Name: Zoptymalizowany protokół Evans Blue do oceny przecieku naczyniowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Naucz się oceny przecieku naczyniowego u myszy metodą barwnika Evans Blue. Protokół obejmuje cewnikowanie żyły szyjnej i pomiar ekstrawazacji osocza w tkankach. Technika jest powtarzalna i można ją dostosować do różnych gatunków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Andy'emu Poczobuttowi i Dr. Jori Leszczyńskiemu za ich cenną pomoc i zmiany w tym manuskrypcie.  Wspierane przez granty otrzymane od Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 i RO3 HL095439) oraz Departamentu ds. Weteranów (Przegląd Zasług).

Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i/lub instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt (myszy) były przestrzegane w eksperymentach opisanych w tym manuskrypcie.
Ta metoda wykorzystuje dorosłe myszy FVBN w wieku 16 - 20 tygodni, które okazały się optymalne dla celów tego badania. Dzień 1 obejmuje kroki od 1 do 5, a Dzień 2 obejmuje kroki od 6 do 7 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Zapewnić odpowiedni zapas sterylnych, jednorazowych strzykawek i igieł, jeśli ketamina/ksylazyna jest stosowana jako środek znieczulający (zgodnie z zaleceniami). Jeśli izofluran jest stosowany jako środek znieczulający, przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić butlę z tlenem i poziom płynu izofluranu, aby upewnić się, że są odpowiednie zapasy do eksperymentu. Zmontuj również obwody oddechowe nosa i przymocuj je do skrzynki indukcyjnej; Podłącz nowe kanistry z węglem drzewnym do obwodów oddechowych. Przygotuj skrzynkę indukcyjną, włączając tlen i upewniając się, że drugi stopień odczytuje około 50 psi.</li>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą do 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj sondę temperatury doodbytnicy do operacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
Ten krok obejmuje znieczulenie, depilację i pozycjonowanie (dorosłe myszy FVBN w wieku 16 - 20 tygodni).
<ol>
	<li>Zważ myszy i zapisz wagi.</li>
	<li>Znieczulij myszy.
	<ol>
		<li>Podawać ketaminę i ksylazynę IP (odpowiednio 80 - 100 mg/kg i 7,5 - 16 mg/kg). Zaleca się jednak rozpoczęcie od niższych dawek ketaminy i ksylazyny (odpowiednio około 30 mg/kg i 6 mg/kg).</li>
		<li>Utrzymuj znieczulenie z około 0,1 - 0,25 razem początkowymi dawkami ketaminy/ksylazyny przez cały czas trwania operacji. Ketamina i ksylazyna były środkami znieczulającymi z wyboru w tym konkretnym badaniu, ponieważ zaobserwowano większą odtwarzalność i przeżywalność. Może się okazać, że środki znieczulające z wyboru w innych badaniach są różne. Jeśli stosowany jest izofluran, należy umieścić mysz w komorze indukcyjnej i włączać izofluran do 5%, aż mysz straci pełną świadomość. Następnie przez pozostałą część zabiegu należy stosować nos nosowy z 1,5 - 2,5% izofluranem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj myszy co 2-3 minuty przez uszczypnięcie palca, aby sprawdzić, czy znieczulenie jest odpowiednie.</li>
	<li>Ogol brzuszną część szyi myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na podgrzanej podkładce. Przymocuj łapy i stopy myszy do powierzchni chirurgicznej za pomocą taśmy.</li>
	<li>Umieść sztuczną maść łzową na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.</li>
</ol>
3. Szczegóły chirurgiczne
<ol>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie w prawej szyi brzusznej nad żyłą szyjną.</li>
	<li>Nałóż jedną lub dwie krople lidokainy (1 - 2%) w miejsce nacięcia w celu złagodzenia bólu i rozszerzenia naczyń krwionośnych. Odczekaj 2 minuty, aż lidokaina zacznie działać. </li>
	<li>Odsłoń i odizoluj prawą żyłę szyjną wewnętrzną poprzez rozwarstwienie. Zwiąż żyłę szwem 4-0 i delikatnie cofnij rostralny koniec naczynia za pomocą hemostatu. Wytnij otwór za pomocą cienkich nożyczek, około 3 mm poniżej lub doogonowo do krawata, mniej więcej w połowie średnicy żyły.</li>
	<li>Oznacz cewnik poliwinylowy PV-1 w odległości 1,5 cm od końca i wprowadź go do żyły szyjnej przez otwór za pomocą rozszerzacza naczyń i przekręć cewnik w kierunku ogonowego końca naczynia, około 1,5 cm.</li>
	<li>Zawiąż cewnik bezpiecznie w ogonowej części naczynia (poniżej nacięcia) jedwabiem 4-0. Przywiązać rostralną część naczynia na zewnątrz cewnika luźnymi końcami szwu, który został użyty do zawiązania żyły szyjnej rostralnej, w kroku 3.3.</li>
	<li>Luźno sklej skórę wokół cewnika za pomocą jedwabiu 4-0, aby zapobiec utracie ciepła ciała i wysuszeniu tkanek.</li>
	<li>Podłączyć cewnik do strzykawki zawierającej heparynizowaną sól fizjologiczną (10 j./ml) i przepłukać cewnik.</li>
</ol>
4. Zastrzyki
<ol>
	<li>Wstrzyknąć niebieski roztwór Evansa (50 μl roztworu o stężeniu 30 mg/ml w 0,9% normalnej, nieheparynizowanej soli fizjologicznej lub około 50 mg/kg) do cewnika do żyły szyjnej, a następnie niewielką objętość heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej w celu przepłukania linii.</li>
	<li>2 minuty później wstrzyknąć substancję P (100 μL 0,3 μM roztworu w 0,9% normalnej, nieheparynizowanej soli fizjologicznej lub 1 nmol/kg), a następnie niewielką objętość heparynizowanego soli fizjologicznej, aby przepłukać linię. Substancja P zwiększa wynaczynienie białek osocza przez warstwę śródbłonka; W tym protokole rutynowo indukuje zwiększenie wartości wynaczynienia osocza około 1,5-krotnie, dzięki czemu wartości wynaczynienia osocza są łatwiejsze do zmierzenia.</li>
	<li>Należy odczekać 18 minut po wstrzyknięciu substancji P. W tym czasie niebieski barwnik Evansa będzie się równoważył i krążył.</li>
	<li>Zakończ eksperyment 18 minut po wstrzyknięciu substancji P (20 minut po wstrzyknięciu niebieskiego Evansa), poświęcając mysz ze zwichnięciem szyjki macicy. Jest prawdopodobne, że mysz może zostać bezpośrednio zwichnięta w szyjce macicy, bez uprzedniego przedawkowania środka znieczulającego, ponieważ mysz jest prawdopodobnie nadal dobrze znieczulona po operacji. Jeśli jednak jest to konieczne, można przedawkować środki znieczulające ketaminę/ksylazynę, izofluran lub pentobarbital, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.</li>
</ol>
5. Izolacja narządów
<ol>
	<li>Rozciąć klatkę piersiową myszy i perfuzję grawitacyjną (z wysokości około 51 cm lub 20") serca i naczyń krwionośnych za pomocą 50 ml 50 mM cytrynianu sodu, pH 3,5. pH 3,5 przypuszczalnie zachowuje wiązanie błękitu Evansa z albuminą.</li>
	<li>Za pomocą skalpela preparacyjnego należy wyciąć od 1 do 5 odpowiednich narządów (tkanek) (np. pęcherz moczowy, nerki, żołądek, wątroba, trzustka, proksymalna lub dalsza część okrężnicy, jelito kręte, dwunastnica, skóra boku, uszy, ogona, serca i/lub płuc) i usunąć wszelką pozostałą zawartość, jeśli jest obecna.</li>
	<li>Opłucz narządy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami o temperaturze pokojowej (RT) (PBS; 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g NaCl i 0,20 g KCl w 1 l, pH 7,4).</li>
	<li>Osusz narządy tkanką, przetnij każdy narząd na pół i zważ każdą połówkę (mokrą masę, w g).</li>
	<li>Suszyć połowę chusteczki w suszarce w temperaturze 150 °C, na folii, przez 48 godzin.</li>
	<li>Umieść drugą połówkę tkanki w stałej objętości (do 200 μl) formamidu w probówce do mikrofuge na 48 godzin (i do 72 godzin), aby wyekstrahować błękit Evansa.</li>
</ol>
6. Pomiar OD tkanki
<ol>
	<li>Usunąć 50 μl formamidu Evansa z dodatkiem błękitu (po 48 - 72 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej) z probówki do mikrofuge i umieścić w jednym dołku 96-dołkowej płytki polistyrenowej. Należy uważać, aby nie przenieść kawałków tkanki wraz z formamidem.</li>
	<li>Umieścić 50 μl nowego, czystego formamidu w każdym z dwóch pustych dołków 96-dołkowej płytki dla ślepych prób.</li>
	<li>Zmierzyć i zapisać OD620 każdej studzienki 96-dołkowej płytki na czytniku płytek absorbancyjnych. 620 nm to maksymalna absorbancja błękitu Evansa.</li>
</ol>
7. Obliczanie wynaczynienia plazmy
<ol>
	<li>Zważyć połowę suchej chusteczki, która znajdowała się w piecu przez 48 godzin.</li>
	<li>Obliczyć stosunek mokrej masy do suchej masy dla konkretnego narządu będącego przedmiotem zainteresowania z każdej myszy z osobna, zaczynając od mokrej masy tej połowy tkanki (uzyskanej w kroku 5.4), podzielonej przez suchą masę tej samej połowy tkanki (uzyskanej w kroku 7.1).</li>
	<li>Obliczyć suchą masę (w g) połowy tkanki w formamidzie, dzieląc mokrą masę połowy tkanki przed umieszczeniem jej w formamidzie (otrzymaną w kroku 5.4) przez stosunek wilgotności mokrej do suchej masy dla określonego narządu będącego przedmiotem zainteresowania (obliczony w kroku 7.2).</li>
	<li>Oblicz skorygowane wartości OD620. Zaczynając od wartości OD620 z każdej studzienki doświadczalnej 96-dołkowej płytki (zawierającej formamid niebieskiego barwnika Evansa z każdej tkanki, otrzymanej w kroku 6.3), odjąć wartość OD620 w studzience ślepej (średnia wartość OD620 z dwóch studzienek zawierających czysty formamid, przygotowana w kroku 6.2, wartości OD620 uzyskane w kroku 6.3) od każdej wartości doświadczalnej.</li>
	<li>Obliczyć wartość wynaczynienia osocza, dzieląc skorygowaną wartość OD620 (obliczoną w kroku 7.4) przez suchą masę połowy tkanki w formamidzie (obliczoną w kroku 7.3). Jednostkami wynaczynienia osocza będą OD620/g suchej masy.</li>
	<li>Przeanalizuj dane i wyraź je jako średnią ± SEM. Statystycznie porównaj grupy za pomocą testu t lub jednoczynnikowej analizy wariancji i testu wielokrotnego porównania Scheffégo (lycofs01.lycoming.edu), w zależności od przypadku.</li>
</ol>

<ol><li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li>
<li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li>
<li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062(2013).</li>
<li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li>
<li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).</li>
<li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li>
<li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li>
<li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+fluorescence%3A+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li>
<li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li>
<li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760(2012).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+dysbalance+in+pathology%3A+the+neprilysin+%28NEP%29+and+angiotensin-converting+enzyme+%28ACE%29+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li>
<li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).</li>
<li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li>
<li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li>
<li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li>
<li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Int%22%5BJournal%5D)">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li>
<li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li>
<li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li>
<li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).</li>
<li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak omówiono powyżej, badanie wynaczynienia osocza może ostatecznie doprowadzić do nowej wiedzy na temat przyczyn lub nowych sposobów hamowania lub leczenia wynaczynienia osocza. Skuteczne zastosowanie protokołu wynaczynienia osocza (powyżej), przy użyciu niebieskiego barwnika Evansa, zostało zademonstrowane w obecnym manuskrypcie. Chociaż dane potwierdziły hipotezę, że NEP może chronić naczynia krwionośne przed wynaczynieniem osocza, jest to obecnie cel drugorzędny, a głównym celem jest przedstawienie zoptymalizowanego ...

Przeciek naczyniowy w narządach odnosi się do wynaczynienia, czyli wycieku osocza krwi przez szczeliny powstałe w śródbłonku żyłek naczyń włosowatych w narządach. To wynaczynienie osocza lub zwiększona przepuszczalność naczyń, która może wynikać z pewnego rodzaju reakcji zapalnej, może mieć poważne konsekwencje. Dlatego ważne jest, aby to zjawisko, jego przyczyny, modulatory i konsekwencje były badane i rozumiane, a także, aby badacze mieli dobre narzędzia i protokoły, za pomocą których mogą je badać. Luki śródbłonka mogą być wytwarzane przez szereg bodźców, ale zwykle są wytwarzane przez działanie neuroprzekaźników peptydowych i/lub tachykinin na śródbłonek. Jednym z głównych naturalnie występujących mediatorów tego procesu, który skutkuje zwiększonym wynaczynieniem osocza, jest undecapeptid neuropeptyd tachykininy, substancja P1.
Metody badania i pomiaru przepuszczalności naczyń krwionośnych lub wynaczynienia osocza, które wykorzystują właściwości wiążące albuminę niebieskiego barwnika Evansa, zostały opracowane i są zazwyczaj znane ze swojej dokładności, prostoty, oszczędności, bezpieczeństwa i zdolności do umożliwienia określenia wynaczynienia osocza z kilku tkanek jednocześnie, jeśli jest to pożądane2,3,4,5,6,7,8,9. Ten niebieski protokół Evansa do oceny wynaczynienia osocza w narządach myszy FVBN wykorzystuje wszystkie te elementy, ale dodaje kilka ważnych modyfikacji, które sprawiają, że jest ogólnie użyteczny i można go dostosować do przyszłych badań, z udziałem przeciętnego laboratorium, które prowadzi lub będzie prowadzić ważne badania czynników związanych z wynaczynieniem osocza lub przepuszczalnością naczyń. W tym protokole substancja P jest wprowadzana do myszy w dawce 1 nmol/kg, co zwiększa wynaczynienie osocza 1,5-krotnie. Zwiększa to czułość protokołu, co skutkuje łatwiejszymi do zaobserwowania i uzyskaniem wyników. Inne czynniki wpływające na przepuszczalność, takie jak różne inne peptydy, chemikalia lub niektóre formy toksycznych urazów, mogą być stosowane lub badane przez inne laboratoria, zgodnie z potrzebami. Iniekcje do żył szyjnych są stosowane w tym protokole w celu ogólnoustrojowego wprowadzenia błękitu Evansa i substancji P, co wymaga nieuleczalnej operacji. Jednak iniekcje do żyły szyjnej 5,7,10, nawet po rozważeniu niezbędnych technik chirurgicznych terminala, są łatwiejsze do opanowania i prowadzą do uzyskania bardziej spójnych wyników niż inne iniekcje dożylne, w tym iniekcje do żyły ogonowej4,9. Chociaż możliwe jest, że błękit Evansa zostanie dostarczony przez zastrzyki do zatoki żylnej zaoczodołowej, nie znaleziono żadnych odniesień w literaturze, które wykorzystują tę metodę dostarczania błękitu Evansa. Jednak jeśli chodzi o iniekcje do żył ogonowych, wysoki stopień wiedzy specjalistycznej i praktyki w powtarzalnym opanowaniu tej techniki znacznie ogranicza jej zastosowanie w przypadku udanych zastrzyków z niebieskiego Evansa. Natomiast alternatywna metoda iniekcji do żyły szyjnej, opisana w naszym protokole, oferuje technicznie osiągalne rozwiązanie. Kluczowa procedura perfuzji żył myszy, wykonywana tuż po poświęceniu myszy Evansa z niebieską perfuzją, usuwa nadmiar niebieskiego barwnika Evansa i została ustandaryzowana w tym protokole. Opisane wcześniej metody perfuzji zostały dokładnie zbadane i zmodyfikowane w celu uzyskania niniejszej procedury. Inne opisane tutaj modyfikacje są zoptymalizowane, proste i niedrogie.
Istnieją pewne istotne ograniczenia metody niebieskiego barwnika Evansa. Na przykład, niska czułość, czasami związana z tą metodą, może zapobiec dodatkowym poważnym badaniom patologicznym i histologicznym tkanek pochodzących od zwierząt, którym wstrzyknięto niebieski barwnik Evansa. Jednak te i inne ograniczenia doprowadziły do opracowania alternatywnych metod i modeli, które mimo to nadal wykorzystują błękit Evansa. Pomiar błękitu Evansa za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej (a nie spektroskopii w zakresie widzialnym) może zwiększyć czułość metody. Dodatkowo, mikroskopia fluorescencyjna tkanek zabarwionych na niebiesko Evansa została opracowana, aby umożliwić obserwację przecieku naczyniowego w bardziej wyraźnych lokalizacjach11. Ponadto, obrazowanie całego ciała i skanowanie żywego zwierzęcia, któremu wcześniej wstrzyknięto szczepionkę Evans blue12, pozwala na badanie stężeń błękitu Evansa w sposób ciągły, a nie w jednym konkretnie wybranym punkcie czasowym eksperymentu. Metoda ta wymaga jednak dostępności odpowiednich urządzeń do obrazowania i może być bardzo kosztowna. Opisano również modyfikacje z udziałem błękitu Evansa i przeprowadzone w modelu typu in vitro, takim jak hodowla komórkowa lub model kosmówkowo-omoczniowy piskląt13 (CAM). Modele te są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i intravital14 i pozwalają na ilościowe określenie zmian przepuszczalności naczyń w czasie, ale mogą rodzić pytania dotyczące dokładnego modelowania warunków in vivo, a także mogą być kosztowne.
Opracowano inne metody określania i ilościowego określania przecieku naczyniowego lub przepuszczalności, które nie wymagają podawania błękitu Evansa. Metody te mogą wykorzystywać odpowiednią cząsteczkę fluorescencyjną (taką jak albumina lub fluoresceina) lub izotopowo znakowaną lub w inny sposób znakowaną cząsteczkę u żywych zwierząt (lub do hodowli komórkowych lub modeli kosmówkowo-omoczniowych (CAM)13, a następnie obrazowanie nieinwazyjne (skanowanie PET, rezonans magnetyczny, mikroskopia przyżyciowa, skanowanie całego ciała) lub obrazowanie inwazyjne (mikroskopia fluorescencyjna)3,12,15. Chociaż techniki te mogą oferować szereg zalet w porównaniu z innymi niebieskimi metodami Evansa, mają również wady, które mogą obejmować ich znaczną złożoność, wymaganą wiedzę, zasoby i wysokie koszty pieniężne.
Neprilysin16 (enzym peptydazy NEP, znany również jako CD10, MME lub Enkefalinaza) jest prawdopodobnie zaangażowany w hamowanie wynaczynienia osocza, przynajmniej częściowo, poprzez metabolizm enzymatyczny i inaktywację endogennej substancji P. Tak więc w tkankach, w których występuje peptydaza powierzchniowa komórki NEP, może wystąpić osłabienie działania substancji P, przypuszczalnie przez aktywność peptydazy NEP.
Początkowo testowaliśmy na wynaczynienie plazmy wywołane substancją P, używając tego zmodyfikowanego niebieskiego protokołu Evansa, z myszami FVBN typu dzikiego (WT) i NEP knockout (KO). Na podstawie tych wstępnych badań podejrzewano udział NEP w wynaczynieniu osocza wspomaganym substancją P, a my opisujemy te i dalsze eksperymenty dotyczące roli NEP w wynaczynieniu osocza. Jednak ten manuskrypt nie skupia się na NEP ani jego roli w wynaczynieniu osocza, ale raczej na samych eksperymentach z wynaczynieniem plazmy. Wyniki NEP są reprezentatywne dla rodzaju wyników, które można uzyskać przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu. Niebieska metoda Evansa do pomiaru wynaczynienia osocza została zoptymalizowana i zmodyfikowana, jak szczegółowo opisano poniżej dla myszy FVBN.

<table><tbody><tr><td>izofluran</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>wziewny środek znieczulający</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>iniekcyjne strzykawki znieczulające</td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>(10,3 i 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>igieł (20G1,23G1 i 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>komora indukcyjna izofluranu</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 litrowe</td></tr><tr><td>obwody oddechowe nosa&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Kontroler obwodu gryzoni 2</td></tr><tr><td>zbiornik tlenu</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medyczna</td></tr><tr><td>poduszka grzewcza</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>regulator temperatury</td></tr><tr><td>sonda temperatury doodbytnicy</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>waga myszy</td></tr><tr><td>(dla gryzoni)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-00</td><td>Vannas Nożyczki sprężynowe Ostrze proste 3 mm (naczynia do cięcia)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11151-10</td><td>Bardzo cienkie kleszcze Graefe (izolowanie naczyń myszy)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-hemostatyki</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>13009-12</td><td>Hemostatyki komarów Halsteada (wypreparowanie, trzymanie tkanki)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne -sterowniki do szwów</td><td>Narzędzia do nauki</td> o sztuce <td>12502-12</td><td>Sterowniki do szwów Olsen-Hegar (szycie)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Grzywna Narzędzia naukowe</td><td>11627-12</td><td>Kleszcze aligatora Adson-Brown (chwytanie tkanek, szycie, szczur)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14110-15</td><td>Nożyczki Mayo do cięcia twardego 15 cm (chirurgia, preparacja, kości, szczur)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>18025-10</td><td>kleszcze do wiązania szwów (używane do cewnikowania Millar)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>14078-10</td><td>Nożyczki Lexer Baby proste (chirurgia, mysz)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11254-20</td><td>Kleszcze Dumont #5 z cienką końcówką (naczynia szczurów, rozwarstwienie)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-nożyczki</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>14082-09</td><td>Nożyczki do dyspreparowania 12 mm (chirurgia, mysz szczura)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>pięknej 11051-10</td><td>10 cm Kleszcze Graefe (chwytanie tkanek, mysz szczura)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>11251-35</td><td>Kleszcze Dumont 5/45 (wprowadzacz do naczyń)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-zwijacze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>17012-11</td><td>Retraktory Weitlaner 2/3 zęba (chirurgiczne dla szczurów)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11294-00</td><td>Kleszcze Dumont #4 (szczury do izolacji naczyń, myszy)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Grzywna Narzędzia naukowe</td><td>11297-00</td><td>Kleszcze Dumont #7 (chwytanie tkanek, preparowanie)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14058-11</td><td>twarde nożyczki do tęczówki (preparacja myszy, kości)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>11009-13</td><td>ząbkowane, zakrzywione kleszcze Semkena (chwytanie tkanek, szczur myszy)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-hemostatyki</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>13003-10</td><td>Zakrzywione hemostatyki Hartmana (wycięcie, przytrzymanie tkanki)</td></tr><tr><td>narzędzia chirurgiczne-kleszcze</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>11006-12</td><td>Kleszcze ząbkowane Adson (chwytanie tkanek)</td></tr><tr><td>maszynki do strzyżenia</td><td>Taśma Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>sztuczna maść łzowa</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidokaina</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td></td></tr><tr><td>Cewniki poliwinylowe</td> 2% do wstrzykiwań <td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substancja P</td><td>Bachem&nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparyna</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>roztwór soli</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0,9% chlorek sodu</td></tr><tr><td>fenobarbital&nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki do bibułowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>mikrowaga</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>rurki do mikrofug</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polistyren 96-dołkowa płytka</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>płytka absorbancyjna czytnik</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>żele poliakryloamidowe</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>wzorzec masy cząsteczkowej białka</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza na nośniku Protran</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>żel</td><td>pudełko Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Fisher Naukowe</td> pierwszorzędowe przeciwciało poliklonalne <td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>NEP&nbsp;</td><td>R & D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doksycyklina chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Myszy typu dzikiego FVB / NJ</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne (koza anty-królik)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ECL-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół evans blue do oceny przecieku naczyniowego u myszy

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Wyciek naczyniowy, czyli wynaczynienie osocza, ma wiele przyczyn i może być poważną konsekwencją lub objawem reakcji zapalnej. Badanie to może ostatecznie doprowadzić do nowej wiedzy na temat przyczyn lub nowych sposobów hamowania lub leczenia wynaczynienia osocza. Ważne jest, aby naukowcy dysponowali odpowiednimi narzędziami, w tym najlepszymi dostępnymi metodami, do badania wynaczynienia osocza. W tym artykule opisujemy protokół, wykorzystujący metodę niebieskiego barwnika Evansa, do oceny wynaczynienia osocza w narządach myszy FVBN. Protokół ten jest celowo prosty, w jak największym stopniu, ale zapewnia wysoką jakość danych. Niebieski barwnik Evans został wybrany przede wszystkim dlatego, że jest łatwy w użyciu dla przeciętnego laboratorium. Wykorzystaliśmy ten protokół, aby dostarczyć dowodów i poprzeć hipotezę, że enzym neprylizyna może chronić naczynia krwionośne przed wynaczynieniem osocza. Jednak protokół ten może być eksperymentalnie stosowany i łatwo dostosowany do stosowania u innych szczepów myszy lub u innych gatunków, w wielu różnych narządach lub tkankach, do badań, które mogą obejmować inne czynniki, które są ważne w zrozumieniu, zapobieganiu lub leczeniu wynaczynienia osocza. Protokół ten został znacznie zoptymalizowany i zmodyfikowany w stosunku do istniejących protokołów i łączy w sobie niezawodność, łatwość użycia, oszczędność oraz ogólną dostępność materiałów i sprzętu, dzięki czemu protokół ten jest lepszy dla przeciętnego laboratorium do ilościowego określania wynaczynienia osocza z narządów.

Na Rysunku 1 przedstawiono schemat procedury, która zapewnia najbardziej wiarygodne i spójne wartości przesączania osocza indukowanego substancją P w organach myszy FVBN. Procedura ta zazwyczaj zajmuje dwa dni pracy, przedzielone co najmniej 48 h czasu oczekiwania. Jest możliwe dalsze rozciągnięcie tego procesu w czasie, pod warunkiem, że będzie on prowadzony w ten sam sposób dla wszystkich porównywanych eksperymentów. Na przykład po wyizolowaniu organów w dn...

W tym artykule opisany jest ekonomiczny, zoptymalizowany i prosty protokół, który wykorzystuje metodę niebieskiego barwnika Evansa do oceny wynaczynienia osocza w organach myszy FVBN, które mogą być przystosowane do użycia w innych szczepach, gatunkach i innych narządach lub tkankach.

Zoptymalizowany protokół Evans Blue do oceny przecieku naczyniowego u myszy

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Ogólnym celem tego protokołu jest ocena i względna ocena ilościowa wynaczynienia lub wycieku osocza w narządach myszy lub innych małych gatunków zwierząt przy użyciu zmodyfikowanej metody Evans Blue Dye. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naczyń krwionośnych, takie jak: Jakie czynniki endogenne lub egzogenne modyfikują wynaczynienie osocza u określonego gatunku lub narządu będącego przedmiotem zainteresowania? Główną zaletą tej techniki jest to, że chociaż cewnikowanie wymaga umiarkowanego stopnia kompetencji chirurgicznych, metoda zapewnia trwały dostęp żylny i jest powtarzalna od myszy do myszy.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą zmagać się z niewielkimi trudnościami chirurgicznymi związanymi z umieszczeniem cewnika. Po zważeniu dorosłej myszy FVB NJ w wieku od 16 do 20 tygodni potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u nóg i ogol brzuszną część szyi zwierzęcia. Umieść mysz w pozycji leżącej na rozgrzanej podkładce i przyklej wszystkie cztery łapy do powierzchni operacyjnej.Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w prawej brzusznej szyi nad żyłą szyjną. Nałóż jedną lub dwie krople 1-2% lidokainy na obszar nacięcia w celu złagodzenia bólu i rozszerzenia naczyń krwionośnych.Odizoluj prawą żyłę szyjną wewnętrzną poprzez rozwarstwienie. Zwiąż żyłę szwem 4-0 i użyj hemostatu, aby delikatnie cofnąć rostralny koniec naczynia. Za pomocą cienkich nożyczek wytnij otwór około trzech milimetrów ogonowo do szwu i mniej więcej w połowie średnicy żyły.Następnie włóż cewnik poliwinylowy PV1 do żyły szyjnej przez otwór i przewlecz cewnik na około 1,5 centymetra w kierunku ogonowego końca naczynia. Użyj nowego szwu 4-0, aby bezpiecznie zawiązać cewnik w części ogonowej naczynia i przywiąż rostralną część naczynia na zewnątrz cewnika za pomocą luźnych końców szwu pierwotnie używanego do wiązania żyły szyjnej rostralnej. Luźno skleić skórę wokół cewnika za pomocą kolejnego elementu szwu 4-0, aby zapobiec odwodnieniu, utracie ciepła ciała i wysuszeniu tkanek.Następnie podłącz cewnik do strzykawki zawierającej heparynizowaną sól fizjologiczną i przepłucz cewnik roztworem soli fizjologicznej. Aby ocenić wynaczynienie i wyciek z narządu będącego przedmiotem zainteresowania, najpierw wstrzyknij 50 mikrolitrów roztworu Evans Blue do cewnika do żyły szyjnej, a następnie niewielką objętość heparynizowanego soli fizjologicznej, aby przepłukać linię. Dwie minuty później wstrzyknij 100 mikrolitrów substancji P do cewnika, a następnie wykonaj drugie płukanie heparynizowaną solą fizjologiczną.Osiemnaście minut po wstrzyknięciu substancji P otwórz klatkę piersiową zwierzęcia i grawitacyjnie przeprowadź perfuzję serca i naczyń krwionośnych za pomocą 50 mililitrów 50-milimolowego roztworu cytrynianu sodu, aby usunąć nadmiar błękitu Evansa z naczyń krwionośnych. Pobrać narządy i tkanki będące przedmiotem zainteresowania i w razie potrzeby usunąć resztki zawartości z każdej tkanki. Opłucz narządy w temperaturze pokojowej PBS, osusz narządy chusteczką laboratoryjną i przetnij każdy narząd na pół.Na wadze unieść mokre masy każdego narządu i wysuszyć 1/2 każdego narządu na kawałku folii w suszarce w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie umieść drugą połowę każdego narządu w objętości do 200 mikrolitrów formamidu w probówce do mikrofuge na 48 do 72 godzin w celu ekstrakcji Evans Blue Dye. Myszy z nokautem neprylizyny wykazują zwiększone wynaczynienie osocza z pęcherza moczowego wywołane substancją P w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego, co sugeruje rolę neprylizyny w negatywnej regulacji wynaczynienia osocza indukowanego substancją P z pęcherza.Leczenie doksycykliną myszy transgenicznych w celu nadekspresji neprylizyny przez jeden tydzień w celu aktywacji nadekspresji neprylizyny wskazuje na dodatkową rolę tego enzymu w wynaczynieniu dwunastnicy, ponieważ zwierzęta transgeniczne leczone doksycykliną wykazują znacznie zmniejszone wynaczynienie osocza z dwunastnicy wywołane substancją P w porównaniu ze wszystkimi trzema grupami zwierząt, czego nie obserwuje się po leczeniu doksycykliną zwierząt typu dzikiego lub nokautowego. Po opanowaniu etapy cewnikowania, wstrzykiwania i izolacji narządu można zakończyć w ciągu 45 do 55 minut, jeśli są wykonywane prawidłowo. Odczekaj dodatkowe dwa do trzech dni na pozostałą część protokołu.Kiedy po raz pierwszy uczysz się tej techniki, ważne jest, aby powtórzyć procedurę na co najmniej 10-20 zwierzętach treningowych przed wykonaniem eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić i względnie określić ilościowo wynaczynienie lub wyciek osocza w narządach myszy lub innych małych gatunków zwierząt przy użyciu tej zmodyfikowanej metody Evans Blue Dye.

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.

Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Naucz się oceny przecieku naczyniowego u myszy metodą barwnika Evans Blue. Protokół obejmuje cewnikowanie żyły szyjnej i pomiar ekstrawazacji osocza w tkankach. Technika jest powtarzalna i można ją dostosować do różnych gatunków.

Zoptymalizowany protokół Evans Blue do oceny przecieku naczyniowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów