Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Ogólnym celem tego eksperymentu jest modyfikacja genetyczna mysich komórek mieloidalnych 32D-G-CSF-R poprzez nadekspresję lub wyciszenie badanego genu oraz określenie wpływu tych zmian na proliferację i różnicowanie neutrofilne tej linii komórkowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hematologii, takie jak rola badanego białka w procesach wzrostu i różnicowania mieloidalnych komórek prekursorowych. Główną zaletą tej linii komórkowej jest nieograniczona zdolność do proliferacji, podatność na manipulacje genetyczne, stosunkowo niski koszt oraz możliwość biologicznego uproszczenia niezbędnego w niektórych podejściach eksperymentalnych. Procedurę zaprezentuje dziś Petr Danek, doktorant w moim laboratorium.

Przygotować 250 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy bydlęcej oraz 10 ng/ml mysiej interleukiny-3. Następnie przygotować 50 ml pożywki różnicującej.

W 16-centymetrowej szalce Petriego wysiej zawiesinę pojedynczych komórek Bosc23 w 18 mililitrach pożywki DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubuj przez około 24 godziny, aż stopień zrastania komórek osiągnie 80%. Następnie połącz konstrukt retrowirusowy MSCV, wektor pakujący PCL-echo, polietylenoiminę oraz pożywkę z obniżoną zawartością surowicy bez antybiotyków. Inkubuj tę mieszaninę w komorze Flowbox w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie ostrożnie zastąp pożywkę hodowli komórek Bosc23 16 mililitrami podgrzanej do 37 stopni Celsjusza pożywki DMEM uzupełnionej o 2% płodowej surowicy bydlęcej. Następnie dodawaj mieszaninę retrowirusową kroplami do komórek Bosc23. Po tym inkubuj hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Po zakończeniu inkubacji odessać pożywkę hodowlaną Bosc23 i dodać 18 mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów przenieść pożywkę zawierającą wirus Bosc23 do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Przechowywać probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodać 18 mililitrów uprzednio ogrzanej pożywki DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej do komórek Bosc23 i hodować komórki przez 24 godziny.

Odwiruj nadsącz wirusowy z prędkością 1 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie podziel wirusa na aalikwoty i zamroź go gwałtownie w ciekłym azocie, aby przechowywać go w temperaturze -80 °C.

W każdej studience płytki sześciodołkowej wysiej komórki NIH/3T3 w trzech mililitrach podłoża DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby miareczkować jeden wirus. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia rozcieńcz wirusa w uprzednio ogrzanym podłożu, unikając wstrząsania wirionów w wortexie. Odessaj podłoże hodowlane z komórek NIH/3T3 i dodaj jeden mililitr rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia ostrożnie odessaj rozcieńczone podłoże wirusowe i zastąp je dwoma mililitrami podłoża DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą, a następnie ponownie inkubuj przez noc w temperaturze 37°C. Po inkubacji odessaj zużyte podłoże i zastąp je podłożem DMEM zawierającym 2 µg/mL puromycyny. Kontynuuj hodowlę komórek, wymieniając podłoże co trzy dni lub w przypadku zmiany barwy podłoża na żółtą, uzupełniając je świeżym podłożem z puromycyną.

Między 10. a 12. dniem po infekcji odessać pożywkę z dołków i delikatnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie zabarwić jednym mililitrem roztworu fioletu krystalicznego w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po barwieniu ostrożnie dwukrotnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Pod mikroskopem policzyć całkowitą liczbę niebieskich kolonii obecnych w każdym dołku.

Wysiej komórki 32D-G-CSF-R na płytkę sześciodołkową. Dodaj wirusa z wielokrotnością infekcji (MOI) od 10 do 40. Następnie dodaj do komórek polybrene do stężenia końcowego 8 µg/mL i inkubuj w temperaturze 37 °C przez sześć godzin. Po inkubacji przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 450 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Komórki 32D mogą częściowo utracić zdolność do różnicowania, jeśli zostaną wyhodowane do stężeń przekraczających 1 milion komórek/ml, dlatego bardzo ważne jest terminowe pasażowanie tych komórek i unikanie przerośnięcia kultur.

Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w kolbie hodowlanej T25 zawierającej 6 ml medium RPMI-1640 uzupełnionego o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej oraz 10 ng/ml mysiej interleukiny-3. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.

Przemyj komórki 32D-G-CSF-R dwukrotnie pożywką RPMI-1640 bez cytokin. Następnie w dniu zerowym wysiej komórki w jednym mililitrze pożywki różnicującej na płytce 24-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Różnicowanie komórek w dojrzałe granulocyty potrwa od siedmiu do dziewięciu dni. Następnie policz liczbę komórek, stosując błękit trypanu w celu wykluczenia martwych komórek.

Ponieważ IL-3 może hamować proces różnicowania, absolutnie kluczowe jest usunięcie wszelkich śladów tej cytokiny przed hodowlą komórek w GCSF.

Wykonaj cytocentryfugację komórek na szkiełku przedmiotowym w wirówce z odpowiednimi adapterami przy 20 ×g przez pięć minut. Następnie utrwal komórki w metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej i pozostaw je do wyschnięcia. Pobarw komórki metodą May-Grünwalda Giemsy zgodnie z protokołem producenta. Po zabarwieniu zwizualizuj komórki, które przyjęły barwnik, stosując powiększenie 40X.

Na podstawie morfologii komórkowej należy określić liczbę blastów, komórek o pośrednim stopniu zróżnicowania oraz dojrzałych granulocytów wśród zabarwionych komórek.

Przedstawiono tutaj reprezentację graficzną obrazującą proliferację komórek 32D-G-CSF-R w pośrodkach zawierających interleukinę-3 oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytów. Oś X przedstawia dni traktowania, a oś Y liczbę komórek w skali logarytmicznej. Wykres czarny pokazuje proliferację w przypadku hodowli komórek w pośrodku zawierającym interleukinę-3. Wykres niebieski pokazuje obniżoną proliferację komórek w przypadku hodowli w pośrodku zawierającym czynnik stymulujący kolonie granulocytów.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wykresy kołowe oraz barwienie metodą May-Grünwalda-Giemsy obrazują proporcje i morfologię różnicowania komórek 32D-G-CSF-R w pożywce zawierającej czynnik stymulujący wzrost granulocytów. Wykresy kołowe pokazują proporcje blastów, komórek w stadium pośredniego różnicowania oraz neutrofili podczas leczenia czynnikiem stymulującym wzrost granulocytów w dniu zerowym, drugim, czwartym i szóstym. Komórki barwione metodą Giemsy w dniu zerowym posiadają duże charakterystyczne jądra i ciemną cytoplazmę. W szóstym dniu rozmiar jądra jest zmniejszony, a cytoplazma powiększona, lecz nie ciemna.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wykresy kołowe pokazują wyższą proporcję blastów po transdukcji białkami fuzyjnymi BCR-ABL w porównaniu z kontrolnym wektorem MSCV w pożywce zawierającej czynnik stymulujący wzrost granulocytów.

W szóstym dniu komórki transdukowane wektorem kontrolnym MSCV uległy różnicowaniu w kierunku neutrofilnym, natomiast komórki transdukowane BCR-ABL wykazywały głównie obecność blastów i brak dojrzałych neutrofili.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby hodować komórki linii 32D-G-CSF receptor przy wskazanych stężeniach. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak testy migracji i eksperymenty przeżywalności, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu postępowania z linią komórkową 32D-G-CSF receptor, obejmującą manipulacje genetyczne poprzez transdukcję lentiwirusową i retrowirusową, namnażanie, różnicowanie oraz ocenę proliferacji i różnicowania tych komórek. Należy pamiętać, że praca z wirusami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.