Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe scharakteryzowanie angiogennych i nieangiogennych fenotypów ludzkich komórek kostniakomięsaka w sposób systematyczny, łącząc analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące powstawania i progresji nowotworów u ludzi. W szczególności ucieczka ze stanu spoczynku guza i przełącznik endogenny.

Główną zaletą tej techniki jest to, że parametry wielokomórkowe mogą być analizowane jednocześnie za pomocą tej zintegrowanej metody o wysokim rozrozprzestrzenianiu. Obejmuje to obszar komórki, grubość komórki, objętość komórki, szybkość proliferacji, czas podwajania, prędkość ruchliwości, migrację i ruchliwość. Na początek podgrzej pożywkę hodowlaną do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Następnie wyjmij kriogeniczne fiolki z angiogennymi i nieangiogennymi ludzkimi komórkami kostniakomięsaka ze zbiornika ciekłego azotu. Zanurz dno fiolek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie potrząśnij fiolkami kriogenicznymi, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, spryskaj fiolkę 70% etanolem i wytrzyj fiolkę, aby ją wysterylizować.

Następnie natychmiast odessać zawiesinę komórkową z fiolki i delikatnie zawiesić je w 10 mililitrach podgrzanej pożywki hodowlanej. Następnie odwiruj zawiesiny komórek przez pięć minut, aby granulować komórki. Z powrotem do kaptura usuń supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami podgrzanej pożywki hodowlanej.

Następnie przenieść zawiesinę komórek do kolby T75. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek kilka razy, aby równomiernie rozproszyć komórki. Umieścić kolbę w inkubatorze i pozostawić komórki do przyczepienia się przez co najmniej 12 godzin.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Gdy komórki osiągną 80 do 100 procent konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną z kolby i umyj komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% roztworu trypsonu EDTA do kolby i krótko zamieszać kolbę.

Inkubować kolbę przez dwie do trzech minut, a następnie sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zaokrąglone i odłączone. Po odłączeniu komórek użyj pipety, aby dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej i delikatnie odpipetuj pożywkę kilka razy w górę iw dół, aby rozbić wszelkie pozostałe agregaty komórek. Po policzeniu komórek wysiewaj dwa miliony z nich do nowej kolby T75.

Umieść kolbę w inkubatorze i hoduj komórki do zbieżności od 80 do 100 procent przed wysiewem komórek do eksperymentu obrazowania w fazie ilościowej. Zbieraj komórki przez trawienie tripsonów i nasiona angiogennych i nieangiogennych ludzkich kostniakomięsaków w sześciu dołkach o gęstości od 50 000 do 300 000 komórek na dołek. Przykryj komórki łącznie pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej.

Następnie inkubuj płytki przez co najmniej 12 godzin, aby dać czas na przyczepienie się komórek. Zastąp pożywkę nowym nośnikiem przed obrazowaniem. Wyczyść szkiełko nakrywkowe, spłukując je kilkakrotnie bieżącą wodą dejonizowaną.

Następnie zanurz go w 75% roztworze etanolu na 15 minut. Umieść wysterylizowaną szkiełko nakrywkowe w okapie z przepływem laminarnym do wyschnięcia. Następnie ostrożnie umieść szkiełko przykrywkowe w płytce z sześcioma dołkami, unikając widocznych pęcherzyków.

Umieścić płytkę w inkubatorze w celu zrównoważenia przez co najmniej 15 minut. Jeśli na pokrywie płytki tworzy się mgła, użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wytrzeć ją do czysta przed obrazowaniem. Otwórz oprogramowanie do obrazowania fazy ilościowej i zainicjuj system.

Upewnij się, że wartości są dopuszczalne w samokalibracji czasu ekspozycji, kontrastu wzoru i szumu hologramu. Następnie umieść sześciodołkową płytkę na stoliku ilościowego mikroskopu obrazowego fazowego. Wróć do oprogramowania, kliknij przechwytywanie na żywo.

Następnie przejdź do menu ostrości oprogramowania i wybierz ręcznie. Następnie przejdź do menu ustawień mikroskopu i zgrubnie ustaw ostrość obrazów fazowych komórek, dostosowując odległość roboczą, aby uzyskać kontury komórek na obrazach fazowych. Po zakończeniu wróć do menu ostrości oprogramowania i zmień ustawienie ostrości na automatyczne.

Teraz kliknij nowy eksperyment. Rozpocznij wybieranie pozycji akwizycji obrazu za pomocą myszy lub strzałek na klawiaturze numerycznej. Kliknij przycisk "Zapamiętaj" po każdym wyborze.

Po wybraniu wszystkich pozycji przejdź do sekcji poklatkowej i ustaw interwały obrazowania tak, aby były krótsze niż pięć minut, a całkowity okres czasu wynosił 48 godzin. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk przechwytywania. Spowoduje to automatyczne ustawianie ostrości i rejestrowanie obrazów w wybranych pozycjach w każdym punkcie czasu interwału.

Po uzyskaniu obrazu przeanalizuj morfologię komórek, klikając najpierw identyfikuj komórki. Dostosuj ustawienie liczbowe progu tła tak, aby obszary komórek były dobrze oddzielone od szumu tła. Następnie dostosuj numer ustawienia rozmiaru obiektu, aby upewnić się, że każda komórka ma tylko jedno jądro.

Ręcznie zmodyfikuj wszystkie segmenty komórek, które nie spełniają tego wymagania, używając zmian ręcznych. Następnie użyj funkcji analizy danych w oprogramowaniu, aby przeanalizować komórki. Rozpocznij nową analizę danych, klikając przycisk Nowa analiza.

Przeciągnij wybrane obrazy na kartę ramek źródłowych i zapisz parametry morfologii komórki, w tym obszar komórki, grubość optyczną i objętość dla każdej pojedynczej komórki. Po zakończeniu wybierz tryb wykresu punktowego lub histogramu i wyeksportuj dane w postaci tabel lub rysunków. Wybierz co najmniej pięć obrazów oddalonych od siebie o 12 godzin i zapisz numery komórek dostarczone przez oprogramowanie.

Oszacuj tempo proliferacji komórek, normalizując je z początkową liczbą komórek, a następnie wykreślając liczbę komórek. Na koniec oszacuj czas podwojenia, dopasowując punkty danych za pomocą wykładniczej krzywej wzrostu. Aby przeanalizować ruch komórki, użyj funkcji śledzenia komórek w oprogramowaniu.

Zacznij od kliknięcia nowej analizy, aby rozpocząć nową analizę danych. Następnie przeciągnij serię obrazów z interesującego nas okresu na zakładkę klatek źródłowych. Następnie w trybie wyboru dodaj komórki wybierz losowo od 10 do 30 komórek, klikając je.

Pamiętaj, aby przejrzeć śledzenie w serii obrazów. W przypadku, gdy system straci śledzenie komórki lub śledzi niewłaściwą komórkę, ręcznie dostosuj komórkę śledzącą, klikając identyfikuj, aby zidentyfikować komórki lub przechodząc do trybu wyboru i klikając modyfikuj lokalizację, aby zmodyfikować lokalizację komórki. Po zakończeniu przejdź do wykreślenia ruchu i wybierz wiersze wykresu trajektorii komórek lub przejdź do opcji Wykres obiektów i wykreśl inne parametry związane z ruchem, takie jak ruchliwość, prędkość, ruchliwość, migracja i bezpośredniość migracji.

Eksportuj dane w postaci tabel lub rysunków. W tym protokole ilościowe obrazy fazowe są prezentowane jako hologramy. Pokazane tutaj komórki reprezentują typową morfologię komórek angiogennych i nieangiogennych ludzkich kostniakomięsaków.

Grubość komórki jest obliczana na podstawie współczynnika załamania światła i długości ścieżki optycznej i jest tutaj pokazana jako wykres punktowy. Dwa różne typy fenotypów komórek wykazywały różne wzorce dystrybucji i wskazują, że komórki angiogenne mają mniejsze obszary komórek i większą grubość komórek niż komórki nieangiogenne. Szybkość proliferacji dwóch typów komórek można obliczyć na podstawie obrazów 2D, takich jak te, które zostały podzielone na segmenty i obejmują okres dwóch dni.

Dla tych konkretnych typów komórek nie stwierdzono istotnych różnic. Aby określić charakterystykę ruchu komórek dla komórek, poszczególne komórki muszą być wybierane i śledzone w czasie. Tutaj śledzone komórki są obrysowane różnymi kolorami.

Każda pojedyncza komórka była śledzona w ciągu czterech godzin, a ich całkowita trajektoria ścieżki została opisana tutaj, gdzie punkt zerowy, zerowy jest ich lokalizacją początkową, a ich końcowa lokalizacja jest oznaczona kolorową kropką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać ilościowego obrazowania fazowego do ilościowego porównywania szeregu parametrów morfologicznych i behawioralnych komórek. W tym przypadku między angiogennymi i nieangiogennymi fenotypami komórek.

Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania możliwości wyjścia ze stanu uśpienia guza i roli angiogenności w tym procesie. Na platformie ciągłej i nieetykietującej. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi liniami komórkowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.