Name: Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metody oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego in vitro i in vivo przy użyciu myszy C57BL/6. Techniki te umożliwiają badanie funkcji bariery jelitowej w chorobach zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jerroldowi R. Turnerowi z Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, za jego hojną pomoc w ukończeniu tego badania. Praca ta jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 81470804, 31401229 i 81200620), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangsu (numer grantu BK20180838 i BK20140319), Program Innowacji Badawczych dla Absolwentów Szkół Wyższych w prowincji Jiangsu (numer grantu KYLX16-0116), Zaawansowane Projekty Badawcze Uniwersytetu Soochow (numer grantu SDY2015_06), oraz Crohn's & Colitis Foundation Research Fellowship Award (grant numer 310801).

Badanie to zostało zatwierdzone przez Protokół Opieki i Korzystania ze Zwierząt Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) Uniwersytetu Soochow.
1. Wysiewanie i hodowla linii Caco-2bbe na porowatych membranach poliwęglanowych
<ol>
	<li>Hodować komórki w kolbie T75 w pożywce (DMEM zawierającej 10% FBS). Kolby należy regularnie dokarmiać, w zależności od gęstości komórek. 
	UWAGA: Dla optymalnego wysiewania komórki powinny szybko się dzielić i mieć płaski kształt „smażonego jajka”, co wskazuje, że komórki są w fazie wzrostu.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyjąć kolbę z inkubatora i usunąć pożywkę. Przepłukać resztki pożywki 1-2 mL sterylnego PBS (bez Ca2+). Pipetować 1,5 mL Trypsyny-EDTA do kolby i delikatnie nią wstrząsnąć; następnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 min bez wstrząsania.</li>
	<li>Podczas trypsynizacji komórek umieścić inserty zawierające porowate membrany poliwęglanowe (wielkość porów: 0,4 µm; powierzchnia: 0,3 cm2; patrz Tabela Materiałów) w płytkach 24-dołkowych. Dodać 1,0 mL pożywki hodowlanej do komory bazalnej (dolnej przestrzeni membrany).</li>
	<li>Pipetować 5 mL pożywki do kolby i energicznie pipetować komórki o ściankę kolby 5-10 razy, aby uzyskać luźne, pojedyncze komórki lub agregaty po 2-3 komórki.</li>
	<li>Wysiać 0,16 mL komórek (osiągając stosunek rozcieńczenia 1:8) do komory apikalnej (górnej przestrzeni membrany). Inkubować w 37 °C przez maksymalnie 3 tygodnie.
	<ol>
		<li>Dokarmiać komórki trzy razy w tygodniu, ostrożnie aspirując pożywkę z przedziału bazalnego każdego dołka za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie wkraplać 1 mL pożywki do komory apikalnej każdego insertu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Użycie miernika nabłonkowego (Volt/Ohm) do pomiaru TER
UWAGA: Po około 3 tygodniach hodowli na membranach poliwęglanowych komórki Caco-2BBe są gotowe do pomiaru TER.
<ol>
	<li>W badaniach nad cytokinami, na jeden dzień przed pomiarem, należy zastąpić pożywkę podstawową pożywką zawierającą 10 ng/mL IFNγ. W dniu eksperymentu pożywkę należy zastąpić roztworem HBSS zawierającym 2,5 lub 7,5 ng/mL TNF. 
	UWAGA: Leczenie IFNγ zwiększa ekspresję receptora TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Aby skalibrować miernik, należy włożyć elektrodę korekcyjną do portu wejściowego (Input port) i wybrać tryb „Ohm”. Następnie należy regulować śrubę R Adj za pomocą śrubokręta, aż miernik wskaże wartość 1 0 Ω.</li>
	<li>Sterylizować elektrody, umieszczając je w 70% etanolu na 15–30 min, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 15 s. Przepłukać elektrodę w pożywce hodowlanej używanej w eksperymencie.</li>
	<li>Włącz zasilanie i wybierz tryb „Ohm”. Ostrożnie umieść długie końce mostków elektrod w komorze podstawnej, a krótkie końce w komorze apikalnej. Upewnij się, że dłuższe elektrody dotykają dna naczynia, natomiast krótsze elektrody znajdują się poniżej powierzchni medium, ale powyżej wkładów do hodowli tkankowej. Utrzymuj elektrody w pozycji pionowej.</li>
	<li>Zmierz oporność wkładów z próbką oraz wkładów ślepych (tj. wkładki hodowlane bez komórek, ale z HBSS) w 0, 1, 2, 3 i 4 h po traktowaniu cytokinami. Zapisz wartość rezystancji.</li>
	<li>Aby zapewnić spójność wyników dla różnych formatów płytek, należy obliczyć iloczyn rezystancji i efektywnej powierzchni membrany: 
	<img alt="Wzór na opór jednostkowy powierzchni: Ω·cm² = Opór (Ω) × Efektywna powierzchnia membrany (cm²)." src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	W przypadku wkładów 24-dołkowych efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33 cm²2.</li>
</ol>
3. Mysi model zapalenia jelita grubego indukowanego dekstranem siarczanem sodu (DSS)
<ol>
	<li>Dodać DSS do wody autoklawowanej do uzyskania końcowego stężenia 3,5% (mas/obj).</li>
	<li>Podawać 3,5% DSS 8-tygodniowym samcom myszy C57BL/6 przez łącznie 7 dni. Myszom kontrolnym podawać zwykłą wodę pitną bez DSS.
	<ol>
		<li>Po 7. dniu zastąpić wodę zawierającą DSS zwykłą wodą pitną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie ważyć myszy i oceniać stan kliniczny każdego zwierzęcia. Znormalizować masę ciała każdej myszy do jej początkowej masy ciała. Wyniki punktowe definiuje się zgodnie z ciężkością choroby na podstawie czterech parametrów: wypadania odbytu (0-2), konsystencji stolca (0-2), krwawienia (0-2) oraz aktywności (0-2)5. Zsumować wyniki z tych parametrów, aby uzyskać końcowy wynik kliniczny.</li>
	<li>W celu analizy stanu histopatologicznego tkanki okrężnicy, 7 dni po zakończeniu leczenia DSS uśmiercić myszy poprzez wtryśnięcie do jamy otrzewnowej (i.p.) 1,2% (obj/obj) Avertinu (0,6 mL/10 g masy ciała). Aby przygotować roztwór stokowy 10% avertinu, zmieszać 10 g 2,2,2-tribromoetanolu z 10 ml tert-amylu alkoholu. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C. Przed użyciem rozcieńczyć 10% roztwór stokowy do stężenia 2% w wodzie.</li>
	<li>Wyizolować okrężnicę oraz kątnicę, a następnie zmierzyć długość okrężnicy5.</li>
	<li>Wyciąć odcinki o długości 0,5 cm z dystalnej części okrężnicy i utrwalić w probówce Falcon o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL 10% formaliny przez noc. Przemyć utrwalone tkanki szeregiem stężeń etanolu (75, 95 i 10%) oraz ksylenem. Zalać tkanki parafiną i wyciąć przekroje o grubości 6 mm do barwienia hematoksyliną i eozyną8.</li>
</ol>
4. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej u myszy z colitis indukowanym DSS
<ol>
	<li>Zmierz przepuszczalność bariery 7 dni po rozpoczęciu podawania DSS.</li>
	<li>W dniu analizy poddaj myszy 3-godzinnej głodówce.</li>
	<li>Autoklawuj igłę do zgłębnikowania w celu zapewnienia sterylności, następnie podaj myszom drogą zgłębnikową 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dekstranu w sterylnej wodzie; zachowaj niewykorzystany FITC-dekstran do wyznaczenia krzywej wzorcowej po pobraniu surowicy. Zważ myszy w celu obliczenia przepuszczalności. 
	UWAGA: Roztwór FITC-dekstranu należy przygotować w wodzie.</li>
	<li>Używając nożyczek, odetnij fragment ogona o długości 1 cm i pobierz 10 µL krwi z ogona do probówek do pobierania surowicy. Odwiruj pobraną krew przy 10,0 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńcz surowicę w wodzie w stosunku 1:4. Aby przygotować krzywą wzorcową, rozcieńcz niewykorzystany FITC-dekstran wodą w stosunkach 1:30, 1:1,00, 1:3,00, 1:10,0, 1:30,00, 1:100,00, 1:30,0, 1:1,0,00 oraz 1:3,00,0. Nanieś 10 µL na studzienkę surowicy oraz próbek z krzywej wzorcowej do płytek 96-dołkowych.</li>
	<li>Odczytaj fluorescencję w czytniku płytek przy wzbudzeniu 485 / emisji 528. Oblicz wartości przepuszczalności na podstawie krzywej wzorcowej i pomnóż je przez 4, aby skorygować rozcieńczenie.</li>
	<li>Podziel stężenie FITC-dekstranu przez masę ciała w celu normalizacji wartości (pomaga to zniwelować różnice w podaniu FITC-dekstranu w przypadku, gdy myszy są chore i utraciły na wadze).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Komórki Caco-2BBe (wyrażające granicę szczoteczki) są zawsze używane do pomiaru TER, wybrane z linii komórkowej Caco-2 do ekspresji białek na granicy szczoteczki. Komórki Caco-2BBe mają fenotyp absorpcyjny kosmków, gdy są w pełni zróżnicowane (po około 3 tygodniach hodowli po konfluencji)17. Konieczne jest unikanie zanieczyszczenia podczas pomiaru i sterylizacja elektrody. Ponieważ procedura jest niesterylna, w większości przypadków pomiary można ...

Komórki nabłonka jelitowego są nie tylko odpowiedzialne za wchłanianie składników odżywczych, ale także stanowią ważną barierę do obrony przed patogennymi mikroorganizmami i toksynami mikrobiologicznymi. Ta funkcja bariery jelitowej jest regulowana przez przepuszczalność połączeń ścisłych i integralność komórek nabłonka1,2,3, a dysfunkcja funkcji bariery nabłonkowej jest związana z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD). Okołozłączowy pierścień aktomiozyny (PAMR) leży w komórce, która ściśle przylega do połączeń ścisłych. Skurcz PAMR, który jest regulowany przez lekki łańcuch miozyny (MLC), ma kluczowe znaczenie dla regulacji przepuszczalności połączeń ścisłych4,5,6,7,8,9,10. Czynnik martwicy nowotworu (TNF) ma kluczowe znaczenie dla utraty bariery jelitowej poprzez zwiększenie ekspresji nabłonkowej kinazy MLC (MLCK) jelita i indukowanie internalizacji okludyny11,12,13.
Jony takie jak Na+ i Cl- mogą przenikać przez przestrzeń parakomórkową zarówno przez pory jak i drogę przecieku14. W "nieszczelnym" nabłonku zmiany w TER odzwierciedlają przede wszystkim zmienioną przepuszczalność połączeń ścisłych. Pomiar TER jest powszechnie stosowanym podejściem elektrofizjologicznym do ilościowego określania przepuszczalności złączy ścisłych, głównie do Na+ i Cl-, w oparciu o impedancję monowarstw ogniw. Do pomiarów TER zgłoszono różne typy komórek, w tym komórki nabłonka jelitowego, komórki nabłonka płuc i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych. Zaletą tej metody jest to, że pomiary TER są nieinwazyjne i mogą być wykorzystywane do monitorowania żywych komórek w czasie rzeczywistym. Ponadto technika pomiaru TER jest przydatna w badaniach toksyczności leków15.
Komórki Caco-2BBe to ludzkie komórki gruczolakoraka jelita grubego nabłonkowego o strukturze i funkcji podobnej do zróżnicowanych komórek nabłonka jelita cienkiego: na przykład, te komórki mają mikrokosmki i enzymy związane z granicą szczoteczki jelita cienkiego. Dlatego hodowane monowarstwy Caco-2BBe są wykorzystywane jako model in vitro do testowania funkcji bariery.
U myszy, jednym ze sposobów badania przepuszczalności parakomórkowej jelit jest pomiar zdolności FITC-dekstranu do przenikania ze światła do krwi. W ten sposób przepuszczalność jelit można ocenić, podając FITC-dekstran bezpośrednio myszom i mierząc fluorescencję we krwi. Poniższy protokół opisuje dwie proste metody oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego zarówno in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Igła do zgłębnika 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dekstran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Czarne 96-dołkowe płytki do fluorescencji</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6</td><td>Nanjing Instytut Badań Biomedycznych Uniwersytetu</td><td></td><td></td>w Nankinie</tr><tr><td>Komórki Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED z wysoką jakością glukozy i pirogronianem sodu</td><td>Hyklon</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Miernik nabłonka (wolt/om)</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm ChemicalOdczynnik</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>probówka Falcon (15 ml)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM glukozy&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Modułowe centrum zatapiania tkanek</td><td>Probówki do pobierania serum Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membrany poliwęglanowe (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Pompa ciśnieniowa</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomia rotacyjna</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sinopharm ChemicalOdczynnik</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Bariera jelitowa chroni przed chorobotwórczymi mikroorganizmami i toksynami mikrobiologicznymi. Jego funkcja jest regulowana przez przepuszczalność połączeń ścisłych i integralność komórek nabłonka, a zaburzenie funkcji bariery jelitowej przyczynia się do postępu choroby przewodu pokarmowego i ogólnoustrojowej. Opisano tutaj dwie proste metody pomiaru przepuszczalności nabłonka jelitowego. In vitro komórki Caco-2BBe są siane w studzienkach do hodowli tkankowych jako monowarstwa, a transepiteliczny opór elektryczny (TER) można mierzyć za pomocą nabłonkomierza (woltomierz/om). Metoda ta przekonuje przyjazną dla użytkownika obsługą i powtarzalnością. In vivo myszy są poddawane zgłębnikowaniu distranem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dektranu, a stężenia FITC-dekstranu mierzy się w próbkach surowicy pobranych od myszy w celu określenia przepuszczalności nabłonka. Zgłębnik doustny zapewnia dokładną dawkę i dlatego jest preferowaną metodą pomiaru przepuszczalności jelit in vivo. Podsumowując, te dwie metody mogą mierzyć przepuszczalność nabłonka jelitowego in vitro i in vivo, a tym samym być wykorzystywane do badania związku między chorobami a funkcją bariery.

W hodowli komórki Caco-2BBe rosną jako monowarstwa i powoli różnicują się w dojrzałe enterocyty chłonne posiadające rąbek szczoteczkowy. W niniejszym protokole komórki Caco-2BBe wysiano z wysoką gęstością na membranach poliwęglanowych, a komórki osiągnęły 10% konfluencji jeden dzień po wysianiu. Jednak na tym etapie komórki są nieróżnicowane: aby w pełni zróżnicować komórki, medium jest wymieniane co 2-3 dni przez okres 3 tygodni. Komórki wybarwiono barwnikami do jąder komórkowych oraz F-...

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie chorób spowodowanych dysfunkcją bariery nabłonkowej poprzez pomiar przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego in vitro i in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie funkcji bariery jelitowej, takie jak te związane z nieswoistym zapaleniem jelit. Główną zaletą tej techniki jest to, że przepuszczalność komórek nabłonka jelitowego można ocenić zarówno in vitro, jak i in vivo.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę chorób przewodu pokarmowego, ponieważ dysfunkcja bariery nabłonkowej jelit przyczynia się do tych chorób. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję bariery jelitowej, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badania toksyczności leków i integralność bariery innych typów komórek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia.Dokładne działanie tej metody można teraz zrozumieć za pomocą opisu tekstowego. Na początek hoduj komórki Caco-2bbe w kolbie T75 z pożywką. Kolby należy podawać regularnie, w zależności od gęstości komórek.Gdy komórki są w 80% zlewne, usuń pożywkę i użyj 1-2 mililitrów sterylnego PBS bez wapnia do ich przepłukania. Dodaj 1,5 mililitra Trypsyny-EDTA i delikatnie kołysz kolbą. Następnie umieść go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut, bez kołysania.Podczas trypsynizacji komórek umieść wkładki zawierające porowate membrany poliwęglanowe w 24-dołkowych płytkach. Następnie dodaj 1 mililitr pożywki hodowlanej do komory podstawowej, która jest dolną przestrzenią błony. Dodać 5 mililitrów pożywki do kolby i energicznie pipetować komórki do wnętrza kolby 5 do 10 razy, aby rozdzielić kulturę na luźne pojedyncze komórki lub dwie do trzech grudek komórek.Płytka 0,166 mililitra komórek do komory wierzchołkowej, która jest górną przestrzenią błony. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni. Nakarm komórki trzy razy w tygodniu, używając pompy ciśnieniowej, aby ostrożnie zassać pożywkę z podstawowego przedziału każdej studzienki.Następnie delikatnie wlej jeden mililitr pożywki do komory wierzchołkowej każdej wkładki. W przypadku badań cytokin, na dzień przed pomiarami przeznabłonkowego oporu elektrycznego lub TER, zastąp podłoże podstawowe pożywką zawierającą 10 nanogramów na mililitr interferonu gamma. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę HBSS zawierającą 2,5 lub 7,5 nanograma na mililitr TNF.Aby skorygować miernik, włóż elektrodę korekcyjną do portu wejściowego i wybierz tryb Ohm. Następnie za pomocą śrubokręta wyreguluj regulacyjną R, aż miernik wyświetli odczyt 1,000 omów. Sterylizuj elektrody w 70% etanolu przez 15 do 30 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 15 sekund.Następnie przepłucz elektrody w eksperymentalnym pożywce do hodowli komórek. Następnie włącz zasilanie i wybierz tryb Ohm. Trzymając elektrody w pionie, ostrożnie umieść długie końce mostków elektrod w komorze podstawowej, upewniając się, że dotykają naczynia.Następnie umieść krótkie końce w komorze wierzchołkowej, upewniając się, że pozostają poniżej powierzchni pożywki, ale powyżej wkładek do hodowli tkankowych. Zmierzyć oporność próbki i ślepej próby po 0, 1, 2, 3 i 4 godzinach po poddaniu działaniu cytokin. Następnie zapisz opór.Aby uzyskać spójność w różnych formatach płyt, należy obliczyć iloczyn rezystancji i efektywnej powierzchni membrany, jak pokazano tutaj. W przypadku wkładów 24-dołkowych efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33 centymetra kwadratowego. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, dodaj DSS do autoklawowanej wody do końcowego stężenia 3,5% wagowo na objętość.Następnie użyj roztworu DSS, aby zastąpić wodę pitną w klatkach 8-tygodniowego samca sześciu czarnych myszy C57 na łącznie siedem dni. Podawaj zwykłą wodę pitną bez DSS do kontrolowania myszy. Po siódmym dniu zmień wodę DSS na zwykłą wodę pitną.Każdego dnia waż myszy i oceniaj wyniki kliniczne określone zgodnie z ciężkością choroby za pomocą czterech parametrów: wypadania odbytnicy, konsystencji stolca, krwawienia i aktywności. Zsumuj wyniki z tych parametrów, aby uzyskać ostateczny wynik kliniczny. Aby przeanalizować stan histopatologiczny tkanek okrężnicy siedem dni po leczeniu DSS, po eutanazji myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyizolować okrężnicę i jelito ślepe oraz zmierzyć długość okrężnicy.Wytnij 0,5 centymetra segmenty z dystalnej okrężnicy i umocuj tkankę w 15-mililitrowej tubie sokoła zawierającej 10 mililitrów 10% formaliny przez noc. Umyj utrwalone chusteczki stopniowanym etanolem i ksylenem. Następnie zanurz tkanki w parafinie i wytnij sześciomilimetrowe odcinki w celu barwienia hematoksyliną i eozyną.Aby zmierzyć przepuszczalność bariery nabłonkowej u myszy z indukcją DSS, siedem dni po rozpoczęciu podawania DSS należy pościć myszy przez trzy godziny. Autoklawuj igłę do zgłębnika, aby zapewnić sterylność, a następnie użyj 150 mikrolitrów 80 miligramów na mililitr czterokilodaltonowego dekstranu FITC w sterylnej wodzie, aby pobrać myszy i zachowaj niewykorzystany dekstran FITC do zmierzenia standardowej krzywej po pobraniu surowicy. Następnie zważ myszy w celu obliczenia przepuszczalności.Cztery godziny później, po znieczuleniu myszy przez wstrzyknięcie IP, potwierdź prawidłowe znieczulenie brakiem odruchów i ruchów wąsów. Następnie umieść myszy na bloku grzewczym na pięć minut. Za pomocą nożyczek przytnij centymetrowy kawałek ogona i zbierz 100 mikrolitrów krwi z ogona do probówki do pobierania surowicy.Wiruj pobraną krew z prędkością 10 000 g i temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Wodą rozcieńczyć surowicę od jednego do czterech. Następnie, aby wykonać krzywą wzorcową, użyj wody do przygotowania rozcieńczeń niewykorzystanego dekstranu FITC.Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę surowicy i próbki krzywej wzorcowej do 96-dołkowych płytek. Za pomocą czytnika płytek odczytaj fluorescencję przy wzbudzeniu 485 i emisji 528. Oblicz wartości przepuszczalności na podstawie krzywej standardowej i pomnóż przez cztery, aby skorygować rozcieńczenie.Podzielić stężenie dekstranu FITC przez wagę, aby znormalizować wartości. Pomaga to znormalizować różnicę w dostarczaniu dekstranu FITC, jeśli myszy są chore i straciły na wadze. Pokazane tutaj komórki Caco-2bbe zostały oznaczone jądrami i barwnikami F-aktyny, aby pokazać różnicę między komórkami niezróżnicowanymi i zróżnicowanymi.Włókna stresowe są wyraźnie widoczne w niezróżnicowanych komórkach. Zróżnicowane komórki mają mniejszą objętość, większe jądra i mniej włókien stresowych niż komórki niezróżnicowane. TNF ma kluczowe znaczenie dla utraty bariery jelitowej poprzez zależną od MLCK regulację połączeń ścisłych.Jak widać na tym rysunku, TNF znacznie zmniejsza TER monowarstwy Caco-2bbe w sposób zależny od dawki, co sugeruje, że TNF zwiększa przepuszczalność nabłonka. W porównaniu z początkową masą ciała myszy leczone DSS tracą znaczną ilość wagi. Nasilenie zapalenia jelita grubego ocenia się na podstawie wypadania odbytnicy, konsystencji stolca, krwawienia i aktywności.Przekroje poprzeczne tkanek okrężnicy barwionych hematoksyliną i eozyną wykazują uszkodzenie błony śluzowej okrężnicy u myszy leczonych DSS. Ponadto długość krypty okrężnicy, a także sama okrężnica, jest zmniejszona u myszy leczonych DSS. Wreszcie, u myszy leczonych DSS obserwuje się około dwukrotny wzrost poziomu barwienia dekstranem FITC w porównaniu z myszami kontrolnymi.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu błędów poprzez standaryzację procedur operacyjnych i wykorzystanie metod statystycznych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się funkcją bariery jelitowej do badania chorób przewodu pokarmowego zarówno w organizmach modelowych, jak i liniach komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić przepuszczalność nabłonka jelitowego, mierząc TER, dekstran FITC oraz obserwując zmiany morfologiczne i histochemiczne.

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.

Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

Poznaj metody oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego in vitro i in vivo przy użyciu myszy C57BL/6. Techniki te umożliwiają badanie funkcji bariery jelitowej w chorobach zapalnych.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Przeglądaj więcej filmów