Name: Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę klonowania myszy z wykorzystaniem trichostatyny A i witaminy C w celu zwiększenia skuteczności rozwoju zarodków. Protokół ten standaryzuje proces transferu jądra komórki somatycznej w badaniach biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty JSPS KAKENHI o numerach JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 dla K.M. Sumitomo Foundation Grant for Basic Science Research Projects (150810 do K.M.). Grant badawczy Uniwersytetu Kindai (15-I-2 dla KM i MA). M.O. dziękuje za podstawowe wsparcie udzielone przez Cancer Research UK (C6946/A24843) i Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Dziękujemy Pani N. Backes-Kamimura i Panu J. Horvatowi za korektę.

Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Kindai dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować zmodyfikowaną pożywkę KSOM (mKSOM) do hodowli zarodków, składającą się z 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mMMgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D(+)-glukoza, 0,2 mM pirogronian sodu, 1,0 mM L-glutamina, 1,0 g/L poliwinylopirolidon (PVP), 25,07 mM NaHCO3, 10 mM DL-mleczanu sodu, 0,05 g/l penicyliny i 0,05 g/l streptomycyny w sterylnej wodzie.</li>
	<li>Przygotować pożywkę CZB (HCZB) buforowaną przez Hepes do manipulacji zarodkami, składającą się z 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mMMgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2Na, 36,1 mM DL-mleczanu sodu, 5,55 mM D(+)-glukozy, 0,025 g/ml penicyliny, 0,035 g/l streptomycyny, 0,014 mM czerwieni fenolowej, 1,0 g/l alkoholu poliwinylowego, 5,0 mMNaHCO3 i 20,0 mM soli sodowej Hepes w sterylnej wodzie.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę aktywacyjną do aktywacji oocytów: pożywkę mKSOM uzupełnioną 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 μg/ml cytochalazyny B (CB) i 5 mM SrCl2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej (dBSA)
<ol>
	<li>Rozpuścić 1,2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej (stężenie końcowe 12%).</li>
	<li>Dodać około 0,12 g zmieszanych kulek żywicy jonowymiennej do wyżej przygotowanych 12% BSA w sterylnej wodzie o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Gdy kulki zmienią kolor z niebiesko-zielonego na złoty, odzyskaj roztwór supernatantu za pomocą pipety. Następnie zastąp koraliki świeżymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Wymiana koralików jest zwykle wykonywana tylko raz. Prawdopodobnie wymaga kilku wymian, aby zakończyć dejonizację. Tylko orientacyjnie, jeśli kolor koralików pozostaje niezmieniony od niebiesko-zielonego do złotego, oznacza to, że wymiana jonowa jest zakończona.</li>
	<li>Odzyskaj roztwór po upewnieniu się, że nie ma zmiany koloru w kulkach. 
	UWAGA: Jeśli odzyskany roztwór stanie się mętny, odwiruj go, aby zapobiec zatkaniu filtra (175 x g, 5 min).</li>
	<li>Uzupełnij odzyskany roztwór 250 μl 10,5% NaHCO3, 
	UWAGA: Ten proces jest przeznaczony dla roztworu dBSA w celu zneutralizowania warunków pH. Jednak NaHCO3 może być zbędny.</li>
	<li>Wysterylizuj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C jako roztwór podstawowy dBSA.</li>
</ol>
3. Kolekcja oocytów
UWAGA: Wszystkie myszy były utrzymywane w klimatyzowanych pomieszczeniach z kontrolowanym światłem.
<ol>
	<li>Każdą samicę myszy B6D2F1 (w wieku 8 - 10 tygodni) należy poddać superowulacji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 7,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) i 7,5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) 48 godzin po wstrzyknięciu PMSG.</li>
	<li>Wykonać eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy 14 - 16 godzin po wstrzyknięciu hCG. Naciąć brzuch, aby uzyskać dostęp do układu rozrodczego, stosując standardowe techniki preparacji13. Krótko uszczypnij skórę i wykonaj nożyczkami małe boczne nacięcie na linii środkowej. Przytrzymaj skórę mocno powyżej i poniżej nacięcia i pociągnij skórę w kierunku głowy i ogona. Przetnij otrzewną nożyczkami, odepchnij cewki jelita i potwierdź obecność dwóch rogów macicy, jajowodów i jajników.</li>
	<li>Usuń jajowody małymi prostymi nożyczkami i pęsetą, umieść na arkuszu bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć krew z powierzchni. Ustaw jajowody w oleju mineralnym. Następnie należy przeciąć bańkę jajowodu za pomocą igieł rozwarstwiających i przenieść kompleksy wzgórek-oocyty pochodzące z bańki jajowodu do 200 μl kropli pożywki HCZB z 0,1% hialuronidazą. Inkubować przez 5 minut na płycie rozgrzewającej. 
	Uwaga: Ekspozycja dłuższa niż 10 minut na pożywkę HCZB z 0,1% hialuronidazą byłaby szkodliwa dla oocytów.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki wzgórka są uwalniane z kompleksów wzgórek-oocyt pod mikroskopem stereoskopowym, przenieś oocyty drugiego etapu metafazy mejotycznej (MII) z niektórymi pozostałymi komórkami wzgórka na pożywkę mKSOM zawierającą 0,3% dBSA. Następnie przemyj oocyty w stadium MII czterokrotnie, pipetując w górę iw dół (za pomocą pipety o średnicy wewnętrznej <100 μm) w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA w celu odłączenia pozostałych komórek wzgórka. 
	UWAGA: Użycie małej pipety ułatwia odklejanie się komórek wzgórka.</li>
	<li>Inkubować oocyty w stadium Mll w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 aż do enukleacji. 
	UWAGA: Zalecana jest mała pipeta o średnicy nieco większej niż średnica oocytu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek dawcy do transferu jądrowego
<ol>
	<li>Po krokach 3,3 - 3,5 ogołocone oocyty są izolowane z kompleksów wzgórek-oocyty. Przenieść niewielką ilość (około 2 μl) pozostałych komórek wzgórka rozproszonego z kompleksów wzgórek-oocyty w pożywce HCZB z 0,1% hialuronidazą do pożywki HCZB z 6% dBSA za pomocą pipety pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Umieścić wzgórki w pożywce HCZB z 6% dBSA na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, aż będą potrzebne do SCNT. 
	UWAGA: Gdy komórki fibroblastów (np. mysie płodowe komórki fibroblastów) są używane jako komórki dawcy, odłącz komórki od naczynia do hodowli tkankowej i odwiruj je do postaci osadu. Zawiesić osad komórek w podłożu HCZB zawierającym 6% dBSA.</li>
</ol>
5. Wyłuszczenie oocytów
<ol>
	<li>Przygotuj 9% pożywkę PVP, dodając 0,9 g PVP do 10 ml pożywki HCZB, przechowuj w lodówce przez noc (4 °C), a następnie wysterylizuj za pomocą filtra 0,45 μm.</li>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe CB (stężenie 1 mg/ml), dodając 5 mg CB do 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć roztwór podstawowy CB pożywką HCZB (końcowe stężenie 5 μg/ml) i użyć jako roztworu enukleacji.</li>
	<li>Przemyć oocyty w stadium Mll w 20 μl pożywki HCZB zawierającej 5 μg/ml CB (roztwór enukleacji) poprzez wdychanie i wydychanie przez wysterylizowaną pipetę (średnica wewnętrzna: 150 μm do 200 μm). Powtórz procedurę prania pięć razy. Odczekaj około 10 minut na płycie grzewczej w roztworze enukleacji przed rozpoczęciem procesu enukleacji.</li>
	<li>Przygotuj komorę enukleacyjną, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. Przenieść oocyty Mll do komory enukleacji poprzez wdychanie i wydychanie za pomocą pipety (średnica wewnętrzna: od 150 μm do 200 μm); umieścić 4 μl roztworu enukleacji i zalać komorę olejem mineralnym. 
	UWAGA: Zamiast komory można zastosować pokrywę z szalki Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Zidentyfikuj wrzeciona i chromosomy oocytu w stadium MII pod mikroskopem (400X) w temperaturze pokojowej. Zorientuj oocyt w stadium Mll z wyraźnym pierwszym ciałem polarnym, tak aby wrzeciono i chromosom znajdowały się na godzinie 3 lub 9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) za pomocą pipety trzymającej i mikropipety. 
	UWAGA: Zastosowany mikroskop posiada soczewki o łącznym powiększeniu 400X. Ponadto soczewka obiektywu N.A wynosi 5X/0.12 i 40X/0.55. Piezoelektryczne sterowanie impulsem pipety umożliwia szybkie wiercenie w osłonie przejrzystej. Ponadto system laserowy (np. XYClone) może być również używany do wiercenia w osłonie przezroczystej w miejsce piezoelektrycznego układu napędowego.</li>
	<li>Ustaw intensywność impulsu piezoelektrycznego na 3 - 6 i wywierć do osłony przejrzystej za pomocą pipety do mikromanipulacji (końcówka o płaskim końcu o średnicy wewnętrznej 7 - 8 μm) z napędem impulsu piezoelektrycznego. Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej, całkowicie wyłuszczyć wrzeciona i chromosomy minimalną ilością cytoplazmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Podczas tego procesu oocyty mają tendencję do ścisłego przylegania do dna naczynia lub pipety ze względu na pożywkę bez BSA14. W ciągu 10 minut proces enukleacji musi zostać zakończony, a wyłuszczone oocyty muszą zostać zwrócone do inkubatora. Odpowiednia liczba oocytów, którymi można manipulować w jednej enukleacji, wynosi od 10 do 20. W przypadku większych partii oocytów procedurę enukleacji powtarza się.</li>
	<li>Potwierdź brak chromosomów w cytoplazmie w świetle widzialnym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, środek), a następnie dokładnie umyj wyłuszczone oocyty w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA bez CB. Wprowadzić naczynie do inkubatora w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 aż do fuzji komórek. 
	UWAGA: Po enukleacji cytoplazma usunięta z ooplazmy zawiera wrzeciona i chromosomy.</li>
</ol>
6. Fuzja komórki dawcy i wyłuszczonego oocytu
<ol>
	<li>Przygotowanie HVJ-E
	<ol>
		<li>Dodać 260 μl lodowatego roztworu zawiesiny HVJ-E do liofilizowanego HVJ-E (z zestawu, patrz tabela materiałów) i pipetować w górę iw dół, aż do całkowitego zawieszenia. 
		UWAGA: Odpowiednia ilość liofilizowanego HVJ-E jest przygotowana w butelce, a w zestawie znajduje się 260 μL roztworu zawiesiny HVJ-E.</li>
		<li>Przygotować 5 μl podwielokrotności roztworu HVJ-E, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu fuzji komórek. 
		Uwaga: Ostrożnie traktuj HVJ-E na lodzie, ponieważ jest wrażliwy na temperaturę. Po zakończeniu eksperymentu należy odpowiednio autoklawować materiały i pojemniki HVJ-E, aby całkowicie dezaktywować składniki wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fuzja komórek
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 5 μl roztworu HVJ-E w 20 μl buforu do fuzji komórek. Rozcieńczony roztwór HVJ-E umieścić na lodzie do czasu użycia. 
		UWAGA: Bufor fuzji komórek znajduje się w zestawie HVJ-E.</li>
		<li>Przygotuj komorę fuzji komórek, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3A. Przenieść wyłuszczone oocyty do pożywki HCZB w komorze fuzji komórek za pomocą pipety (średnica wewnętrzna: 150 μm do 200 μm); umieścić 4 μl każdego roztworu (pożywka HCZB zawierająca 6% -BSA dla komórek dawcy, roztwór HVJ-E, pożywka HCZB, 9% PVP w pożywce HCZB) i przykryć komorę około 1 ml oleju mineralnego. 
		UWAGA: Odpowiednia liczba wyłuszczonych oocytów, które są przenoszone do komory w celu manipulacji podczas jednej procedury fuzji komórek, wynosi od 5 do 30. W przypadku większych partii oocytów procedurę fuzji komórek powtarza się. Zamiast komory można zastosować 60-milimetrową pokrywę szalki Petriego, jeśli jest dostępna.</li>
		<li>Umieścić wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB pod mikroskopem w 400-krotnym powiększeniu w temperaturze pokojowej. Odessać komórki dawcy za pomocą pipety do mikromanipulacji (płaska końcówka o średnicy wewnętrznej 6-7 μm) i wydalić komórki do roztworu zawiesinowego HVJ-E.</li>
		<li>Następnie odsysaj wzgórki pojedynczo roztworem zawiesiny HVJ-E, aby były równomiernie oddzielone od siebie, umożliwiając seryjną fuzję komórek. Utrzymuj wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB za pomocą pipety podtrzymującej. Wywierć osłonę przejrzystą pipetą mikromanipulacyjną z impulsem piezoelektrycznym (intensywność 3 - 6, prędkość 2 - 3).</li>
		<li>Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej należy przyłożyć komórkę wzgórka do błony oocytu wraz z roztworem zawiesiny HVJ-E o objętości 5 razy większej niż objętość komórki wzgórka, nie przechodząc przez błonę oocytów. 
		UWAGA: Przygotować płaskie końcówki pipet mikromanipulacyjnych o średnicy wewnętrznej 6 - 7 μm do komórek wzgórka. Pipety należy regularnie myć przy użyciu 9% pożywki PVP, aby utrzymać płynne uwalnianie komórek. Kroki 6.2.3 - 6.2.5 muszą zostać zakończone w ciągu 10 minut, w przeciwnym razie wydajność fuzji komórek będzie niższa. Aktywność fuzji membranowej HVJ-E jest inaktywowana przez autoklawowanie, traktowanie detergentem lub 70% etanolem. Po doświadczeniu roztwór HVJ-E należy odpowiednio zutylizować.</li>
		<li>Po manipulacji fuzją komórek należy niezwłocznie przenieść oocyty na pożywkę mKSOM zawierającą 0,3% dBSA i przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Aktywacja zrekonstruowanych oocytów i leczenie trichostatyną A i witaminą C
<ol>
	<li>Przygotowanie TSA
	<ol>
		<li>Dozować 5 mM roztwór TSA do 3 μl porcji i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl 5 mM roztworu podstawowego TSA do 1 ml DMSO (stężenie 12,5 μM).</li>
		<li>Rozcieńczyć 8 μl 12,5 μM roztworu podstawowego TSA w 2 ml pożywki aktywacyjnej i pożywki mKSOM (stężenie końcowe 50 nM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie VC
	<ol>
		<li>Dodać 1 mg VC do 1 ml sterylnej wody wolnej od endotoksyn i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać roztwór podstawowy VC do pożywki mKSOM (końcowe stężenie 10 μg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja zrekonstruowanych oocytów
	<ol>
		<li>Godzinę po fuzji komórek sprawdź przedwczesną kondensację chromosomów (PCC) w zrekonstruowanych oocytach (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 3B) za pomocą mikroskopu (400X).</li>
		<li>Przenieść zrekonstruowane oocyty do pożywki aktywacyjnej (patrz krok 1.3) zawierającej TSA i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w powietrzu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3C). Obserwuj tworzenie się pro-jąder w zarodkach SCNT, a następnie zastosuj 2 kolejne godziny leczenia TSA w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA (<klasa silna = "xfig">Ryc. 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zarodki poddane działaniu TSA na pożywkę mKSOM uzupełnioną VC i inkubuj przez 7 godzin, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3D.</li>
	<li>Po 7 godzinach od poddania działaniu VC przenieść zarodki poddane VC do pożywki mKSOM zawierającej 0,3% dBSA i inkubować przez 4 dni w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w powietrzu. 
	UWAGA: Aby wyprodukować sklonowane myszy, przenieś morfologicznie normalne zarodki w stadium 2-komórkowym do jajowodów samic myszy w ciąży (MCH (ICR)) w dniu znalezienia czopa pochwowego (dzień 0,5 ciąży rzekomej) 15. Po 19,5 dnia rejestruje się liczbę miejsc implantacji i noworodków po cesarskim cięciu.</li>
</ol>

<ol><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+cloned+mice+by+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer.</a> Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).</li>
<li>Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+mice+after+nuclear+transfer+by+electrofusion+using+tail+tip+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells.</a> Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).</li>
<li>Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+mice+from+fetal+fibroblast+cells+arrested+at+metaphase+by+a+serial+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+following+somatic+cell+nuclear+transfer+impeded+by+persisting+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.</a> Cell. 159 (4), 884-895 (2014).</li>
<li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).</li>
<li>Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+acetylation+in+reprogramming+of+somatic+nuclei+following+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+trichostatin+A+on+chromatin+remodeling%2C+histone+modifications%2C+DNA+replication%2C+and+transcriptional+activity+in+cloned+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos.</a> Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methylation+is+a+barrier+during+somatic+cell+reprogramming+into+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs.</a> Nat Genet. 45, 34-42 (2013).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+in+vitro+and+in+vivo+development+of+porcine+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos.</a> Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).</li>
<li>Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracytoplasmic+injection+of+deionized+bovine+serum+albumin+immediately+after+somatic+cell+nuclear+transfer+enhances+full-term+development+of+cloned+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos.</a> J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+towards+totipotency+is+greatly+facilitated+by+synergistic+effects+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules.</a> Biol Open. 6, 415-424 (2017).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/mmouse4p.htm">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).</li>
<li>Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+effect+of+partial+zona-pellucida+dissection+on+the+in+vitro+fertilizing+capacity+of+cryopreserved+C57BL%2F6J+transgenic+mouse+spermatozoa+of+low+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility.</a> Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).</li>
<li>Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+male+mice+from+adult+tail-tip+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of male mice from adult tail-tip cells.</a> Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).</li>
<li>Ogura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+male+cloned+mice+from+fresh%2C+cultured%2C+and+cryopreserved+immature+sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells.</a> Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).</li>
<li>Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+cloned+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mice cloned from embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).</li>
<li>Tachibana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+gene+replacement+in+primate+offspring+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells.</a> Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oocytes+reprogram+adult+somatic+nuclei+of+a+type+1+diabetic+to+diploid+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells.</a> Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).</li>
<li>Mizutani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cloned+mice+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cell+lines+from+urine-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells.</a> Sci Rep. 6, 1-8 (2016).</li>
<li>Kaminuma, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyper-reactive+cloned+mice+generated+by+direct+nuclear+transfer+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells.</a> EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).</li>
<li>Terashita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latrunculin+A+can+improve+the+birth+rate+of+cloned+mice+and+simplify+the+nuclear+transfer+protocol+by+gently+inhibiting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization.</a> Biol Reprod. 86 (6), 180(2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+improve+in+vitro+and+in+vivo+developmental+competence+of+somatic+cell+nuclear+transfer+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).</li>
<li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichostatin+A+%28TSA%29+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos%2C+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li>
<li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podsumowując, wyniki te sugerują, że przedstawiona metoda SCNT może zmniejszyć trudności techniczne i zwiększyć skuteczność SCNT bez konieczności modyfikacji genetycznych i suplementacji mRNA (Tabela 1, Tabela 2) oraz zapewnić stabilną produkcję sklonowanych zarodków. Metoda ta pozwala nam zrekonstruować więcej zarodków SCNT niż metody konwencjonalne ze względu na lepszą przeżywalność i uproszczony protokół. W tym protokole jednym z krytycznych kroków jest fuzja komórek. Aby pomyślnie wyprodukować sklonowane myszy, konieczne jest upewnienie się, że odpowiednia ilość HVJ-E opisana w protokole jest utrzymywana podczas procesu fuzji komórek, a oocyty muszą zostać zwrócone do inkubatora w ciągu 10 minut podczas kroków 6.2.3 - 6.2.5. Ponieważ w pipecie manipulacyjnej można jednocześnie odessać od 20 do 30 komórek dawcy razem z HVJ-E, liczba oocytów uzyskanych w wyniku jednej operacji jest większa niż w przypadku istniejącej metody. Finalnie w ciągu 10 minut jesteśmy w stanie wyprodukować około 20 do 30 zrekonstruowanych oocytów. Nawet podczas pracy z dużą partią oocytów (100 lub więcej) procedura fuzji komórek powinna zająć godzinę lub mniej, powtarzając kroki 6.2.3 - 6.2.5. Przedstawione tutaj metody i techniki mogą służyć jako skuteczne protokoły z uproszczonymi wymaganiami technicznymi.
Obecnie mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju zarodków SCNT są nadal niejasne. Ta ulepszona metoda SCNT przyczynia się również do badania takich mechanizmów przeprogramowywania, ponieważ metoda ta może wyprodukować wiele sklonowanych embrionów w jednym eksperymencie. Ta metoda wykorzystuje komórki somatyczne z nienaruszonymi błonami komórkowymi do fuzji komórek. W związku z tym możliwe jest zastosowanie tego podejścia do innych komórek, takich jak komórki końca ogona16, komórki Sertoliego17 i embrionalne komórki macierzyste (ES)18. Gdy konwencjonalne metody SCNT są stosowane do wstrzykiwania stosunkowo dużych komórek, takich jak komórki końca ogona, bezpośrednio do cytoplazmy oocytów, uzyskanie żywych zarodków staje się jeszcze bardziej wymagające technicznie. Ponadto stosunkowo twarde komórki, takie jak komórki Sertoliego, są trudne do rozbicia przez pipetowanie do wstrzykiwań. Biorąc pod uwagę te różne typy komórek, metoda fuzji komórek z wykorzystaniem HVJ-E jest prosta i skuteczna. Chociaż wartość i bezpieczeństwo HVJ-E zostały przekonująco wykazane19,20, ważne może być ponowne rozważenie wykonalności wykorzystania HVJ-E do produkcji klonowanych zwierząt do celów rolniczych lub biomedycznych.
Co więcej, ostatnio jedna grupa z powodzeniem wyprodukowała sklonowane myszy pochodzące z komórek moczu21. Aby ratować zagrożone gatunki ssaków, odtąd idealne będzie SCNT wykorzystujące komórki pobrane w sposób nieinwazyjny, takie jak komórka moczu. Niedawno inna grupa bezpośrednio wygenerowała sklonowane myszy przy użyciu specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 + 22. Interesujące byłoby zbadanie, czy ta metoda ma również zastosowanie do skutecznego klonowania myszy z takich komórek. Ponadto latrunkulina A została zgłoszona jako lepsza alternatywa dla hamowania polimeryzacji aktyny podczas enukleacji i partenogenetycznej aktywacji oocytów SCNT23. Przyszłe badania mogą ujawnić, czy leczenie latrunkuliną A, zamiast cytochalazyny B, jeszcze bardziej poprawia wytwarzanie sklonowanego potomstwa. Dodatkowo, leczenie TSA zostało z powodzeniem zastosowane u myszy, świń24 i królików25 poprzez zmianę czasu, okresu i stężenia leczenia. Co więcej, VC nie tylko wspomaga rozwój embrionalny u świń SCNT10, ale także poprawia produkcję komórek iPS u ludzi i myszy26. W związku z tym można spekulować, że leczenie TSA i VC może być również stosowane do innych gatunków ssaków i może być konieczne zoptymalizowanie czasu leczenia TSA i VC dla każdego gatunku.
Podsumowując, metoda ta umożliwiłaby generowanie sklonowanych myszy o praktycznym poziomie wydajności za pomocą prostych procedur. Dlatego wyniki tego badania mogą skłonić nas do wykorzystania technologii SCNT do zachowania zasobów genetycznych rzadkich zwierząt oraz do zrozumienia molekularnych mechanizmów przeprogramowania jądra i wczesnego rozwoju embrionalnego.

Technologia SCNT umożliwia produkcję klonowanych zwierząt przy użyciu tylko jednej komórki somatycznej lub jądra, które mają być przeniesione do wyłuszczonego oocytu. Jednym z celów techniki SCNT jest wyprowadzenie linii embrionalnych komórek macierzystych z transferem jądrowym (NT-ESC) ze sklonowanych zarodków. W 1998 roku Wakayama i in. poinformowali, że po raz pierwszy udało im się sklonować mysz o imieniu Cumulina1. Od tego czasu klonowanie myszy było szeroko badane i uzyskano wiele ważnych informacji na temat przeprogramowania jądra somatycznego. Z drugiej strony, technice tej towarzyszą liczne etapy mikromanipulacji, które są dość trudne do opanowania, wymagające intensywnego treningu trwającego ponad 3 miesiące2.
Produkcja klonowanych myszy za pomocą SCNT ewoluowała od oryginalnej metody Honolulu1, metody elektrooporowej3, do metody fuzji komórek za pomocą hemaglutynującego wirusa Japonii (HVJ)4. Jednak bezpośrednie wstrzyknięcie jądra komórkowego przez błonę cytobłonową ma tendencję do szkodliwego wpływu na przeżycie oocytów. Elektrooporowość ma niską wydajność, ponieważ każda błona komórkowa ma inną twardość, co utrudnia określenie optymalnego stanu. Obchodzenie się z HVJ jest pracochłonne, ponieważ wymaga specjalnego sprzętu dla bezpieczeństwa badaczy i zwierząt laboratoryjnych. Ostatnio, do fuzji cytoplazmy komórki dawcy i oocytu, zastosowano HVJ-E5. HVJ-E ma zdolność łączenia błon tylko bez zdolności proliferacyjnych lub zakaźnych wirusów. Genomowe RNA HVJ są całkowicie inaktywowane w HVJ-E. Zastosowanie HVJ-E ułatwia zatem obsługę fuzji komórek podczas SCNT.
Kilka raportów wykazało, że leczenie zarodków SCNT TSA, inhibitorem deacetylazy histonowej, znacznie poprawia wydajność produkcji żywych szczeniąt z mniej niż 1% do 6,5%6,7. Leczenie TSA przyspiesza przeprogramowanie poprzez modyfikację znaczników histonowych w zarodkach SCNT8. Ostatnio wykazano, że wstrzykiwanie określonych mRNA, podrodziny demetylazy lizyny histonowej 4 (KDM4), które usuwają trimetylację histonu H3 lizyny 9 (H3K9) w zarodkach SCNT, zwłaszcza w regionach opornych na przeprogramowanie, zwiększa rozwój sklonowanych zarodków myszy9. Tymczasem VC, który służy również jako modyfikator histonów, zmniejszył trimetylację H3K910. Ponadto VC wspomaga rozwój embrionalny u świń SCNT10. Doniesiono, że wstrzyknięcie dBSA do zarodków SCNT prowadzi do poprawy rozwoju embrionalnego11.
Wcześniej odkryliśmy, że połączenie małych molekuł, a mianowicie TSA i VC, wraz z dBSA, znacznie przyspieszyło rozwój zarodków SCNT12. W tym miejscu szczegółowo opisana została wcześniej opisana metoda SCNT dla myszy, która reprezentuje wysoce wydajne i proste procedury klonowania12. Opisujemy również sposób obchodzenia się z HVJ-E. Mogą one pomóc wielu naukowcom w dziedzinie biologii rozwoju i rozrodu w zachowaniu zasobów genetycznych lub produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt za pomocą tej metody SCNT.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>28-2270-5</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-03542</td><td>Dla średnich</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>165-04242</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2</td><td>O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>137-00402</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2</td><td>O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00431</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>D(+)-glukozy</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>pirogronianu sodu</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-03062</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>G3126</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>poliwinylopirolidon</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>168-17042</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31213-15</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>DL-mleczanu sodu</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31605-72</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>penicyliny</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222637671 (GTIN-13)</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>Streptomycyny</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222665643 (GTIN-13)</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>sterylnej wody, bez endotoksyn</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-15645</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>EDTA i middot; 2Na</td><td>Dojindo Lab.</td><td>345-01865</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P0290</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>soli sodowej HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3784</td><td>Dla średniego</td></tr><tr><td>alkoholu poliwinylowego</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P8136</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A3311</td><td>Dla średniej</td></tr><tr><td>żywicy BT AG 501-X8 (D)</td><td>Bio-Rad Lab., Inc.</td><td>143-7425</td><td>Do przygotowania</td></tr><tr><td>hialuronidazy</td> dBSA <td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3506</td><td>Do pobierania oocytów i komórek wzgórka</td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>034-17554</td><td>Do enukleacji i aktywacji oocytów</td></tr><tr><td>Mikromanipulator piezoelektryczny</td><td>Prime tech, Co., Ltd.</td><td>PMM-150FU</td><td>Do mikromanipulacji</td></tr><tr><td>Zestaw do fuzji komórek kopertowych HVJ GenomONE-CF</td><td>Ishihara sangyo kaisha, Ltd.</td><td>CF001</td><td>Zawierający 0,5 ml roztworu zawiesiny HVJ-E i 10 ml buforu do fuzji komórek do fuzji komórek</td></tr><tr><td>SrCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>193-09442</td><td>Do aktywacji oocytów</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>E8145</td><td>Do aktywacji oocytów</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek Wako</td><td>Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>045-24511</td><td>Do rozpuszczalnika</td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>T1952</td><td>Do inkubacji z zarodkami SCNT</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A5960</td><td>Do inkubacji z zarodkami SCNT</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>M8410</td><td>Do podłoża kryjącego</td></tr></tbody></table>

skojarzone leczenie trichostatyną a i witaminą c poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Transfer jądra komórki somatycznej (SCNT) daje unikalną możliwość bezpośredniego wyprodukowania sklonowanego zwierzęcia z komórki dawcy i wymaga użycia umiejętnych technik. Ponadto wydajność klonowania pozostaje niska od czasu udanej produkcji klonowanych zwierząt, zwłaszcza myszy. Podjęto wiele prób poprawy wydajności klonowania, a trichostatyna A (TSA), inhibitor deacetylazy histonowej, jest szeroko stosowana w celu zwiększenia wydajności klonowania. W tym miejscu przedstawiamy znacznie ulepszoną metodę klonowania u myszy. Ta metoda transferu jądra komórki somatycznej polega na wykorzystaniu hemaglutynującego wirusa otoczki japońskiej (HVJ-E), który umożliwia łatwą manipulację. Co więcej, leczenie przy użyciu dwóch małych cząsteczek, TSA i witaminy C (VC), z dejonizowaną albuminą surowicy bydlęcej (dBSA), jest wysoce skuteczne w rozwoju embrionalnym. Takie podejście nie wymaga ani dodatkowej iniekcji, ani manipulacji genetycznej, a zatem stanowi prostą, odpowiednią metodę do praktycznego zastosowania. Metoda ta może stać się technicznie wykonalnym podejściem dla naukowców do produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt z hodowanych komórek. Co więcej, może to być użyteczny sposób na ratowanie zagrożonych zwierząt poprzez klonowanie.

W celu otrzymania sklonowanych embrionów myszy wykorzystano komórki cumulus oraz zarodkowe fibroblasty. Liczbę zrekonstruowanych oocytów oraz odsetek rozwoju do stadium 2 komórek po aktywacji oocytów przedstawiono w Tabeli 1. we wszystkich warunkach zaobserwowano bardzo wysoką stopę formowania się pronukleusów (89 do 10%) oraz rozwoju do stadium 2 komórek (7 do 89%). Część sklonowanych embrionów, pochodzących z komórek cumulus i rozwiniętych do stadium 2 komórek, przeniesiono do jajowodów pseudrojnych samic. Sześć sklonowanych potomków z 72 przeniesionych embrionów uzyskano od trzech ciężarnych samic po sekwencyjnej obróbce TSA oraz VC (Rysunek 4). Według doniesień, około 15% sklonowanych embrionów rozwija się do pełnego terminu przy zastosowaniu tych procedur SCNT12. Ponadto, transfer sklonowanych embrionów 2-komórkowych w innych ośrodkach pozwolił na uzyskanie od 9 do 15% żywych potomków, co stanowi lepszy wynik rozwoju niż w przypadku pojedynczej obróbki TSA sklonowanych embrionów. Co więcej, obróbka TSA i VC znacząco poprawiła efektywność rozwoju embrionów in vitro do stadium blastocysty (Tabela 2, P &lt;0.05, test t Studenta). Te dane dotyczące rozwoju in vitro dowodzą, że pozytywny efekt TSA i VC nie jest ograniczony ani przez szczepy myszy, ani przez typy komórek. Wyniki te sugerują, że opisana metoda SCNT zwiększa zdolność rozwojową sklonowanych embrionów.
<img alt="Schemat wymiany jonowej: oczyszczanie białek z użyciem BSA, zmiana koloru żywicy wskazuje na zakończenie wymiany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie dBSA. 
Przedstawiono procedury krok po kroku przygotowania roztworu dBSA. Stopień wymiany jonowej można ocenić na podstawie zmiany barwy kulek żywicy. Rysunek w lewym górnym rogu pokazuje rozpuszczanie 1,2 g BSA w 10 ml sterylnej wody w temperaturze pokojowej. Po rozpuszczeniu BSA dodaje się kulki żywicy jonowymiennej (prawy górny róg). Gdy mieszanina roztworu BSA z kulkami żywicy jonowymiennej zmieni kolor z niebiesko-zielonego na złoty (prawy dolny róg), należy wymienić kulki na nowe. Rysunek w lewym dolnym rogu pokazuje, że kulki zachowują niebiesko-zielony kolor, co oznacza zakończenie wymiany jonowej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat zapłodnienia in vitro: ciało polarne, analiza wrzeciona, mikroskopia, badanie rozwoju zarodka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Procedury enukleacji. 
(A) Ilustracja komory do enukleacji. Enukleację oocytów przeprowadza się w medium HCZB z dodatkiem CB. W przypadku systemu napędowego piezo stosuje się kropelkę L-PVP 9% w celu przygotowania szklanej pipety do enukleacji. Kropelki są przykryte olejem mineralnym. (B) Schemat i mikrograf przedstawiają położenie wrzecion i chromosomów przed enukleacją. Czarne groty strzałek: wrzeciona i chromosomy. Czerwone groty strzałek: pierwsze ciałko polarne. (C) Schemat oraz mikrofotografia przedstawiające udaną enukleację. Czarne groty strzałek: wrzeciona i chromosomy. Czerwony grot strzałki: pierwsze ciałko polarne. Niebieski grot strzałki: otwór w strefie przejrzystej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu aktywacji oocytu; PCC, tworzenie się pronukleusów; konfiguracja hodowli komórkowych, etapy harmonogramu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Procedury fuzji komórek i warunki hodowli embrionów SCNT. 
(A) Ilustracja komory do fuzji komórek. Fuzja komórek jest przeprowadzana w medium HCZB zawierającym 6% dBSA. Kropla medium z 9% PVP jest wykorzystywana do przygotowania szklanej pipety do fuzji komórek. Krople są przykryte olejem mineralnym. (B) Schemat i mikrofotografia przedwczesnej kondensacji chromosomów, która wystąpiła godzinę po fuzji komórek (czarna grot). (C) Schemat i mikrograf struktury pronuklearnej uformowanej sześć godzin po aktywacji (czarne groty strzałek). (D) Schemat traktowania embrionów SCNT za pomocą TSA, VC i dBSA. Zielona strzałka oznacza traktowanie TSA, po którym następuje inkubacja z VC (żółta strzałka) w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA (niebieska strzałka). Groty strzałek wskazują czas wymiany pożywki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Etapy rozwoju embrionalnego płodów gryzoni i tkanek łożyska, konfiguracja badań eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Klonowane potomstwo pochodzące z komórek cumulus pobranych bezpośrednio po cięciu cesarskim po 19,5 dniach ciąży. 
W górnym rzędzie znajdują się łożyska. Przedstawione tutaj sklonowane potomstwo zostało otrzymane w jednym eksperymencie z transferem jąder komórkowych od trzech matek zastępczych. Wielkość łożyska była od 1,5 do 2 razy większa od wielkości łożysk wytworzonych przez in vitro zapłodnienie <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Grupa</td>
			<td>Typ komórek dawcy</td>
			<td colspan="2">Linia myszy</td>
			<td>Liczba użytych oocytów</td>
			<td>Liczba połączonych oocytów</td>
			<td>Liczba oocytów wykazujących przedwczesną kondensację chromosomów</td>
			<td>Liczba oocytów wykazujących formowanie się jąder pronuklearnych (%)</td>
			<td>Liczba oocytów z utworzonymi pnudełkami, które uległy rozwojowi 
			do embrionów w stadium 2 komórek (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niepoddany działaniu czynnika</td>
			<td>cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>fibroblast płodowy</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niepoddany działaniu czynnika</td>
			<td>fibroblast płodowy</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wpływ traktowania TSA i VC na in vitro rozwój sklonowanych zarodków myszy do stadium 2 komórek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Grupa</td>
			<td rowspan="2">Typ komórek donora</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Linia myszy</td>
			<td rowspan="2">Liczba użytych embrionów w stadium 2 komórek</td>
			<td colspan="3">Liczba embrionów dwukomórkowych, które rozwinęły się do poszczególnych stadiów (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-komórkowy</td>
			<td>morula</td>
			<td>blastocysta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nieleczony</td>
			<td>cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>fibroblast płodowy</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nieleczone</td>
			<td>fibroblast płodowy</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">a-b, c-d Różne indeksy górne w obrębie tych samych komórek dawcy oznaczają różnice istotne (P &lt; 0.05)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wpływ traktowania TSA i VC na in vitro rozwój klonowanych embrionów myszy do stadium blastocysty.

Opisujemy znacznie ulepszoną metodę klonowania myszy przy użyciu trichostatyny A, witaminy C i dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej. Pokazujemy uproszczony, powtarzalny protokół, który wspiera efektywny rozwój sklonowanych zarodków. W związku z tym ta metoda może stać się standardową procedurą klonowania myszy.

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest poprawa wydajności produkcji zrekonstruowanych zarodków i sklonowanych myszy za pomocą transferu jądra komórki somatycznej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii podstawowej, biologii rozwoju i ratowania zagrożonych zwierząt. Takich jak rozwój embrionalny, programowanie jądrowe i ochrona badań genetycznych.Główną zaletą tej metody i techniki jest to, że możliwe jest generowanie sklonowanych myszy z praktycznym poziomem wydajności za pomocą prostych procedur. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej zgodnie z protokołem tekstowym rozpuścić 1,2 grama BSA w 10 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej. Dodać około 0,12 grama mieszanych kulek żywicy jonowymiennej do roztworu BSA w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.Gdy kulki zmienią kolor z niebiesko-zielonego na złoty, użyj pipety, aby odzyskać roztwór supernatantu, a następnie zastąp kulki nową partią. Po upewnieniu się, że świeże koraliki nie zmieniają koloru, odzyskaj roztwór. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 10,5% wodorowęglanu sodu.Za pomocą filtra 0,45 mikrona wysterylizuj supernatant, a następnie oznacz go jako roztwór podstawowy DBSA i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu eutanazji na samicach myszy poddanych superowulacji zgodnie z protokołem tekstowym, zastosowano standardowe techniki preparacyjne w celu nacięcia brzucha w celu uzyskania dostępu do dróg rodnych. Za pomocą małych prostych nożyczek i pęsety usuń jajowody i przenieś je na arkusz bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć krew z powierzchni.Następnie ustaw jajowody w oleju mineralnym, a następnie za pomocą igieł preparacyjnych pokrój bańkę jajowodu i przenieś kompleksy oocytów wzgórka pochodzące z bańki do 200 mikrolitrowych kropli pożywki HCZB z 0,1% hialuronidazą. Inkubuj tkankę na płytce rozgrzewającej przez pięć minut. Pod mikroskopem stereoskopowym upewnij się, że komórki wzgórka są uwalniane z kompleksów oocytów wzgórka, a następnie przenieś oocyty drugiego etapu mejotycznego lub metafazy M2 z niektórymi pozostałymi komórkami wzgórka do pożywki MKSOM zawierającej 0,3% DBSA.Umyj oocyty w stadium M2 cztery razy, pipetując w górę iw dół w pożywce, aby odłączyć pozostałe komórki wzgórka. Następnie inkubuj oocyty w pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla aż do enukleacji. Aby wyizolować ogołocone oocyty z kompleksów oocytów wzgórka, pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu pipety przenieść niewielką liczbę pozostałych komórek wzgórka rozproszonego z kompleksów oocytów wzgórka do pożywki HCZB z 6% DBSA.Umieść wzgórki na płycie grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do transferu jądra komórki somatycznej lub SCNT. Po przygotowaniu pożywki PVP i roztworów podstawowych CB zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć wysterylizowanej pipety z 20 mikrolitrami pożywki HCZB zawierającej pięć mikrogramów na mililitr CB do przemycia oocytów w stadium M2. Po pięciokrotnym powtórzeniu płukania inkubować oocyty w roztworze enukleacyjnym na płytce grzewczej przez 10 minut.Następnie należy przygotować komorę enukleacyjną, a następnie za pomocą pipety przenieść oocyty M2 do komory. Dodaj cztery mikrolitry roztworu enukleacji i przykryj komorę olejem mineralnym. Pod mikroskopem w temperaturze pokojowej zidentyfikuj wrzeciona i chromosomy oocytu w stadium M2.Następnie za pomocą pipety podtrzymującej i mikropipety zorientuj oocyt z wyraźnym pierwszym ciałem biegunowym, tak aby wrzeciono i chromosom znajdowały się w pozycji 3:00 lub 9:00. Ustaw intensywność impulsu paizo na trzy do sześciu i za pomocą pipety mikromanipulacyjnej wywierć do osłonki przejrzystej i otwórz w niej otwór. Następnie przy minimalnej ilości cytoplazmy całkowicie wyłuszczyć wrzeciona i chromosomy.W świetle widzialnym potwierdź brak chromosomów w cytoplazmie, a następnie za pomocą pożywki MKSOM zawierającej 0,3% DBSA pozbawionej CB dokładnie umyj wyłuszczone oocyty. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do fuzji komórek. Aby przygotować HBJE, dodaj 260 mikrolitrów lodowatego roztworu zawiesiny HBJE do liofilizowanego HVJ-E i pipetuj w górę iw dół, aż do całkowitego zawieszenia.Przygotuj pięć mikrolitrowych porcji roztworu i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu fuzji komórek. Aby przeprowadzić fuzję komórek, użyj 20 mikrolitrów buforu fuzji komórek, aby rozcieńczyć pięć mikrolitrów roztworu HVJ-E. Rozcieńczony roztwór HBJE umieścić na lodzie do czasu użycia.Po przygotowaniu komory do fuzji komórek, jak pokazano tutaj, za pomocą pipety przenieś wyłuszczone oocyty na pożywkę HCZB w komorze. Dodaj cztery mikrolitry każdego roztworu, jak pokazano, i użyj około jednego mililitra oleju mineralnego do przykrycia komory. Umieść komorę z wyłuszczonymi oocytami w temperaturze pokojowej pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu.Następnie za pomocą pipety do mikromanipulacji przenieś komórki dawcy do roztworu zawiesiny HVJ-E. Odessaj komórki wzgórka jedna po drugiej, aby równomiernie oddzielić je od siebie, umożliwiając szeregową fuzję komórek. Następnie za pomocą pipety podtrzymującej utrzymuj wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB i użyj impulsu paizo z pipetą do mikromanipulacji, aby nawiercić osłonkę przejrzystą.Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej, należy odpipetować komórkę wzgórka z około pięciokrotną objętością roztworu HVJ-E i wydalić go szczelnie do błony oocytów bez przechodzenia przez błonę. Po manipulacji fuzją komórek należy niezwłocznie przenieść oocyty na pożywkę MKSOM zawierającą 0,3% DBSA i przenieść je do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na godzinę. Etapy przygotowania należy wykonać w ciągu 10 minut od umieszczenia wyłuszczonych oocytów w pożywce HCVB pod mikroskopem do zwrócenia ich do inkubatora.Po fuzji komórek, pod mikroskopem przy 400-krotnym powiększeniu, sprawdź, czy w zrekonstruowanych oocytach nie doszło do przedwczesnej kondensacji chromosomów. Przenieś zrekonstruowane oocyty na pożywkę aktywacyjną zawierającą trichostatynę A lub TSA i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w powietrzu przez sześć godzin. Obserwuj tworzenie się przedjądrzy w zarodkach SENT, a następnie zastosuj jeszcze dwie godziny leczenia TSA w pożywce MKSOM z 0,3% TBSA.Kurację witaminą C należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym. Jak widać w tej tabeli, leczenie TSA i witaminą C na oocytach sklonowanych myszy wykazało bardzo wysokie tempo tworzenia się jądra i rozwinęło się do stadium dwukomórkowego w każdych warunkach. Niektóre sklonowane zarodki, które pochodziły z komórek wzgórka i rozwinęły się do stadium dwukomórkowego, przeniesiono do jajowodów samic w rzekomej ciąży.Rysunek ten przedstawia sześcioro sklonowanych potomków, które rozwinęły się z 72 przeniesionych zarodków wytworzonych przez trzy ciężarne samice w wyniku seryjnego leczenia TSA i witaminą C. Wreszcie, jak wykazano tutaj, leczenie TSA i VC znacznie poprawiło efektywność rozwoju embrionalnego in vitro do stadium blastocysty. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że wszystkie niezbędne podłoża i odczynniki są przygotowane z wyprzedzeniem. Sam zabieg oraz proste do wykonania i dobrze przygotowane materiały zapewnią osiągnięcie oczekiwanych efektów.Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak produkować zrekonstruowane oocyty.

combinational-treatment-trichostatin-vitamin-c-improves-efficiency

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Protokół ten przedstawia prostą technikę mikroaspiracji izolującą żywotne komórki somatyczne (SC) z krioprezerwacji nasienia koń. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, ta technika unika długotrwałych hodowli in vitro i pozwala na natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu komórek somatycznych.

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

Poznaj ulepszoną metodę klonowania myszy z wykorzystaniem trichostatyny A i witaminy C w celu zwiększenia skuteczności rozwoju zarodków. Protokół ten standaryzuje proces transferu jądra komórki somatycznej w badaniach biologii rozwoju.

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej (Wideo) | JoVE Journal

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

Przeglądaj więcej filmów