Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest poprawa wydajności produkcji zrekonstruowanych zarodków i sklonowanych myszy za pomocą transferu jądra komórki somatycznej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii podstawowej, biologii rozwoju i ratowania zagrożonych zwierząt. Takich jak rozwój embrionalny, programowanie jądrowe i ochrona badań genetycznych.

Główną zaletą tej metody i techniki jest to, że możliwe jest generowanie sklonowanych myszy z praktycznym poziomem wydajności za pomocą prostych procedur. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej zgodnie z protokołem tekstowym rozpuścić 1,2 grama BSA w 10 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej. Dodać około 0,12 grama mieszanych kulek żywicy jonowymiennej do roztworu BSA w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.

Gdy kulki zmienią kolor z niebiesko-zielonego na złoty, użyj pipety, aby odzyskać roztwór supernatantu, a następnie zastąp kulki nową partią. Po upewnieniu się, że świeże koraliki nie zmieniają koloru, odzyskaj roztwór. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 10,5% wodorowęglanu sodu.

Za pomocą filtra 0,45 mikrona wysterylizuj supernatant, a następnie oznacz go jako roztwór podstawowy DBSA i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu eutanazji na samicach myszy poddanych superowulacji zgodnie z protokołem tekstowym, zastosowano standardowe techniki preparacyjne w celu nacięcia brzucha w celu uzyskania dostępu do dróg rodnych. Za pomocą małych prostych nożyczek i pęsety usuń jajowody i przenieś je na arkusz bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć krew z powierzchni.

Następnie ustaw jajowody w oleju mineralnym, a następnie za pomocą igieł preparacyjnych pokrój bańkę jajowodu i przenieś kompleksy oocytów wzgórka pochodzące z bańki do 200 mikrolitrowych kropli pożywki HCZB z 0,1% hialuronidazą. Inkubuj tkankę na płytce rozgrzewającej przez pięć minut. Pod mikroskopem stereoskopowym upewnij się, że komórki wzgórka są uwalniane z kompleksów oocytów wzgórka, a następnie przenieś oocyty drugiego etapu mejotycznego lub metafazy M2 z niektórymi pozostałymi komórkami wzgórka do pożywki MKSOM zawierającej 0,3% DBSA.

Umyj oocyty w stadium M2 cztery razy, pipetując w górę iw dół w pożywce, aby odłączyć pozostałe komórki wzgórka. Następnie inkubuj oocyty w pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla aż do enukleacji. Aby wyizolować ogołocone oocyty z kompleksów oocytów wzgórka, pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu pipety przenieść niewielką liczbę pozostałych komórek wzgórka rozproszonego z kompleksów oocytów wzgórka do pożywki HCZB z 6% DBSA.

Umieść wzgórki na płycie grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do transferu jądra komórki somatycznej lub SCNT. Po przygotowaniu pożywki PVP i roztworów podstawowych CB zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć wysterylizowanej pipety z 20 mikrolitrami pożywki HCZB zawierającej pięć mikrogramów na mililitr CB do przemycia oocytów w stadium M2. Po pięciokrotnym powtórzeniu płukania inkubować oocyty w roztworze enukleacyjnym na płytce grzewczej przez 10 minut.

Następnie należy przygotować komorę enukleacyjną, a następnie za pomocą pipety przenieść oocyty M2 do komory. Dodaj cztery mikrolitry roztworu enukleacji i przykryj komorę olejem mineralnym. Pod mikroskopem w temperaturze pokojowej zidentyfikuj wrzeciona i chromosomy oocytu w stadium M2.

Następnie za pomocą pipety podtrzymującej i mikropipety zorientuj oocyt z wyraźnym pierwszym ciałem biegunowym, tak aby wrzeciono i chromosom znajdowały się w pozycji 3:00 lub 9:00. Ustaw intensywność impulsu paizo na trzy do sześciu i za pomocą pipety mikromanipulacyjnej wywierć do osłonki przejrzystej i otwórz w niej otwór. Następnie przy minimalnej ilości cytoplazmy całkowicie wyłuszczyć wrzeciona i chromosomy.

W świetle widzialnym potwierdź brak chromosomów w cytoplazmie, a następnie za pomocą pożywki MKSOM zawierającej 0,3% DBSA pozbawionej CB dokładnie umyj wyłuszczone oocyty. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do fuzji komórek. Aby przygotować HBJE, dodaj 260 mikrolitrów lodowatego roztworu zawiesiny HBJE do liofilizowanego HVJ-E i pipetuj w górę iw dół, aż do całkowitego zawieszenia.

Przygotuj pięć mikrolitrowych porcji roztworu i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu fuzji komórek. Aby przeprowadzić fuzję komórek, użyj 20 mikrolitrów buforu fuzji komórek, aby rozcieńczyć pięć mikrolitrów roztworu HVJ-E. Rozcieńczony roztwór HBJE umieścić na lodzie do czasu użycia.

Po przygotowaniu komory do fuzji komórek, jak pokazano tutaj, za pomocą pipety przenieś wyłuszczone oocyty na pożywkę HCZB w komorze. Dodaj cztery mikrolitry każdego roztworu, jak pokazano, i użyj około jednego mililitra oleju mineralnego do przykrycia komory. Umieść komorę z wyłuszczonymi oocytami w temperaturze pokojowej pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu.

Następnie za pomocą pipety do mikromanipulacji przenieś komórki dawcy do roztworu zawiesiny HVJ-E. Odessaj komórki wzgórka jedna po drugiej, aby równomiernie oddzielić je od siebie, umożliwiając szeregową fuzję komórek. Następnie za pomocą pipety podtrzymującej utrzymuj wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB i użyj impulsu paizo z pipetą do mikromanipulacji, aby nawiercić osłonkę przejrzystą.

Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej, należy odpipetować komórkę wzgórka z około pięciokrotną objętością roztworu HVJ-E i wydalić go szczelnie do błony oocytów bez przechodzenia przez błonę. Po manipulacji fuzją komórek należy niezwłocznie przenieść oocyty na pożywkę MKSOM zawierającą 0,3% DBSA i przenieść je do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na godzinę. Etapy przygotowania należy wykonać w ciągu 10 minut od umieszczenia wyłuszczonych oocytów w pożywce HCVB pod mikroskopem do zwrócenia ich do inkubatora.

Po fuzji komórek, pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu, sprawdź, czy w zrekonstruowanych oocytach nie doszło do przedwczesnej kondensacji chromosomów. Przenieś zrekonstruowane oocyty na pożywkę aktywacyjną zawierającą trichostatynę A lub TSA i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w powietrzu przez sześć godzin. Obserwuj tworzenie się przedjądrzy w zarodkach SENT, a następnie zastosuj jeszcze dwie godziny leczenia TSA w pożywce MKSOM z 0,3% TBSA.

Kurację witaminą C należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym. Jak widać w tej tabeli, leczenie TSA i witaminą C na oocytach sklonowanych myszy wykazało bardzo wysokie tempo tworzenia się jądra i rozwinęło się do stadium dwukomórkowego w każdych warunkach. Niektóre sklonowane zarodki, które pochodziły z komórek wzgórka i rozwinęły się do stadium dwukomórkowego, przeniesiono do jajowodów samic w rzekomej ciąży.

Rysunek ten przedstawia sześcioro sklonowanych potomków, które rozwinęły się z 72 przeniesionych zarodków wytworzonych przez trzy ciężarne samice w wyniku seryjnego leczenia TSA i witaminą C. Wreszcie, jak wykazano tutaj, leczenie TSA i VC znacznie poprawiło efektywność rozwoju embrionalnego in vitro do stadium blastocysty. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że wszystkie niezbędne podłoża i odczynniki są przygotowane z wyprzedzeniem. Sam zabieg oraz proste do wykonania i dobrze przygotowane materiały zapewnią osiągnięcie oczekiwanych efektów.

Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak produkować zrekonstruowane oocyty.