Name: Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj ilościowe obrazowanie fazowe do analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości ludzkich komórek osteosarkomy. Ta metoda pozwala badać fenotypy angiogenne i nieangiogenne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie Fundacji Badań nad Rakiem Piersi oraz Fundacji Zaawansowanych Badań Medycznych.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Szpitala Dziecięcego w Bostonie.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Rozmrażanie komórek KHOS-A i -N
	<ol>
		<li>Rozgrzej pożywkę hodowlaną, tj. zmodyfikowaną pożywkę Eagle firmy Dulbecco uzupełnioną 10% (obj./obj.) płodowej surowicy cielęcej (FBS) i 1% (obj./obj.) penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Wyjąć kriogeniczne fiolki z komórkami ze zbiornika ciekłego azotu, zanurzyć dno fiolek w ciepłej wodzie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie potrząsnąć fiolkami kriogenicznymi, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Nie dopuścić do kontaktu pokrywki fiolek kriogenicznych z wodą, aby uniknąć zanieczyszczenia. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, wysterylizuj fiolkę kriogeniczną, rozpylając 70% roztwór etanolu i wycierając fiolkę.</li>
		<li>W kapturze z przepływem laminarnym natychmiast odessać zawiesinę komórek z fiolki kriogenicznej i delikatnie zawiesić w 10 ml ogrzanej pożywki hodowlanej (opisanej w ppkt 1.1.1). Odwirować zawiesiny komórek w ilości około 200 x g przez 5 - 7 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml ogrzanej pożywki hodowlanej i przenieść do kolby T75. Delikatnie odpipetuj kilka razy, aby równomiernie zawiesić komórki, używając pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% (obj.) CO2 i wilgotną atmosferą. Pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej 12 godzin.</li>
		<li>Inkubuj komórki przez około 3 - 7 dni, aż osiągną 80 - 100% zlewania się. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie komórek KHOS-A i -N
	<ol>
		<li>Wyjąć pożywkę z kolby.</li>
		<li>Umyj komórki 5 ml sterylnego PBS (1x) bez wapnia i magnezu, aby usunąć nieprzylegające komórki lub frakcję.</li>
		<li>Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do kolby i krótko zamieszać kolbę, aby zapewnić równomierne rozproszenie trypsyny-EDTA.</li>
		<li>Inkubować kolbę przez 2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź komórki pod mikroskopem w powiększeniu około 400x, aby upewnić się, że komórki są zaokrąglone i odłączone.</li>
		<li>Po odłączeniu komórek dodaj 10 ml pożywki hodowlanej i delikatnie pipetuj pożywkę w górę i w dół kilka razy, aby rozbić agregaty komórek na zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Zliczanie komórek za pomocą licznika komórek. Zawiesinę komórek należy rozsiać do nowych kolb T75 o gęstości 2 × 106 komórek lub w stosunku 1:4.</li>
		<li>Pozwól komórkom urosnąć do 80 - 100% konfluencji przed wysiewem do eksperymentu QPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek KHOS-A i -N dla QPI
	<ol>
		<li>Komórki KHOS-A i -N zasiać na płytkach 6-dołkowych o gęstości 50 000 - 300 000 komórek/basenik z 5 ml pożywki hodowlanej po zliczeniu za pomocą licznika komórek. 
		UWAGA: Gęstość wysiewu zależy od szybkości proliferacji komórek i okresu obrazowania, aby uzyskać <100% zbieżność podczas akwizycji obrazowania.</li>
		<li>Inkubować komórki przez co najmniej 12 godzin, aby umożliwić przyczepienie.</li>
		<li>Zmień podłoże na świeże podłoże przed przeprowadzeniem QPI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja QPI
<ol>
	<li>Zakładanie szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Wyczyść szkiełko nakrywkowe, kilkakrotnie spłukując je bieżącą wodą dejonizowaną i wysterylizuj 75% roztworem etanolu przez zanurzenie na 15 minut. Włóż szkiełko nakrywkowe do sterylnego okapu z przepływem laminarnym do wyschnięcia.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe na płytce 6-dołkowej, aby uniknąć widocznych pęcherzyków. Upewnij się, że spód szkiełka nakrywkowego jest zanurzony w pożywce hodowlanej (minimum 5 ml/studzienkę).</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i wilgotna atmosfera) w celu zrównoważenia przez co najmniej 15 minut. Jeśli na szkiełku nakrywkowym utworzy się mgła, użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wytrzeć ją do czysta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie, aby zainicjować system, w tym autokalibrację czasu ekspozycji, kontrastu wzoru i szumu hologramu. Upewnij się, że wartości są dopuszczalne (pokazane w zielonym lub żółtym zakresie).</li>
		<li>Umieść 6-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu QPI.</li>
		<li>Kliknij "Live Capture" i wybierz "Manual" w "Software focus (Ostrość programowa)". Zgrubnie ustaw ostrość obrazów fazowych komórek, dostosowując odległość roboczą w "Ustawieniach mikroskopu", aby uzyskać kontury komórek na obrazach fazowych. Zmień na "Automatyczny" w "Fokus oprogramowania".</li>
		<li>Kliknij "Nowy eksperyment", aby utworzyć nowy eksperyment. Zacznij od wyboru pozycji akwizycji obrazu za pomocą myszy lub strzałek na klawiaturze numerycznej. Kliknij "Zapamiętaj" po każdym wyborze. Zwykle wybiera się od 3 do 5 lokalizacji dla każdej próbki.</li>
		<li>Ustaw interwały obrazowania i okres czasu w sekcji "Timelapse". 
		UWAGA: Aby wyraźnie śledzić komórki rakowe, odstępy powinny być krótsze niż 5 minut. 48 godzin jest ustawione jako okres czasu dla połączonej analizy QPI.</li>
		<li>Rozpocznij eksperyment, klikając "Przechwyć", co spowoduje automatyczne ustawienie ostrości i pobranie obrazów w ustawionych punktach czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Analiza morfologii komórki
	<ol>
		<li>Kliknij "Zidentyfikuj komórki". Dostosuj ustawienie liczbowe dla "Progu tła", aby obszary komórek były dobrze oddzielone od szumu tła. Dostosuj numer ustawienia dla "Rozmiar obiektu", aby upewnić się, że każda komórka ma jedno jądro. Utrzymuj spójne parametry dla próbek, które muszą być porównane, ponieważ mogą one mieć wpływ na końcowe pomiary powierzchni i objętości. W razie potrzeby ręcznie zmodyfikuj segmenty komórek za pomocą opcji "Zmiany ręczne".</li>
		<li>Użyj funkcji "Analizuj dane" w oprogramowaniu, aby przeanalizować komórki. Rozpocznij nową analizę danych, klikając "Nowa analiza". Przeciągnij wybrane obrazy do zakładki "Ramki źródłowe" i parametrów morfologii komórki, w tym obszaru komórki (μm2), grubości optycznej (μm) i objętości (μm3) dla każdej pojedynczej komórki. Wybierz tryb wykresu punktowego lub histogramu i wyeksportuj dane w postaci tabel lub wykresów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza proliferacji komórek
	<ol>
		<li>Wybierz co najmniej 5 obrazów dla różnych punktów zainteresowania w czasie (np. początkowy, 12 godzin, 24 godziny, 36 godziny i 48 godziny). Rejestruj numery komórek, które są dostarczane przez oprogramowanie.</li>
		<li>Aby oszacować czas podwajania, wykreśl numery komórek po znormalizowaniu z liczbami początkowymi i dopasuj je do wykładniczych krzywych wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ruchu komórek
	<ol>
		<li>Skorzystaj z funkcji "Śledź komórki" w oprogramowaniu. Kliknij "Nowa analiza", aby rozpocząć nową analizę danych. Przeciągnij serię obrazów dla wybranego okresu czasu (np. 4 godziny po 24 h inkubacji) do zakładki "Klatki źródłowe". Losowo wybierz od 10 do 30 komórek, klikając komórki w trybie wyboru "Dodaj komórki". Wyklucz komórki na krawędziach i te, które znajdują się poza polem widzenia.</li>
		<li>Dokładnie sprawdź śledzenie w serii obrazów. W przypadku, gdy system straci śledzenie komórki lub śledzi niewłaściwą komórkę, ręcznie dostosuj komórkę śledzącą, klikając "Identyfikuj", aby zidentyfikować komórki lub klikając "Modyfikuj lokalizację" w trybie "Wybierz", aby zmodyfikować lokalizację komórki.</li>
		<li>Wybierz wykres różowy trajektorii komórek w polu "Ruch wykresu" lub wykres dla innych parametrów związanych z ruchem w polu "Cechy wykresu", takich jak prędkość ruchliwości (μm/h), ruchliwość (μm), migracja (μm) i bezpośredniość migracji. Eksportuj dane w postaci tabel lub rysunków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li>
<li>Harper, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tumor+angiogenesis%3A+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications.</a> EXS. (96), 223-268 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+tumor+dormancy%3A+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).</li>
<li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-2+is+required+for+the+switch+to+the+angiogenic+phenotype+in+a+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+switch+of+dormant+tumors+to+fast-growing+angiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype.</a> Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signature+for+angiogenic+and+nonangiogenic+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).</li>
<li>Harper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+the+zinc+finger+transcription+factor+ZNF24%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24.</a> Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+of+VEGF+by+ZNF24%3A+mechanistic+studies+and+vascular+consequences+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo.</a> Blood. 121 (4), 707-715 (2013).</li>
<li>Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+zinc+finger+transcription+factor%2C+ZNF24%2C+modulates+the+angiogenic+potential+of+human+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+dormancy+of+human+liposarcoma+is+associated+with+impaired+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+micro+RNAs+governing+the+switch+of+dormant+tumors+to+the+fast-growing+angiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype.</a> PloS One. 7 (8), e44001(2012).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PloS One. 7 (9), e44395(2012).</li>
<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+induced+by+the+tumor+dormancy-associated+microRNA-190%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190.</a> Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).</li>
<li>Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+control+the+angiogenic+switch+in+mouse+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis.</a> Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+angiogenesis+during+the+transition+from+hyperplasia+to+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.</a> Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).</li>
<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopescu%2C+G+%22Quantitative+phase+imaging+of+cells+and+tissues%22">Quantitative phase imaging of cells and tissues</a>. , McGraw-Hill: New York. (2011).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Phase+Imaging+Techniques+for+the+Study+of+Cell+Pathophysiology%3A+From+Principles+to+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications.</a> Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).</li>
<li>Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Phase+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Phase Imaging.</a> Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).</li>
<li>Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptychography--a+label+free%2C+high-contrast+imaging+technique+for+live+cells+using+quantitative+phase+information%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information.</a> Scientific Reports. 3, 2369(2013).</li>
<li>Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+holographic+microscopy+for+non-invasive+monitoring+of+cell+cycle+arrest+in+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells.</a> PloS One. 9 (9), e106546(2014).</li>
<li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dormant+and+active+human+cancer+cells+by+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Advancement+of+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PloS One. 9 (2), e89000(2014).</li>
<li>Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+testing+at+the+single+cell+level+using+quantitative+phase+and+amplitude+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+red+blood+cell+mechanics+during+morphological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).</li>
<li>Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+blood+testing+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real time blood testing using quantitative phase imaging.</a> PloS One. 8 (2), e55676(2013).</li>
<li>Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+prostate+cancer+recurrence+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9976(2015).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+surface+area+and+deformability+of+individual+human+red+blood+cells+over+blood+storage+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 6, 34257(2016).</li>
<li>Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-mechanical+signatures+of+cancer+cells+based+on+fluctuation+profiles+measured+by+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry.</a> Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym badaniu opisujemy metodę in vitro, nieinwazyjną i bezznacznikową wykorzystującą QPI do ilościowego scharakteryzowania angiogennych i nieangiogennych fenotypów ludzkich komórek kostniakomięsaka. Za pomocą tej zintegrowanej, wysokoprzepustowej metody analizowano jednocześnie wiele parametrów komórkowych, w tym obszar komórki, grubość komórki, objętość komórki, szybkość proliferacji, czas podwojenia, bezpośredniość migracji, prędkość ruchliwości, migrację i ruchliwość.
W porównaniu...

Jednym z najwcześniejszych punktów kontrolnych w rozwoju i progresji guza litego jest nabycie fenotypu angiogennego, cechy charakterystycznej raka. Ten postęp obejmuje różnorodne procesy biochemiczne i molekularne1,2,3. Wyzwaniem technicznym w badaniu tego kluczowego etapu progresji guza jest brak narzędzi do ciągłego i ilościowego charakteryzowania i różnicowania między angiogennymi i nieangiogennymi fenotypami żywych komórek rakowych w bezstronny sposób. Tradycyjne testy stosowane do badania zachowań komórkowych komórek angiogennych i nieangiogennych zwykle wymagają drogich odczynników i instrumentów, na przykład testów proliferacji/migracji komórek4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 lub uzupełniające oceny in vivo4,5,6,8,15,16, a także wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i intensywnego czasu oraz pracochłonność.
Ostatnio, ilościowe obrazowanie fazowe (QPI) pojawiło się jako nowatorska technika, która umożliwia poklatkową i bezznacznikową ocenę różnych parametrów morfologii i zachowania komórek17,18,19,20,21,22. W przeciwieństwie do konwencjonalnej mikroskopii optycznej, QPI określa ilościowo zmiany przesunięcia fazowego piksel po pikselu po przejściu światła przez obiekt optyczny i rekonstruuje hologram z przeliczoną grubością i objętością optyczną, umożliwiając w ten sposób bezpośrednią analizę żywych komórek i następujących cech: (1) obrazowanie ilościowe, (2) obrazowanie nieinwazyjne i poklatkowe, (3) obrazowanie bez znaczników oraz (4) jednoczesne obrazowanie wieloparametrowe. Te cechy sprawiają, że QPI jest potężnym narzędziem do oceny i zrozumienia procesów patologicznych na poziomie komórkowym.
W niedawnym badaniu wykorzystaliśmy QPI do ilościowego scharakteryzowania i różnicowania między angiogennymi fenotypami KHOS-A i nieangiogennymi KHOS-N ludzkich komórek kostniakomięsaka w sposób systematyczny i ilościowy, łącząc analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości komórek23. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, porównano ilościowo panel parametrów morfologicznych i behawioralnych komórek między angiogennymi i nieangiogennymi komórkami ludzkiego kostniakomięsaka i zidentyfikowano pięć charakterystycznych różnic między tymi dwoma fenotypami. To nowatorskie podejście zapewnia zintegrowaną i ilościową platformę do oceny różnorodnych biologicznie istotnych cech komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Kolba T75</td><td>Corning, NY, USA</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe&nbsp;</td><td>Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)&nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals, GA, USA</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Z1 Licznik redlic</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>Z1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HoloMonitor M4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Szwecja</td><td>Mikroskop</td><td>M4</td></tr><tr><td>Hololid</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Szwecja</td><td>PHI 8020</td><td></td></tr><tr><td>HStudioM4</td><td>Phase Holograficzne obrazowanie Phi AB, Lund, Szwecja</td><td>Oprogramowanie HStudioM4</td><td></td></tr></tbody></table>

poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Nabycie fenotypu angiogennego jest niezbędnym elementem ucieczki z uśpienia guza. Chociaż opracowano kilka klasycznych testów in vitro (np. proliferacja, migracja i inne) oraz modeli in vivo w celu zbadania i scharakteryzowania angiogennych i nieangiogennych fenotypów komórek, metody te są czasochłonne i pracochłonne i często wymagają drogich odczynników i instrumentów, a także znacznej wiedzy specjalistycznej. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy nowatorską technikę ilościowego obrazowania fazowego (QPI) do przeprowadzenia poklatkowych i wolnych od znakowania charakterystyk angiogennych i nieangiogennych komórek ludzkiego kostniakomięsaka KHOS. Panel parametrów komórkowych, w tym morfologia komórki, proliferacja i ruchliwość, został ilościowo zmierzony i przeanalizowany za pomocą QPI. To nowatorskie i ilościowe podejście daje możliwość ciągłego i nieinwazyjnego badania odpowiednich procesów komórkowych, zachowań i cech komórek nowotworowych i innych typów komórek w prosty i zintegrowany sposób. Ten raport opisuje nasz protokół eksperymentalny, w tym przygotowanie komórek, akwizycję QPI i analizę danych.

Rysunek 1 przedstawia typową charakterystykę morfologii komórek. Obrazy zaprezentowano jako hologramy (Rysunek 1A-B) oraz obrazy 2D (Rysunek 1C-D). Optyczne grubości komórek (obliczone na podstawie współczynnika załamania światła i długości drogi optycznej) są ilościowane za pomocą profilu liniowego lub pomiaru całej komórki. Wykresy rozrzutu powierzchni i grubości k...

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe scharakteryzowanie angiogennych i nieangiogennych fenotypów ludzkich komórek kostniakomięsaka w sposób systematyczny, łącząc analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące powstawania i progresji nowotworów u ludzi. W szczególności ucieczka ze stanu spoczynku guza i przełącznik endogenny.Główną zaletą tej techniki jest to, że parametry wielokomórkowe mogą być analizowane jednocześnie za pomocą tej zintegrowanej metody o wysokim rozrozprzestrzenianiu. Obejmuje to obszar komórki, grubość komórki, objętość komórki, szybkość proliferacji, czas podwajania, prędkość ruchliwości, migrację i ruchliwość. Na początek podgrzej pożywkę hodowlaną do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.Następnie wyjmij kriogeniczne fiolki z angiogennymi i nieangiogennymi ludzkimi komórkami kostniakomięsaka ze zbiornika ciekłego azotu. Zanurz dno fiolek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie potrząśnij fiolkami kriogenicznymi, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, spryskaj fiolkę 70% etanolem i wytrzyj fiolkę, aby ją wysterylizować.Następnie natychmiast odessać zawiesinę komórkową z fiolki i delikatnie zawiesić je w 10 mililitrach podgrzanej pożywki hodowlanej. Następnie odwiruj zawiesiny komórek przez pięć minut, aby granulować komórki. Z powrotem do kaptura usuń supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami podgrzanej pożywki hodowlanej.Następnie przenieść zawiesinę komórek do kolby T75. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek kilka razy, aby równomiernie rozproszyć komórki. Umieścić kolbę w inkubatorze i pozostawić komórki do przyczepienia się przez co najmniej 12 godzin.Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Gdy komórki osiągną 80 do 100 procent konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną z kolby i umyj komórki pięcioma mililitrami sterylnego PBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% roztworu trypsonu EDTA do kolby i krótko zamieszać kolbę.Inkubować kolbę przez dwie do trzech minut, a następnie sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zaokrąglone i odłączone. Po odłączeniu komórek użyj pipety, aby dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej i delikatnie odpipetuj pożywkę kilka razy w górę iw dół, aby rozbić wszelkie pozostałe agregaty komórek. Po policzeniu komórek wysiewaj dwa miliony z nich do nowej kolby T75.Umieść kolbę w inkubatorze i hoduj komórki do zbieżności od 80 do 100 procent przed wysiewem komórek do eksperymentu obrazowania w fazie ilościowej. Zbieraj komórki przez trawienie tripsonów i nasiona angiogennych i nieangiogennych ludzkich kostniakomięsaków w sześciu dołkach o gęstości od 50 000 do 300 000 komórek na dołek. Przykryj komórki łącznie pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej.Następnie inkubuj płytki przez co najmniej 12 godzin, aby dać czas na przyczepienie się komórek. Zastąp pożywkę nowym nośnikiem przed obrazowaniem. Wyczyść szkiełko nakrywkowe, spłukując je kilkakrotnie bieżącą wodą dejonizowaną.Następnie zanurz go w 75% roztworze etanolu na 15 minut. Umieść wysterylizowaną szkiełko nakrywkowe w okapie z przepływem laminarnym do wyschnięcia. Następnie ostrożnie umieść szkiełko przykrywkowe w płytce z sześcioma dołkami, unikając widocznych pęcherzyków.Umieścić płytkę w inkubatorze w celu zrównoważenia przez co najmniej 15 minut. Jeśli na pokrywie płytki tworzy się mgła, użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wytrzeć ją do czysta przed obrazowaniem. Otwórz oprogramowanie do obrazowania fazy ilościowej i zainicjuj system.Upewnij się, że wartości są dopuszczalne w samokalibracji czasu ekspozycji, kontrastu wzoru i szumu hologramu. Następnie umieść sześciodołkową płytkę na stoliku ilościowego mikroskopu obrazowego fazowego. Wróć do oprogramowania, kliknij przechwytywanie na żywo.Następnie przejdź do menu ostrości oprogramowania i wybierz ręcznie. Następnie przejdź do menu ustawień mikroskopu i zgrubnie ustaw ostrość obrazów fazowych komórek, dostosowując odległość roboczą, aby uzyskać kontury komórek na obrazach fazowych. Po zakończeniu wróć do menu ostrości oprogramowania i zmień ustawienie ostrości na automatyczne.Teraz kliknij nowy eksperyment. Rozpocznij wybieranie pozycji akwizycji obrazu za pomocą myszy lub strzałek na klawiaturze numerycznej. Kliknij przycisk "Zapamiętaj" po każdym wyborze.Po wybraniu wszystkich pozycji przejdź do sekcji poklatkowej i ustaw interwały obrazowania tak, aby były krótsze niż pięć minut, a całkowity okres czasu wynosił 48 godzin. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk przechwytywania. Spowoduje to automatyczne ustawianie ostrości i rejestrowanie obrazów w wybranych pozycjach w każdym punkcie czasu interwału.Po uzyskaniu obrazu przeanalizuj morfologię komórek, klikając najpierw identyfikuj komórki. Dostosuj ustawienie liczbowe progu tła tak, aby obszary komórek były dobrze oddzielone od szumu tła. Następnie dostosuj numer ustawienia rozmiaru obiektu, aby upewnić się, że każda komórka ma tylko jedno jądro.Ręcznie zmodyfikuj wszystkie segmenty komórek, które nie spełniają tego wymagania, używając zmian ręcznych. Następnie użyj funkcji analizy danych w oprogramowaniu, aby przeanalizować komórki. Rozpocznij nową analizę danych, klikając przycisk Nowa analiza.Przeciągnij wybrane obrazy na kartę ramek źródłowych i zapisz parametry morfologii komórki, w tym obszar komórki, grubość optyczną i objętość dla każdej pojedynczej komórki. Po zakończeniu wybierz tryb wykresu punktowego lub histogramu i wyeksportuj dane w postaci tabel lub rysunków. Wybierz co najmniej pięć obrazów oddalonych od siebie o 12 godzin i zapisz numery komórek dostarczone przez oprogramowanie.Oszacuj tempo proliferacji komórek, normalizując je z początkową liczbą komórek, a następnie wykreślając liczbę komórek. Na koniec oszacuj czas podwojenia, dopasowując punkty danych za pomocą wykładniczej krzywej wzrostu. Aby przeanalizować ruch komórki, użyj funkcji śledzenia komórek w oprogramowaniu.Zacznij od kliknięcia nowej analizy, aby rozpocząć nową analizę danych. Następnie przeciągnij serię obrazów z interesującego nas okresu na zakładkę klatek źródłowych. Następnie w trybie wyboru dodaj komórki wybierz losowo od 10 do 30 komórek, klikając je.Pamiętaj, aby przejrzeć śledzenie w serii obrazów. W przypadku, gdy system straci śledzenie komórki lub śledzi niewłaściwą komórkę, ręcznie dostosuj komórkę śledzącą, klikając identyfikuj, aby zidentyfikować komórki lub przechodząc do trybu wyboru i klikając modyfikuj lokalizację, aby zmodyfikować lokalizację komórki. Po zakończeniu przejdź do wykreślenia ruchu i wybierz wiersze wykresu trajektorii komórek lub przejdź do opcji Wykres obiektów i wykreśl inne parametry związane z ruchem, takie jak ruchliwość, prędkość, ruchliwość, migracja i bezpośredniość migracji.Eksportuj dane w postaci tabel lub rysunków. W tym protokole ilościowe obrazy fazowe są prezentowane jako hologramy. Pokazane tutaj komórki reprezentują typową morfologię komórek angiogennych i nieangiogennych ludzkich kostniakomięsaków.Grubość komórki jest obliczana na podstawie współczynnika załamania światła i długości ścieżki optycznej i jest tutaj pokazana jako wykres punktowy. Dwa różne typy fenotypów komórek wykazywały różne wzorce dystrybucji i wskazują, że komórki angiogenne mają mniejsze obszary komórek i większą grubość komórek niż komórki nieangiogenne. Szybkość proliferacji dwóch typów komórek można obliczyć na podstawie obrazów 2D, takich jak te, które zostały podzielone na segmenty i obejmują okres dwóch dni.Dla tych konkretnych typów komórek nie stwierdzono istotnych różnic. Aby określić charakterystykę ruchu komórek dla komórek, poszczególne komórki muszą być wybierane i śledzone w czasie. Tutaj śledzone komórki są obrysowane różnymi kolorami.Każda pojedyncza komórka była śledzona w ciągu czterech godzin, a ich całkowita trajektoria ścieżki została opisana tutaj, gdzie punkt zerowy, zerowy jest ich lokalizacją początkową, a ich końcowa lokalizacja jest oznaczona kolorową kropką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać ilościowego obrazowania fazowego do ilościowego porównywania szeregu parametrów morfologicznych i behawioralnych komórek. W tym przypadku między angiogennymi i nieangiogennymi fenotypami komórek.Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania możliwości wyjścia ze stanu uśpienia guza i roli angiogenności w tym procesie. Na platformie ciągłej i nieetykietującej. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi liniami komórkowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.

a-time-lapse-label-free-quantitative-phase-imaging-study-dormant

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje bezznacznikową identyfikację morfologii i biochemii limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D. Technika ta pozwala na dokładną analizę limfocytów, odkrywanie ich wewnętrznych struktur i właściwości bez konieczności stosowania procedur znakowania.

Trójwymiarowe ilościowe obrazowanie fazowe w celu scharakteryzowania podtypów limfocytów

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Tutaj opisujemy metodę długoterminowej mikroskopii poklatkowej do długotrwałego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe.

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Poznaj ilościowe obrazowanie fazowe do analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości ludzkich komórek osteosarkomy. Ta metoda pozwala badać fenotypy angiogenne i nieangiogenne w czasie rzeczywistym.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów