Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie chorób spowodowanych dysfunkcją bariery nabłonkowej poprzez pomiar przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego in vitro i in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie funkcji bariery jelitowej, takie jak te związane z nieswoistym zapaleniem jelit. Główną zaletą tej techniki jest to, że przepuszczalność komórek nabłonka jelitowego można ocenić zarówno in vitro, jak i in vivo.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę chorób przewodu pokarmowego, ponieważ dysfunkcja bariery nabłonkowej jelit przyczynia się do tych chorób. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję bariery jelitowej, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badania toksyczności leków i integralność bariery innych typów komórek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia.

Dokładne działanie tej metody można teraz zrozumieć za pomocą opisu tekstowego. Na początek hoduj komórki Caco-2bbe w kolbie T75 z pożywką. Kolby należy podawać regularnie, w zależności od gęstości komórek.

Gdy komórki są w 80% zlewne, usuń pożywkę i użyj 1-2 mililitrów sterylnego PBS bez wapnia do ich przepłukania. Dodaj 1,5 mililitra Trypsyny-EDTA i delikatnie kołysz kolbą. Następnie umieść go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut, bez kołysania.

Podczas trypsynizacji komórek umieść wkładki zawierające porowate membrany poliwęglanowe w 24-dołkowych płytkach. Następnie dodaj 1 mililitr pożywki hodowlanej do komory podstawowej, która jest dolną przestrzenią błony. Dodać 5 mililitrów pożywki do kolby i energicznie pipetować komórki do wnętrza kolby 5 do 10 razy, aby rozdzielić kulturę na luźne pojedyncze komórki lub dwie do trzech grudek komórek.

Płytka 0,166 mililitra komórek do komory wierzchołkowej, która jest górną przestrzenią błony. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni. Nakarm komórki trzy razy w tygodniu, używając pompy ciśnieniowej, aby ostrożnie zassać pożywkę z podstawowego przedziału każdej studzienki.

Następnie delikatnie wlej jeden mililitr pożywki do komory wierzchołkowej każdej wkładki. W przypadku badań cytokin, na dzień przed pomiarami przeznabłonkowego oporu elektrycznego lub TER, zastąp podłoże podstawowe pożywką zawierającą 10 nanogramów na mililitr interferonu gamma. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę HBSS zawierającą 2,5 lub 7,5 nanograma na mililitr TNF.

Aby skorygować miernik, włóż elektrodę korekcyjną do portu wejściowego i wybierz tryb Ohm. Następnie za pomocą śrubokręta wyreguluj regulacyjną R, aż miernik wyświetli odczyt 1,000 omów. Sterylizuj elektrody w 70% etanolu przez 15 do 30 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 15 sekund.

Następnie przepłucz elektrody w eksperymentalnym pożywce do hodowli komórek. Następnie włącz zasilanie i wybierz tryb Ohm. Trzymając elektrody w pionie, ostrożnie umieść długie końce mostków elektrod w komorze podstawowej, upewniając się, że dotykają naczynia.

Następnie umieść krótkie końce w komorze wierzchołkowej, upewniając się, że pozostają poniżej powierzchni pożywki, ale powyżej wkładek do hodowli tkankowych. Zmierzyć oporność próbki i ślepej próby po 0, 1, 2, 3 i 4 godzinach po poddaniu działaniu cytokin. Następnie zapisz opór.

Aby uzyskać spójność w różnych formatach płyt, należy obliczyć iloczyn rezystancji i efektywnej powierzchni membrany, jak pokazano tutaj. W przypadku wkładów 24-dołkowych efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33 centymetra kwadratowego. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, dodaj DSS do autoklawowanej wody do końcowego stężenia 3,5% wagowo na objętość.

Następnie użyj roztworu DSS, aby zastąpić wodę pitną w klatkach 8-tygodniowego samca sześciu czarnych myszy C57 na łącznie siedem dni. Podawaj zwykłą wodę pitną bez DSS do kontrolowania myszy. Po siódmym dniu zmień wodę DSS na zwykłą wodę pitną.

Każdego dnia waż myszy i oceniaj wyniki kliniczne określone zgodnie z ciężkością choroby za pomocą czterech parametrów: wypadania odbytnicy, konsystencji stolca, krwawienia i aktywności. Zsumuj wyniki z tych parametrów, aby uzyskać ostateczny wynik kliniczny. Aby przeanalizować stan histopatologiczny tkanek okrężnicy siedem dni po leczeniu DSS, po eutanazji myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyizolować okrężnicę i jelito ślepe oraz zmierzyć długość okrężnicy.

Wytnij 0,5 centymetra segmenty z dystalnej okrężnicy i umocuj tkankę w 15-mililitrowej tubie sokoła zawierającej 10 mililitrów 10% formaliny przez noc. Umyj utrwalone chusteczki stopniowanym etanolem i ksylenem. Następnie zanurz tkanki w parafinie i wytnij sześciomilimetrowe odcinki w celu barwienia hematoksyliną i eozyną.

Aby zmierzyć przepuszczalność bariery nabłonkowej u myszy z indukcją DSS, siedem dni po rozpoczęciu podawania DSS należy pościć myszy przez trzy godziny. Autoklawuj igłę do zgłębnika, aby zapewnić sterylność, a następnie użyj 150 mikrolitrów 80 miligramów na mililitr czterokilodaltonowego dekstranu FITC w sterylnej wodzie, aby pobrać myszy i zachowaj niewykorzystany dekstran FITC do zmierzenia standardowej krzywej po pobraniu surowicy. Następnie zważ myszy w celu obliczenia przepuszczalności.

Cztery godziny później, po znieczuleniu myszy przez wstrzyknięcie IP, potwierdź prawidłowe znieczulenie brakiem odruchów i ruchów wąsów. Następnie umieść myszy na bloku grzewczym na pięć minut. Za pomocą nożyczek przytnij centymetrowy kawałek ogona i zbierz 100 mikrolitrów krwi z ogona do probówki do pobierania surowicy.

Wiruj pobraną krew z prędkością 10 000 g i temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Wodą rozcieńczyć surowicę od jednego do czterech. Następnie, aby wykonać krzywą wzorcową, użyj wody do przygotowania rozcieńczeń niewykorzystanego dekstranu FITC.

Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę surowicy i próbki krzywej wzorcowej do 96-dołkowych płytek. Za pomocą czytnika płytek odczytaj fluorescencję przy wzbudzeniu 485 i emisji 528. Oblicz wartości przepuszczalności na podstawie krzywej standardowej i pomnóż przez cztery, aby skorygować rozcieńczenie.

Podzielić stężenie dekstranu FITC przez wagę, aby znormalizować wartości. Pomaga to znormalizować różnicę w dostarczaniu dekstranu FITC, jeśli myszy są chore i straciły na wadze. Pokazane tutaj komórki Caco-2bbe zostały oznaczone jądrami i barwnikami F-aktyny, aby pokazać różnicę między komórkami niezróżnicowanymi i zróżnicowanymi.

Włókna stresowe są wyraźnie widoczne w niezróżnicowanych komórkach. Zróżnicowane komórki mają mniejszą objętość, większe jądra i mniej włókien stresowych niż komórki niezróżnicowane. TNF ma kluczowe znaczenie dla utraty bariery jelitowej poprzez zależną od MLCK regulację połączeń ścisłych

Jak widać na tym rysunku, TNF znacznie zmniejsza TER monowarstwy Caco-2bbe w sposób zależny od dawki, co sugeruje, że TNF zwiększa przepuszczalność nabłonka. W porównaniu z początkową masą ciała myszy leczone DSS tracą znaczną ilość wagi. Nasilenie zapalenia jelita grubego ocenia się na podstawie wypadania odbytnicy, konsystencji stolca, krwawienia i aktywności.

Przekroje poprzeczne tkanek okrężnicy barwionych hematoksyliną i eozyną wykazują uszkodzenie błony śluzowej okrężnicy u myszy leczonych DSS. Ponadto długość krypty okrężnicy, a także sama okrężnica, jest zmniejszona u myszy leczonych DSS. Wreszcie, u myszy leczonych DSS obserwuje się około dwukrotny wzrost poziomu barwienia dekstranem FITC w porównaniu z myszami kontrolnymi.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu błędów poprzez standaryzację procedur operacyjnych i wykorzystanie metod statystycznych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się funkcją bariery jelitowej do badania chorób przewodu pokarmowego zarówno w organizmach modelowych, jak i liniach komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić przepuszczalność nabłonka jelitowego, mierząc TER, dekstran FITC oraz obserwując zmiany morfologiczne i histochemiczne.