Name: Mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metody oceny leków przeciwalkoholowych w modelach mysich zaburzeń używania alkoholu. Protokół TBC i DID pozwala badać skuteczność terapii oraz neurobiologię uzależnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty badawcze SC CTSI NIH/NCRR/ NCATS -- UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) oraz USC School of Pharmacy.

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Kampusu Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Południowej Kalifornii.
1. Eksperymentalna konfiguracja i montaż
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem badania zaopatrz się we wszystkie następujące materiały i chemikalia: myszy, klatki/metalowe blaty klatek, pościel, żywność, woda, etanol, pipety, nasadki do napojów, folia termokurczliwa, nóż uniwersalny, opaski zaciskowe, taśma, palnik Bunsena, waga, czołówka.</li>
	<li>Pozyskaj myszy C57BL/6J, pochodzące ze źródła komercyjnego lub z własnej kolonii, pamiętając, że myszy mogą być trzymane w grupach do czasu testów. 
	UWAGA: Całkowita liczba pozyskanych myszy zależy od złożoności projektu eksperymentalnego. Zaplanuj zakwaterowanie około 12-15 myszy w grupie, przy czym badania pilotażowe nie będą mniejsze niż 5-7 myszy na grupę. W reprezentatywnych wynikach przedstawionych poniżej zastosowaliśmy prostą konfigurację dwugrupową w celu oceny związku przyczynowo-skutkowego przy użyciu pojedynczej dawki (5 mg/kg) leku (MOX).</li>
	<li>Wykonaj poniższe czynności, aby złożyć bottles18.
	<ol>
		<li>Podgrzej nóż uniwersalny za pomocą palnika Bunsena.</li>
		<li>Za pomocą tego noża odetnij około cala od górnego i dolnego końca plastikowej pipety serologicznej o pojemności 18 ml.
		<ol>
			<li>Należy pamiętać, że pipety o mniejszej objętości (np. 10 ml) mogą być również używane w celu zwiększenia precyzji pomiaru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podgrzej pipetę pod opalarką.</li>
		<li>Włóż rurkę wtryskową z łożyskiem kulkowym do "dolnego" końca pipety (innymi słowy, do otworu znajdującego się najbliżej linii kreskowej 18 ml).</li>
		<li>Uszczelnij rurkę rozsączającą na miejscu folią termokurczliwą za pomocą dostępnego w handlu pistoletu do folii termokurczliwej.</li>
		<li>Zakryj drugi otwór silikonowym korkiem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przyzwyczajenie zwierząt
<ol>
	<li>Rozpoczynając co najmniej 1 tydzień przed datą rozpoczęcia doświadczenia, należy przenieść myszy do pomieszczenia, w którym mają być przeprowadzone procedury doświadczalne, aby mogły zaaklimatyzować się do warunków hodowli (w tym temperatury otoczenia (21 ± 1 °C) i 12-godzinnego odwróconego cyklu światła/ciemności, przy wyłączonym świetle o godzinie 12 w południe). Pamiętaj, aby postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i powiadomić odpowiednie kanały przed przeniesieniem zwierząt z jednego miejsca do drugiego.
	<ol>
		<li>Jeśli myszy są przenoszone ze standardowego cyklu światło/ciemność, odczekaj 2 tygodnie dodatkowego czasu przyzwyczajenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij nowo przygotowane butelki po brzegi wodą. Upewnij się, że nakrętka jest dobrze zamknięta i pozbawiona pęcherzyków powietrza lub wycieków z wylewki. Jeśli roztwór przecieka, ponownie zabezpiecz nasadkę. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, po prostu stukając w butelkę, aby powietrze mogło uciec z rurki.</li>
	<li>Po przyjeździe pojedynczo umieść każdą mysz w standardowych klatkach z poliwęglanu/polisulfonu z pościelą i metalową siatką; zdejmij pokrywę klatki, ponieważ nie będzie już używana.
	<ol>
		<li>Zapewnij dostęp do butelek z jedzeniem i wodą ad libitum.</li>
		<li>Przymocuj każdą butelkę do górnej części klatki, owijając każdą butelkę plastikową opaską zaciskową, aby utrzymać ją na miejscu. Odetnij nadmiar plastiku z opaski zaciskowej, aby upewnić się, że nie wystawa do klatki. 
		UWAGA: Do procedury picia w ciemności (DID) wymagana jest tylko jedna butelka wody. Przyzwyczajenie się do paradygmatu wyboru dwóch butelek (TBC) wymaga jednak, aby klatka zawierała dwie butelki wody. Jeśli dostarczony metalowy zbiornik siatkowy jest przeznaczony do przechowywania tylko jednej butelki roztworu, delikatnie rozsuń jego pręty, aby zrobić miejsce na dodatkową płytkę, na którą pomieści się druga butelka do TBC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw co najmniej 3 klatki sterujące bez myszy. Pozwoli to na monitorowanie wszelkich ubytków płynów spowodowanych parowaniem lub rozlaniem z butelek, co jest po prostu naturalnym zjawiskiem, które ma miejsce, gdy klatki są umieszczane na stojaku na klatki i poza nim (patrz kroki 2.6.3, 3.6.1 i 4.6.1 dla równań).</li>
	<li>Począwszy od 4 dnia 1-tygodniowej aklimatyzacji w pojedynczym pomieszczeniu, zmierz i zapisz dzienną masę ciała i pokarmu każdej myszy za pomocą skali (w gramach), a także spożycie wody, używając wytrawień wzdłuż odwróconej butelki, aby zarejestrować najwyższy punkt łąkotki (w ml).
	<ol>
		<li>Podczas gdy standardową praktyką naukową jest odczytywanie najniższego punktu wklęsłego menisku, ponieważ butelki pozostają w pozycji odwróconej podczas pomiaru, należy zapisać najwyższy punkt łąkotki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń parametry 2.5 za pomocą poniższych równań:
	<ol>
		<li>Zmierz zmianę masy ciała (g): waga z bieżącego dnia (g) - waga z poprzedniego dnia (g).</li>
		<li>Zmierz spożycie pokarmu (g): waga jedzenia w poprzednim dniu (g) - waga żywności w dniu bieżącym (g).</li>
		<li>Zmierz spożycie wody (ml): [objętość wody w dniu bieżącym (ml) - objętość wody w poprzednim dniu (ml)] - średnia utrata wody ze wszystkich klatek kontrolnych (ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.5 kolejno, w dniach 5-7, aby umożliwić określenie linii podstawowej dla trzech dni bezpośrednio poprzedzających wprowadzenie etanolu. Jeżeli nie można uzyskać kolejnego zapisu, należy przedłużyć okres aklimatyzacji, aby umożliwić ocenę pomiarów podstawowych.</li>
	<li>Gdy spożycie wody ustabilizuje się do ± 10% zmienności w stosunku do średniej z ostatnich 3 dni, rozpocznij dostęp do etanolu z TBC (nieograniczony dostęp) lub DID (ograniczony dostęp). 
	UWAGA: W rzadkich przypadkach może być potrzebny jeden do dwóch dodatkowych dni, aby badani osiągnęli tę stabilność; Nie przejmuj się, jeśli potrzebny jest dodatkowy czas, aby wartości wyświetliły ±10% zmienności w stosunku do średniej z ostatnich 3 dni.</li>
</ol>
3. 24-godzinny wybór dwóch butelek (TBC)
Uwaga: Schemat jest przygotowany w Rysunek 1.
<ol>
	<li>Przygotuj 10% (v/v) roztwór etanolu o objętości 500 ml, dodając 52,65 ml etanolu ze 190 prowiozów zbożowych (~95% etanolu) do 447,35 ml H2O; pamiętaj, aby dokładnie wstrząsnąć. Biorąc pod uwagę, że etanol szybko odparowuje, roztwór należy wymieniać co 3-4 dni. 
	UWAGA: Można również stosować inne stężenia etanolu, ale autorzy zalecają stężenie 10% dla tego modelu.</li>
	<li>Pierwszego dnia TBC (najwcześniej w 8 dniu) opróżnij 1 z 2 butelek wody w każdej klatce i napełnij ją po brzegi świeżo przygotowanym roztworem etanolu. Biorąc pod uwagę, że etanol i wodę trudno jest wizualnie odróżnić, wyraźnie oznacz butelki odpowiednią zawartością. Wystarczy przyłożyć kawałek taśmy maskującej do butelki i oznaczyć ją markerem lub pisząc bezpośrednio na butelce.</li>
	<li>W razie potrzeby dodaj więcej roztworu do butelki z wodą.</li>
	<li>Umieść butelki z powrotem na klatce, upewniając się, że wszystkie nakrętki są dobrze zamknięte i pozbawione pęcherzyków powietrza lub wycieków z dziobka. Jeśli roztwór przecieka, ponownie zabezpiecz nasadkę. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, po prostu stukając w butelkę, aby powietrze mogło uciec z butelki.</li>
	<li>Zmieniaj położenie butelek co drugi dzień, aby skorygować wpływy związane z preferencjami dotyczącymi miejsca w spożywaniu alkoholu (więcej informacji można znaleźć w Dyskusji).</li>
	<li>Oprócz codziennych pomiarów od 2,5 i 2,6, które są w toku, zacznij również odczytywać i rejestrować poziomy spożycia etanolu. Przeanalizuj 10% spożycie etanolu i stosunek preferencji, korzystając z następujących równań:
	<ol>
		<li>Zmierz 10% spożycie etanolu (ml): [objętość etanolu w dniu bieżącym (ml) - objętość etanolu w poprzednim dniu (ml))] - średnia strata etanolu ze wszystkich klatek kontrolnych (ml).</li>
		<li>Zmierz 10% spożycie etanolu (g / kg): [10% spożycia etanolu (ml) x 0,07893 g / ml] / masa ciała (kg).</li>
		<li>Zmierz preferencję %: [10% spożycia etanolu (ml) / wody (ml)] x 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy tylko spożycie etanolu ustabilizuje się, podaj pojedynczą kontrolną (solę fizjologiczną) dootrzewnową (i.p.) wstrzyknięcie (0,01 ml / g masy ciała) każdej myszy podczas codziennej rutyny pomiarowej. W ten sposób badani przyzwyczajają się do samego wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Stabilność definiuje się jako ± 10% zmienności w stosunku do średniej z ostatnich 3 dni (tak samo jak w sekcji 2.8). 
		UWAGA: Ustabilizowanie się poziomu etanolu może potrwać do 1 tygodnia. Jest to szczególnie ważne, jeśli myszy są ponownie wykorzystywane z poprzedniego eksperymentu i miały wcześniejszą ekspozycję na etanol. Kontrola to po prostu rozpuszczalnik używany do rozpuszczenia leku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przywróceniu linii bazowej etanolu o niskiej zmienności podziel myszy na grupy dawkowania, używając wartości spożycia etanolu, tak aby wszystkie grupy miały mniej więcej podobne średnie wartości spożycia etanolu.
	<ol>
		<li>Oznacz jedną grupę jako grupę kontrolną (kontynuującą otrzymywanie soli fizjologicznej), a drugą jako eksperymentalną (np. wstrzyknięcie badanego leku w dawce 0,01 ml/g masy ciała). Rozpocznij codzienne dawkowanie leku, na ostry lub wielodniowy okres. Następnie kontrola może zostać ponownie wprowadzona w celu zbadania skutków polekowych (opcjonalnie). 
		UWAGA: Ponieważ picie jest monitorowane przez 24 godziny, czas podawania dawki nie jest zależny od ciemnego cyklu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Picie w ciemności (DID)
UWAGA: Schemat jest przygotowany w Rysunek 3.
<ol>
	<li>W każdym dniu zaplanowanego dostępu do etanolu (dni 1-4) rejestruj pomiary objętości wody, spożycia pokarmu i masy ciała oraz wykonuj dawkowanie leków. Należy to zrobić w wybranym czasie cyklu świetlnego, który jest wybrany zgodnie z farmakokinetyką leku, tak aby związek był na poziomie lub zbliżał się do maksymalnego stężenia w mózgu w okresie picia. 
	UWAGA: Pamiętaj, że dni 1-3 mają na celu po prostu przyzwyczajenie myszy do picia dużych ilości etanolu w krótkim czasie. Podczas gdy myszy nie osiągają poziomów BEC porównywalnych z ludzkim 0,08; Te "treningowe" dni zapewniają, że w czwartym dniu, podczas nieco dłuższej sesji picia, faktycznie będą pić do tego poziomu.
	<ol>
		<li>Podaj wszystkim myszom kontrolę (sól fizjologiczną) w dniach 1-3, a kontrolę lub lek w 4 dniu. Ta procedura DID odbywa się w ciągu 3 tygodni i obejmuje sesję picia przed przyjęciem leku (tydzień 1), lekiem (tydzień 2) i po narkotyku (tydzień 4).</li>
		<li>UWAGA: Należy zauważyć, że w tygodniu dawkowania leku, poziomy spożycia etanolu w dniu 3 są wykorzystywane do przypisania myszy do grupy kontrolnej lub grupy leku w taki sposób, aby poziomy spożycia etanolu w obu grupach miały najmniejszą zmienność. W przeciwieństwie do TBC, które przypisuje grupy na podstawie średniej z 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 20% (v/v) roztwór etanolu (20E) o objętości 500 ml, dodając 105,25 ml etanolu ze 190 proof grainu (~95% etanolu) do 394,75 mlH2O; pamiętaj, aby dokładnie wstrząsnąć.</li>
	<li>Napełnij butelki z etanolem przed rozpoczęciem sesji picia, tak aby zaraz po rozpoczęciu DID butelki z wodą można było po prostu zastąpić butelkami z alkoholem.</li>
	<li>Podczas całej sesji DID (kroki 4.5 - 4.8) używaj reflektora z czerwonym światłem, aby nie przeszkadzać zwierzętom.</li>
	<li>Na początku sesji picia DID, zaplanowanej na 3 godziny w ciemnym cyklu, zapisz objętość wody dla każdej myszy. Następnie zastąp każdą butelkę z wodą butelką roztworu 20E i zapisz początkową objętość etanolu.</li>
	<li>Przeczytaj i zapisz końcową objętość etanolu 2 godziny później, pod koniec sesji picia w dniach 1-3 i 4 godziny później w dniu 4. Przeanalizuj 20% spożycie etanolu, korzystając z poniższych równań.
	<ol>
		<li>Zmierz 20% spożycie etanolu (ml): [objętość etanolu na koniec sesji picia (ml) - objętość etanolu na początku sesji picia (ml)] - średnia utrata etanolu ze wszystkich klatek kontrolnych (ml).</li>
		<li>Zmierz 20% spożycia etanolu (g/kg): [20% spożycia etanolu (ml) x 0,15786 g/mL] / masę ciała (kg).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tylko w 4 dniu, bezpośrednio po zarejestrowaniu objętości etanolu, a przed ponownym wprowadzeniem dostępu do wody, należy pobrać krew w celu oceny stężenia etanolu we krwi każdej myszy (opcjonalnie). 
	UWAGA: Można zastosować dowolną nieterminalną metodę pobierania krwi, taką jak pobieranie krwi z zatoki zaoczodołowej lub pobieranie krwi z żyły odpiszczelowej. Aby zapoznać się z przydatnymi protokołami, zobacz referencje dla Parasuraman et al.21 oraz Yardley et al.20.
	<ol>
		<li>Wykonuj analizy przy użyciu różnych metod, w tym LCMS lub dostępnych na rynku maszyn (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamień wszystkie butelki etanolu na butelki z wodą i zapisz objętość wody.</li>
</ol>

<ol><li>Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+Development%2C+and+Adoption+of+Medications+to+Treat+Alcohol+Use+Disorder%3A+Goals+for+the+Phases+of+Medications+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).</li>
<li>Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+12-month+prevalence+and+trends+in+DSM-IV+alcohol+abuse+and+dependence%3A+United+States%2C+1991-1992+and+2001-2002%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Alcohol+Dependence%22%5BJournal%5D)">The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002.</a> Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).</li>
<li>Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+and+State+Costs+of+Excessive+Alcohol+Consumption%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Preventive+Medicine%22%5BJournal%5D)">National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption.</a> American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).</li>
<li>Litten, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medications+development+to+treat+alcohol+dependence%3A+a+vision+for+the+next+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade.</a> Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).</li>
<li>Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf">http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20516163">Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism.</a> American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).</li>
<li>Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+medications+for+the+treatment+of+alcohol+use+disorder%3A+An+evaluation+of+clinical+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Substance+Abuse%22%5BJournal%5D)">Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety.</a> Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).</li>
<li>Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25833016">Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental.</a> Research. 39 (4), 579-584 (2015).</li>
<li>Schuckit, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1530-0277.2001.tb02217.x/abstract">A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).</li>
<li>Batki, S. L., Pennington, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Personalized+Medicine+in+the+Pharmacotherapy+of+Alcohol+Use+Disorder%3A+Targeting+Patient+Genes+and+Patient+Goals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals.</a> American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).</li>
<li>Koob, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+frameworks+and+mechanistic+aspects+of+alcohol+addiction%3A+alcohol+addiction+as+a+reward+deficit+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+behavioral+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).</li>
<li>Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+ethanol+consumption+in+22+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains.</a> Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).</li>
<li>Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+simple+model+of+ethanol+drinking+to+intoxication+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice.</a> Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).</li>
<li>Thiele, T. E., Navarro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Drinking+in+the+dark%22+%28DID%29+procedures%3A+A+model+of+binge-like+ethanol+drinking+in+non-dependent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">"Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice.</a> Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).</li>
<li>Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+preference+drinking+in+a+mouse+line+selectively+bred+for+high+drinking+in+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark.</a> Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).</li>
<li>Sprow, G. M., Thiele, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+binge-like+ethanol+drinking%3A+Evidence+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models.</a> Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).</li>
<li>Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+signaling+in+neuroadaptations+underlying+alcohol-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).</li>
<li>Huynh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+development+of+moxidectin+as+a+novel+therapeutic+for+alcohol+use+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder.</a> Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).</li>
<li>Egli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+experimental+paradigms+and+animal+models+be+used+to+discover+clinically+effective+medications+for+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism.</a> Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).</li>
<li>Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+an+Orally+Dissolving+Strip+for+Pharmacological+and+Toxicological+Studies%3A+A+Simple+and+Humane+Alternative+to+Oral+Gavage+for+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Yardley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivermectin+reduces+alcohol+intake+and+preference+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice.</a> Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21350616">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
</ol>

DLD i LA są wynalazcami patentu na zmianę przeznaczenia iwermektyny i pokrewnych awermektyn w leczeniu zaburzeń związanych z używaniem alkoholu. Autorzy nie pozostają w żadnym innym konflikcie interesów i ponoszą całkowitą odpowiedzialność za zawartość naukową artykułu.

Szacunki na całym świecie wskazują, że aż 76 milionów osób spełnia kryteria uzasadniające diagnozę zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (AUD). Niestety, obecnie dostępne terapie farmaceutyczne są w dużej mierze nieskuteczne i konieczny jest dalszy rozwój, aby zrównoważyć potrzeby tej populacji klinicznej20. W tym celu poniższy protokół ma na celu ułatwienie tego przedsięwzięcia poprzez zilustrowanie dwóch najbardziej podstawowych paradygmatów picia gryzoni: wyboru dwóch butelek (TBC) i picia w...

Przez ostatnie ponad 25 lat włożono wiele wysiłku w opracowanie leków do leczenia zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (AUD)1. Chociaż poczyniono wiele postępów, AUD nadal pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego, dotykającym ponad 18 milionów Amerykanów i kosztującym ponad 220 miliardów dolarów rocznie2,3. Obecnie istnieją tylko trzy leki zatwierdzone przez FDA, disulfiram, naltrekson i akamprozat, z których wszystkie przyniosły niespójne wyniki w badaniach klinicznych i ograniczone sukcesy, nawet w połączeniu z interwencją psychospołeczną w warunkach klinicznych4,5,6,7.
Główny powód niepowodzeń obecnej terapii AUD jest związany z heterogeniczną naturą AUD8. Podczas gdy zarówno czynniki środowiskowe, jak i genetyczne przyczyniają się do rozwoju AUD, odziedziczalność stanowi około 50 - 60% ryzyka wystąpienia AUD9. Podobnie jak w przypadku leczenia depresji, powszechnie przyjmuje się, że pacjenci cierpiący na AUD będą potrzebować różnych leków, które są dostosowane do potrzeb każdego pacjenta10.
Najwyraźniej istnieje pilna potrzeba bardziej skutecznych metod leczenia, które byłyby ułatwione, gdyby już i tak żmudny i czasochłonny proces odkrywania leków został usprawniony3. W tym celu poniższy protokół demonstruje przedkliniczne zastosowanie dwóch modeli picia gryzoni szeroko stosowanych do badania neurobiologicznych podstaw AUD11. Mówiąc dokładniej, przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda może ocenić skuteczność związków kandydujących w zmniejszaniu spożycia alkoholu zarówno w scenariuszach "umiarkowanego", jak i "upijania się", wykorzystując odpowiednio paradygmat wyboru dwóch butelek (TBC) i picia w ciemności (DID). Oba paradygmaty badają samodzielne podawanie etanolu w sposób nieoperacyjny, w którym myszy spożywają etanol doustnie i do woli, a zatem ilustrują wysoką twarz i konstruują trafność jako model ludzkiego alkoholizmu11.
W piciu TBC, znanym również jako picie z wolnego wyboru, picie preferowane lub picie towarzyskie, dwie butelki roztworu są stale dostępne w klatce domowej. Jedna butelka zawiera wodę, a druga rozcieńczony roztwór etanolu, dzięki czemu stężenie etanolu może być zróżnicowane (np. 5 - 30% v/v)11,12. Myszy mają stały dostęp do obu butelek, dzięki czemu mogą wybrać, ile chcą wypić z każdej butelki.
Ten model ocenia zużycie etanolu przez każdą mysz (g/kg), a także stosunek preferencji etanolu (objętość zużytego etanolu ÷ całkowita objętość spożytego płynu). Jest rutynowo używany do porównywania poziomów picia u różnych szczepów myszy lub po określonej manipulacji genetycznej (np. nokaut genowy lub knockdown) i skutkuje stężeniem etanolu we krwi (BEC) podobnym do tego, jakie występuje u ludzi podczas picia z umiarem13,14.
W procedurze DID, 3 godziny po rozpoczęciu ciemnego cyklu, butelka wody w klatce domowej jest wymieniana na butelkę z 20% (v/v) roztworem etanolu na sesję picia o ograniczonym dostępie. Sesje picia odbywają się jako następujący po sobie 4-dniowy cykl, trwający 2 godziny w dniach 1 - 3 i 4 godziny w dniu 4. Dni 1-3 służą jako okres przyzwyczajenia do alkoholu przed badaniem w dniu 4. W związku z tym myszy będą niezawodnie spożywać wystarczającą ilość etanolu, aby osiągnąć BECs >100 mg / dl, w wyniku czego będą wykazywać behawioralne skutki zatrucia występujące u ludzi, którzy upijają się13,14,15. Dostęp do wody jest możliwy przez cały czas, z wyjątkiem sesji picia.
Istnieje kilka odmian picia alkoholu o ograniczonym dostępie. Na przykład w modelu przerywanego dostępu myszy otrzymują dwie butelki (jedną zawierającą wodę, a drugą zawierającą 20% etanolu) tylko w poniedziałek, środę i piątek z 24-godzinnym i 48-godzinnym okresem karencji odpowiednio w dni powszednie i weekendy16. Po kilku tygodniach przerywanego dostępu, myszy będą stopniowo i dobrowolnie zwiększać poziom picia, ostatecznie osiągając BECS podobny do tego, co obserwuje się w modelu DID. Wydaje się jednak, że DID jest najczęściej używanym modelem do oceny zachowań związanych z upijaniem się. Istnieją inne modele przerywanego picia, ale opierają się one na ograniczeniu dostępu do żywności lub wywołanym przez komorę parową wzroście dobrowolnego samodzielnego podawania, co czyni je mniej reprezentatywnymi dla dobrowolnego spożycia alkoholu przez ludzi16.

<table><tbody><tr><td>1 L&nbsp; butla z podziałką</td><td>VWR</td><td>https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co</td><td>Do przygotowania roztworu etanolu.</td></tr><tr><td>Butelka szklana 1 L</td><td>Pyrex (Fisher Scientific)</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752</td><td>Do przygotowania roztworu etanolu.</td></tr><tr><td>Butla z podziałką 100 ml</td><td>Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311</td><td></td><td>Do przygotowania roztworu etanolu.</td></tr><tr><td>Analox</td><td></td><td></td><td>Jedną z potencjalnych metod analizy próbek krwi DID jest użycie rurki</td></tr><tr><td>z łożyskiem kulkowym</td> maszyny Analox <td>firmy Ancare Corp.</td><td>http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point</td><td>Długość: 2,5 cala, Średnica: 5/16 cala, Model: TD100</td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>Jackson lab</td><td>https://www.jax.org/strain/000664</td><td>Może również pochodzić z hodowli wewnętrznej</td></tr><tr><td>jednorazowe pipety serologiczne</td><td>VWR International (VWR)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged</td><td>10 ml, 18 ml lub 25 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>etanol, czysty, 190 proof (95%), USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs (VWR)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec</td><td>---</td></tr><tr><td>opalarka&nbsp;</td><td>Master Appliances Corp.</td><td>http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/</td><td></td></tr> <tr><td>rurki termokurczliwe</td><td>---</td><td>---</td><td>Średnica: 3/8 cala</td></tr><tr><td>nóż / ostrze przemysłowe</td><td>---</td><td></td><td>------</td></tr><tr><td>metalowa płyta klatkowa</td><td></td><td>------Powinna</td> <td>być dostępna za pośrednictwem wody RO dla myszy uniwersyteckiej/instytucjonalnej</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>---</td><td>Powinna być dostępna za pośrednictwem uniwersytetu/ instytucjonalne wiwarium</td></tr><tr><td>przenośna waga elektroniczna</td><td>Ohaus (VWR)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus</td><td>---</td></tr><tr><td>czerwona latarka czołowa</td><td>nyteBright (Amazonka)</td><td></td><td>https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1--- </td></tr><tr><td>korki silikonowe</td><td>Fisher</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>termometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232</td><td>---</td></tr><tr><td>ważenie łodzi</td><td>VWR International (VWR)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes</td><td>Pokrywka z pudełka na końcówki do pipet jest odpowiednią alternatywą</td></tr></tbody></table>

mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek

Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) jest poważnym problemem, którego kryteria diagnostyczne spełnia około 76 milionów ludzi na całym świecie. Obecne terapie ograniczają się do trzech leków zatwierdzonych przez FDA, które są w dużej mierze nieskuteczne, nawet w połączeniu z interwencją psychospołeczną, o czym świadczy wysoki wskaźnik nawrotów. W związku z tym poszukiwanie bardziej nowatorskich metod leczenia stanowi ważny cel w zakresie zdrowia publicznego. W tym celu poniższy protokół wykorzystuje dwa proste modele picia gryzoni do oceny przedklinicznej skuteczności ołowiowych związków przeciwalkoholowych: wybór dwóch butelek (TBC) i picie w ciemności (DID). Pierwsza z nich pozwala myszom na dobrowolne picie z umiarem, podczas gdy druga nakłania myszy do dobrowolnego spożywania dużej ilości alkoholu w krótkim czasie, co naśladuje upijanie się. Prosty i wysokoprzepustowy charakter obu tych paradygmatów pozwala na szybkie badania przesiewowe środków farmakologicznych lub identyfikację szczepów myszy, które wykazują pewne dobrowolne zachowania związane z piciem.

W poniższych reprezentatywnych badaniach spożycie alkoholu w grupie modelowano przy użyciu paradygmatu wyboru między dwiema butelkami (TBC). W skrócie, myszy miały dostęp do dwóch butelek z roztworem, z których jedna zawierała wodę, a druga 10% (v/v) roztwór etanolu. Następnie zwierzęta podzielono i równomiernie przydzielono do grup terapeutycznych: moksydaktyny (MOX) oraz kontrolnej grupy solnej, tak aby każda grupa wykazywała średnie poziomy spożycia etanolu przy najmniejszej możliwej w...

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) jest poważnym problemem zdrowotnym w kraju i konieczne jest opracowanie bardziej skutecznych metod leczenia, aby zrównoważyć potrzeby tej populacji pacjentów. W tym celu poniższy protokół wykorzystuje dwa proste modele picia gryzoni do oceny przedklinicznej skuteczności ołowiowych związków przeciwalkoholowych.

Mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek

Alcohol Use Disorder (AUD) is a major problem with more than an estimated 76 million people worldwide meeting the diagnostic criteria. Current treatments ...

Ogólnym celem tego paradygmatu jest ocena skuteczności potencjalnego leku przeciwalkoholowego przy użyciu modeli zaburzeń związanych z używaniem alkoholu u gryzoni. Zaburzenia związane z używaniem alkoholu stanowią poważny kryzys zdrowia publicznego. Obecne metody leczenia są nieskuteczne i potrzebne są ciągłe badania przedkliniczne.Nasz protokół pozwala nam ocenić bezpieczeństwo i użyteczność potencjalnego leczenia, a także przyjrzeć się neurobiologii leżącej u podstaw samego zaburzenia. Rozpocznij procedurę od podgrzania noża uniwersalnego na palniku Bunsena. Za pomocą tego noża odetnij około cala od górnego i dolnego końca plastikowej pipety serologicznej o pojemności 18 mililitrów.Następnie ogrzej pipetę pod opalarką. Włóż rurkę wtryskową z łożyskiem kulkowym do dolnego końca pipety. Następnie za pomocą dostępnego w handlu pistoletu do folii termokurczliwej uszczelnij rurkę sipper na miejscu folią termokurczliwą.Zakryj drugi otwór silikonowym korkiem. W celu przyzwyczajenia zwierząt, po przyjeździe, każda mysz powinna być umieszczona pojedynczo w standardowej klatce z poliwęglanu z pościelą, jedzeniem i wodą oraz metalową siatką. Począwszy od czwartego dnia jednotygodniowej akl

murine-drinking-models-development-pharmacotherapies-for-alcoholism

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prezentowany tutaj jest protokół dla modelu 2BC/CIE uzależnienia od alkoholu u myszy do badania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Ten protokół opisuje standardowy paradygmat picia w domowej klatce z przerywanym dostępem do dwóch butelek do modelowania spożycia alkoholu u szczurów. Ponadto zawiera instrukcje krok po kroku, aby rozszerzyć standardowy protokół o system wykrywania lizawek DIY, który umożliwia analizę mikrostrukturalną zachowań związanych z piciem.

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Analiza zawartości tłuszczu jest rutynowo przeprowadzana w badaniach z wykorzystaniem mysich modeli otyłości. Nowoczesne metody obrazowania i analizy tomografii komputerowej (CT) małych zwierząt umożliwiają szczegółową, podłużną analizę zawartości tłuszczu. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedury krok po kroku dotyczące wykonywania obrazowania CT, analizy oraz wizualizacji u małych zwierząt.

Segmentacja i pomiar objętości tkanki tłuszczowej w mysich modelach otyłości z wykorzystaniem komputerowej tomografii rentgenowskiej

Zatarczeniowe zapalenie oskrzelików jest kluczową przeszkodą w długoterminowym przeżyciu biorców przeszczepów płuc, a brak wiarygodnego modelu przedklinicznego uniemożliwia badanie immunopatogenezy tego schorzenia. W przeciwieństwie do innych przeszczepów narządów miąższowych, transplantacja unaczynionego płuca mysiego została opracowana dopiero niedawno. W niniejszej pracy przedstawiamy opracowany przez nas model zatarczeniowego zapalenia oskrzelików po ortotopowym przeszczepieniu pojedynczego...

Rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

Audio-based Environment Simulator (AbES) to oprogramowanie do środowiska wirtualnego, zaprojektowane w celu poprawy umiejętności nawigacji w świecie rzeczywistym u osób niewidomych.

Opracowanie wirtualnego środowiska gier opartego na dźwięku, aby pomóc w rozwijaniu umiejętności nawigacji u osób niewidomych

Celem jest wytworzenie prostej i powtarzalnej przetoki tętniczo-żylnej. W tej metodzie nie stosuje się szwów ani kleju adhezyjnego. Dzięki temu próbki mogą być używane do analizy z najmniejszą ilością materiałów obcych.

Aspekty techniczne przetoki aortowo-gardłowej myszy

Ekstrakcja DNA ze śliny może stanowić łatwo dostępne źródło DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją.  Protokół ten zapewnia zoptymalizowane parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla dalszych testów DNA o wysokich wymaganiach jakościowych.

Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół do badania immunologii odrzucenia. Przedstawiony model chirurgiczny informuje o krótkim czasie operacji i zwięzłej technice. W zależności od kombinacji szczepu dawca-biorca, w przeszczepionej nerce może rozwinąć się ostre odrzucenie komórkowe lub przewlekłe uszkodzenie przeszczepu allogenicznego, zdefiniowane przez zwłóknienie śródmiąższowe i zanik kanalików słuchowych.

Przeszczep nerki u myszy: modele odrzucenia przeszczepu allogenicznego

Opisujemy krok po kroku metodę bezpośredniego pokrywania miazgi na zębach myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Poznaj metody oceny leków przeciwalkoholowych w modelach mysich zaburzeń używania alkoholu. Protokół TBC i DID pozwala badać skuteczność terapii oraz neurobiologię uzależnienia.

Mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek

Przeglądaj więcej filmów