórek, postępuj zgodnie z protokołem i parametrami lasera dla kroków 4.1-4.4, z wyjątkiem tego, że zamiast rysować okrąg w celu określenia obszaru zainteresowania metodą FRAP, użyj narzędzia linii. Narysuj linię na obszarze zainteresowania i narysuj go metodą FRAP, używając tych samych parametrów, które wymieniono powyżej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie po fotokonwersji
<ol>
	<li>Gdy wszystkie punkty zostaną fotokonwertowane. Wybierz specyficzne dla laboratorium standardowe ustawienie stosu obrazów opisane w kroku 3 obrazowania przed kowersją. Znajduje się to na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania w oknie przechwytywania [Rysunek 5].</li>
	<li>Wybierz laser c488 i ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i zintensyfikuj na 75 [<silna klasa="xfig">Rysunek 2].</li>
	<li>Wybierz laser c541 znajdujący się w tym samym menu, co laser c488. Ustaw ekspozycję na 500 ms, moc lasera na 10 i intensyfikację na 75 [<silna klasa="xfig">Rysunek 9].</li>
	<li>Zaznacz pole 3D w sekcji typu przechwytywania. W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na 1. Liczba zakresów może się zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do żądanej głębokości obrazowania [<silna klasa="xfig">Rysunek 5].</li>
	<li>Jeśli na karcie ostrości XY znajduje się wiele punktów, wybierz opcję listy punktów wielopunktowych w oknie przechwytywania. Jeśli nie, wybierz bieżącą lokalizację.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W złożonych tkankach różne typy komórek organizują się w określone domeny. Ostatnio zastosowano techniki znakowania pojedynczych komórek w tych dużych strukturach tkankowych 1,2,3. Tutaj pokazujemy dwie techniki, które można podobnie wykorzystać do wizualizacji zarówno interakcji pojedynczych komórek, jak i interakcji populacji komórek w złożonych tkankach. Zaletą techniki fotokonwersji jest kontrola przestrzenna, którą naukowie...

Wiele odrębnych komórek współdziała ze sobą, budując i utrzymując złożone tkanki zwierzęce i roślinne. Komórki te są często interkalowane i trudne do odróżnienia od sąsiadów na poziomie pojedynczej komórki bez mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, która wymaga utrwalenia tkanki. Jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób te tkanki powstają, są utrzymywane i stają się chore, konieczne było zbadanie, w jaki sposób pojedyncze komórki w tkance oddziałują na siebie w czasie. W idealnej sytuacji eksperymenty te wymagają znakowania pojedynczych komórek w tkance w sposób nieinwazyjny, bez konieczności utrwalania. Naukowcy opracowali wiele technik, aby wykonać to zadanie1,2,3,4.
Odkrycie i implementacja białka zielonej fluorescencji meduzy (GFP) było jednym z ekscytujących podejść, które pozwoliło na znakowanie odrębnych komórek w środowisku tkankowym1. Korzystając z promotorów specyficznych dla komórki, możliwe jest genetyczne wybranie podzbioru komórek, które są oznaczone jako 1. Alternatywnie, indukowana przez wirusa ekspresja GFP może być wykorzystana do wybranej przez użytkownika ekspresji GFP3,4. Chociaż jest to całkiem użyteczne, ekspresja GFP za pośrednictwem genetyki nie pozwala na ekspresję wybraną przez użytkownika w podzbiorze komórek w tkance; a ekspresja wirusa GFP, choć korzystna, może być inwazyjna. Wraz z pojawieniem się pochodnych GFP i sprytnych technik, takich jak Brainbow, do rzadszej ekspresji odrębnych białek fluorescencyjnych w tkankach, możliwa stała się wizualizacja pojedynczych komórek i interakcji między nimi w złożonej tkance2,5. Jednak te podejścia oznaczają komórki w sposób losowy. Jeśli pożądany eksperyment wymaga wizualizacji pojedynczej komórki lub populacji komórek, która jest zdefiniowana przez eksperymentatora, są one zatem ograniczone. Przy takich eksperymentach korzystne byłoby posiadanie genetycznie wyrażonego białka fluorescencyjnego, którym można manipulować w celu odróżnienia, w sposób jednokomórkowy, od innych komórek fluorescencyjnych i niefluorescencyjnych.
Aby osiągnąć ten cel i zobrazować biologię pojedynczych komórek w złożonej żywej tkance, społeczność naukowa wykorzystuje fotokonwersję pojedynczych komórek różnych białek fluorescencyjnych6,7,8. Korzystając z genetycznie kontrolowanej ekspresji białka fotokonwertowalnego (tj. eos, kaede itp.), które przechodzi ze stanu zielonej do czerwonej fluorescencji pod wpływem światła UV (488 nm), możemy odróżnić pojedynczą komórkę od jej fluorescencyjnie znakowanych sąsiadów6,7,8. Podejście to wykorzystuje aparaturę dołączoną do naszego mikroskopu konfokalnego, która może skierować światło ze stosu laserowego do obszaru zainteresowania ograniczonego dyfrakcją. Dzięki tej technice możemy oznaczać pojedyncze komórki lub większe populacje w sposób zdefiniowany przez użytkownika9,10,11. Technika ta jest minimalnie inwazyjna w porównaniu z iniekcjami wirusa GFP z pojedynczych komórek. Jako dowód słuszności koncepcji pokazujemy, że możemy fotokonwertować pojedyncze komórki w zwoju obwodowego układu nerwowego i fotokonwertować większe populacje, takie jak komórki znajdujące się po brzusznej stronie rdzenia kręgowego9,10,11,12. Następnie możemy wizualizować te fotokonwertowane populacje komórek 24 godziny później, aby uzyskać wgląd w ich ruch i różnicowanie podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) danio pręgowany, zwierzęta</td><td></td><td></td><td>Ryby zostały pozyskane i skrzyżowane z zakładu rybnego na Uniwersytecie Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm</td><td>szalka Petriego VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże</td><td></td><td></td> <td>zarodkowePożywka zarodkowa jest wytwarzana co tydzień i dostarczana przez zakład rybny na Uniwersytecie Notre Dame, zawierający 5 litrów wody RO, 30 ml błękitu metylenowego i 200 ml bulionu solnego.</td></tr><tr><td>0,8% Niska temperatura topnienia Agaroza</td><td>kropka scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm szklana nakrywkowa dolna szalka Petriego</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr>Sonda <td></td><td></td><td></td><td>preparcyjna igłowa</td></tr><tr><td>0,002% ester kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina)</td><td>Fluka analityczny</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny z filtrami GFP</td> Mikroskop konfokalny <td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z laserami do wzbudzania GFP i RFP zestawy filtrów</td><td>3i z wirującym dyskiem konfokalnym</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła UV (laser) do fotokonwersji</td> Laser <td></td><td></td><td>405 nm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do slajdów</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Tkanka zwierzęca i roślinna składa się z odrębnych populacji komórek. Komórki te oddziałują na siebie z czasem, aby zbudować i utrzymać tkankę i mogą powodować choroby, gdy są zakłócone. Naukowcy opracowali sprytne techniki badania cech i naturalnej dynamiki tych komórek w nienaruszonej tkance poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych w podzbiorach komórek. Czasami jednak eksperymenty wymagają bardziej wyselekcjonowanej wizualizacji komórek w tkance, czasami w sposób jednokomórkowy lub populacyjny komórek. Aby to osiągnąć i zobrazować pojedyncze komórki w populacji komórek, naukowcy wykorzystali fotokonwersję białek fluorescencyjnych w pojedynczych komórkach. Aby zademonstrować tę technikę, pokazujemy tutaj, jak skierować światło UV do interesującej nas komórki wyrażającej Eos w nienaruszonym, żywym daniu pręgowanym. Następnie obrazujemy te fotokonwertowane komórki Eos+ 24 godziny później, aby określić, jak zmieniły się w tkance. Opisujemy dwie techniki: fotokonwersję pojedynczej komórki i fotokonwersje populacji komórek. Techniki te mogą być wykorzystywane do wizualizacji interakcji komórka-komórka, losu i różnicowania komórek oraz migracji komórek, co czyni ją techniką mającą zastosowanie w wielu kwestiach biologicznych.

Fotokonwersję białek fluorescencyjnych można wykorzystać do znakowania poszczególnych komórek w obrębie tkanki6. Aby to zademonstrować, wykorzystano ryby Tg(sox10:eos)9 do ekspresji fotokonwertowalnego białka Eos pod sekwencjami regulacyjnymi genu sox10. Zwierzęta Tg(sox10:eos) w 48 hpf najpierw zamontowano, a następnie wykonano obrazowanie w celu wykrycia ewentualnej nieswoistej fotokonwersji. Zauważono sygnał flu...

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Ogólnym celem tej techniki fotokonwersji jest odróżnienie pojedynczych komórek w pojedynczym zwierzęciu od innych populacji komórek fluorescencyjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania rozwojowe w tej dziedzinie i pozwolić nam na wizualizację migracji pojedynczych komórek w czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest minimalnie inwazyjna i może być używana do znakowania pojedynczych komórek lub większych populacji.Dodatkowo użytkownik może wybrać konkretny region zainteresowania i przekonwertować zdjęcie na żądany cel. Po kryciu samców i samic transgenicznego danio pręgowanego wykazujących ekspresję białka fotokonwertowalnego i zebraniu jaj zgodnie z protokołem tekstowym, użyj mikroskopu preparacyjnego ze źródłem światła 488 nanometrów i zestawami filtrów GFP do badania przesiewowego 24 zarodków hpf. Za pomocą igły lub pęsety ręcznie usuń zarodki.Przygotuj w kuchence mikrofalowej pięć mililitrów 0,8% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Gdy agaroza schłodzi się w dotyku, umieść trzy do czterech znieczulonych transgenicznych ryb sox10 eos dodatnich 48 hpf na środku dziesięciomilimetrowej szklanej płytki Petriego na dnie. Dodać około jednego milimetra lub tyle agarozy, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego.Następnie za pomocą igły sondy ułóż ryby na bokach, dostosowując je w razie potrzeby, podczas gdy agaroza zestala się, co zajmie około dwóch minut. Po zestaleniu się agarozy przez dwie minuty, powoli dodawać do naczynia pożywkę zarodkową zawierającą 0,02% ester kwasu aminobenzoesowego trikainę, aż dolna powierzchnia agaru i naczynia zostanie zanurzona. Aby przeprowadzić mikroskopię konfokalną, otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ostrości.Aby przeprowadzić obrazowanie przed konwersją, w oknie przechwytywania i na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania wybierz parametry obrazowania. Oto ustawienie stosu specyficzne dla laboratorium, które nazywa się obrazowaniem ryb. Umieść preparat w mikroskopie konfokalnym i użyj pokręteł regulacji zgrubnej i precyzyjnej, aby ustawić ostrość.Następnie otwórz okno ostrości i zlokalizuj żądany obszar zainteresowania, taki jak zwój korzenia grzbietowego. W menu zestawu filtrów wybierz laser c488, ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75. Następnie w sekcji typu przechwytywania zaznacz pole 3D.W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na jeden. Wybierz bieżącą lokalizację, a następnie kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.Przed procesem fotokonwersji należy dwukrotnie i trzykrotnie sprawdzić parametry lasera. Czasami konieczne jest ponowne dostosowanie ustawień konwersji, gdy okno konwersji jest otwarte. W oknie przechwytywania, na karcie rozwijanej ustawień okna przechwytywania, wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium.Tutaj nazywa się to ustawieniem specyficznym dla laboratorium, ryba abluje pełny chip. Z zestawu menu filtrów wybierz lasery c488 i c541. Ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75, co wytworzy wystarczającą ilość sygnału fluorescencyjnego bez powodowania fotowybielania lub toksyczności.W oknie ostrości kliknij kartę fotomanipulacji i zmień moc laserstack na dwa, a następnie kliknij przejdź. Zmień rozmiar bloku rastrowego na jeden i kliknij przycisk Ustaw. Następnie zmień rozmiar dwukrotnego kliknięcia na cztery, a linię lasera na v405.Następnie w oknie przechwytywania otwórz zaawansowane ustawienia przechwytywania. Wybierz kartę manipulacji zdjęciami i zmień powtórzenia dwukrotnego kliknięcia na dwa, a następnie kliknij OK. Wybierz kartę xy w oknie fokusu.W zakładce fotomanipulacji dokładnie sprawdź parametry lasera. Następnie ustaw ustawienia lasera, aby fotokonwertować interesującą Cię komórkę, bez fotokonwersji otaczających komórek. W obszarze Typ przechwytywania zaznacz pole timelapse, a następnie kliknij przycisk Start.Gdy otworzy się okno timelapse na żywo, wybierz narzędzie okrąg na górnym pasku narzędzi. Narysuj okrąg w najbardziej środkowym obszarze komórki, a następnie kliknij narysowany okrąg prawym przyciskiem myszy, wybierz Region FRAP i poczekaj trzy sekundy. Wybrany obszar powinien stać się ciemniejszy, gdy kliknie zatrzymaj przechwytywanie.Jeśli obrazujesz więcej niż jedno zwierzę, wróć do zakładki xy w menu ostrości i wybierz pozycję drugą. Następnie powtórz fotokonwersję. Aby przekonwertować populację komórek, postępuj zgodnie z protokołem i perametrami lasera, otwierając okno timelapse.Teraz, zamiast rysować okrąg, aby FRAP obszar zainteresowania, użyj narzędzia linii, aby narysować linię w obszarze zainteresowania. Następnie FRAP region przy użyciu tych samych parametrów, które właśnie zademonstrowano. Po fotokonwersji wszystkich punktów na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania w oknie przechwytywania wybierz standardowe ustawienie stosu specyficzne dla laboratorium opisane wcześniej w tym filmie.Wybierz laser c488 i ustaw ekspozycję na 300 milisekund, moc lasera na pięć, a intensyfikację na 75. Wybierz laser c541 i ustaw ekspozycję na 500 milisekund, moc lasera na dziesięć, a intensyfikację na 75. W sekcji typu przechwytywania zaznacz pole 3D.W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na jeden. Liczba zakresu może się zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do żądanej głębokości obrazowania.Jeśli na karcie fokus xy znajdują się punkty mnożenia, w oknie przechwytywania wybierz opcję listy punktów wielokrotnych. Jeśli nie, wybierz bieżącą lokalizację. Na koniec u dołu okna przechwytywania kliknij start, aby uzyskać obraz.Panele te pokazują pojedynczą komórkę konwersyjną przed zdjęciem, w zwoju transgenicznego danio pręgowanego, wyrażającą fotokonwertowalne białko eos, pod kontrolą sekwencji regulatorowej sox10. Po fotokonwersji eos był wyraźnie obecny w obszarze zainteresowania, podczas gdy żadne sąsiednie komórki nie zostały oznaczone. Aby zademonstrować użyteczność tej techniki fotokonwersji, populację komórek w brzusznej stronie rdzenia kręgowego wystawiono na działanie światła UV za pomocą linii.Następnie wykonano zdjęcia pokazujące fotokonwertowane białko eos w obszarze linii. Niefotokonwertowane białko eos było widoczne we wszystkich innych obszarach. Kilka godzin po fotokonwersji wykonano identyczne obrazy, które pokazały fotoprzekształcone komórki eos dodatnie rozproszone w całym obszarze rdzenia kręgowego, zarówno w miejscu grzbietowym, jak i brzusznym.Odkrycie to jest zgodne z hipotezą, że brzuszne komórki rdzenia przeniosły się do lokalizacji grzbietowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 do 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o zrobieniu zdjęcia po konwersji, aby potwierdzić, że region zainteresowania doświadczył fotokonwersji.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie poklatkowe, w celu obserwacji migracji komórek i dynamiki w czasie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odróżnić pojedyncze komórki w populacji komórek fluorescencyjnych. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować niezbędne środki ostrożności.Na przykład, nigdy nie wpatruj się bezpośrednio w światło.

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Stworzyliśmy fotokonwertowalny system PSmOrange jako potężne, proste i tanie narzędzie do śledzenia komórek in vivo w transgenicznym tle GFP. Protokół ten opisuje jego zastosowanie w systemie modeli danio pręgowanego.

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Poznaj technikę fotokonwersji pojedynczych komórek u żywych nienaruszonych danio pręgowanych. Ta metoda umożliwia wizualizację migracji komórkowej w czasie rzeczywistym i pomaga odpowiadać na kluczowe pytania rozwojowe w biologii komórki.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów