Name: Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności naczyń mózgowych u myszy przy użyciu znaczników fluorescencyjnych. Ta technika umożliwia ilościową analizę uszkodzenia bariery krew-mózg w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować konsorcjum Sphingonet finansowanemu przez fundację Leduq za wsparcie tej pracy. Prace te były również wspierane przez Collaborative Research Center "Vascular differentiation and remodeling" (CRC/ Transregio23, Project C1) oraz przez 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc Programme GO-IN, dofinansowanie nr 291776. Podziękowania należą się również Kathleen Sommer za jej pomoc techniczną w zakresie obsługi myszy i genotypowania.

Wszystkie zwierzęta były traktowane z najwyższą ostrożnością, minimalizując ból i dyskomfort podczas zabiegu. Procedura ta jest zgodna z wytycznymi naszej instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami i została zatwierdzona przez lokalną komisję (Regierungspraesidium Darmstadt, numer zatwierdzenia FK/1044).
Schemat etapów pracy do badania przepuszczalności in vivo na myszach jest pokazany w Rysunek 1. Szczegóły każdego kroku są opisane poniżej.
1. Obchodzenie się ze zwierzętami
<ol>
	<li>Przygotowanie i podawanie leków znacznikowych i znieczulających
	<ol>
		<li>Przygotuj oznakowane probówki i formy do zatopienia tkanek co najmniej dzień przed testem przepuszczalności. Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania protokołu, pracując pod czystym wyciągiem i używając narzędzi oczyszczonych 80% etanolem. Użyj samców lub samic myszy CD1 typu dzikiego (WT) lub angiopoetyny-2 (Ang-2) ze wzmocnieniem funkcji (GOF) w dojrzałej dorosłej grupie wiekowej 3-6 miesięcy dla obecnego protokołu. Wykonaj genotypowanie myszy zgodnie z wcześniejszym opisem 10. 
		Uwaga: 80% alkoholu nie spowoduje sterylności narzędzi, ale zminimalizuje zanieczyszczenie przygotowanych próbek.</li>
		<li>Rozcieńczyć wszystkie substancje śladowe w sterylnym PBS do 2 mM zapasów i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C chronione przed światłem.</li>
		<li>Wybierz znaczniki, takie jak (tetrametylodamina) TMR i (izotiocyjanian fluoresceiny) FITC z wyraźnymi widmami wzbudzenia/emisji i które można utrwalić lizyną, co skutkuje minimalną interferencją między barwnikami zarówno za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (przy użyciu odpowiednio filtra TMR lub FITC), jak i za pomocą fluorometrii w czytniku płytek do testu przepuszczalności. 
UWAGA: Dekstran TMR 3 kD i dekstran FITC 3 kD użyte w badaniu są utrwalalne lizyną, a zatem mogą być również stosowane do analizy immunohistochemicznej po utrwaleniu aldehydami w celu zbadania różnic regionalnych.</li>
		<li>Ze wszystkimi zwierzętami należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki instytucjonalnej. Wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 100 μl roztworu znacznikowego, który można zwiększyć do 200 μl, gdy dodatkowy znacznik jest łączony przy użyciu 100 μl każdego znacznika w mieszance 1:110,13. Wstrzyknąć co najmniej jednemu zwierzęciu sam PBS zamiast znaczników, aby służyły jako pozorowana kontrola odejmowania tła autofluorescencji.</li>
		<li>5 minut po wstrzyknięciu znacznika znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dożylnym ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg i 5-10 mg w 0,9% soli fizjologicznej na kg masy ciała, 150 μl koktajlu na 25 g myszy). 
		UWAGA: Maść weterynaryjna nie została nałożona na oczy podczas zabiegu, ponieważ okres między znieczuleniem zwierzęcia a perfuzją/ofiarą był krótki (10 minut), podczas którego nie obserwowano wysuszenia oczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie krwi i perfuzja serca
	<ol>
		<li>Przygotować zwierzęta do perfuzji serca 10 minut po podaniu środka znieczulającego. Sprawdź brak reakcji drgania łapy, aby upewnić się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.</li>
		<li>Połóż zwierzęta na plecach i nałóż 80 % etanolu na skórę brzucha. Za pomocą małych nożyczek otwórz ścianę brzucha małym nacięciem (2 cm) tuż pod klatką piersiową. Oddziel wątrobę od przepony, a następnie powoli przetnij przeponę, odsłaniając jamę opłucnowej 15.</li>
		<li>Przeciąć klatkę piersiową obustronnie i przymocować przecięty mostek w celu odsłonięcia lewej komory. Włóż igłę motylkową o rozmiarze 21 połączonych z perfuzyjnym systemem perfuzyjnym w tylnej części lewej komory.</li>
		<li>Nakłuć prawy przedsionek i szybko (w ciągu 10 s) zebrać 200-300 μl krwi uwolnionej do jamy klatki piersiowej za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml (z odciętym końcem) w probówkach do pobierania surowicy i przechowywać na lodzie. 
		Uwaga: Ta procedura perfuzji nie jest możliwa do przeżycia.</li>
		<li>Jak tylko krew zostanie pobrana, włącz system perfuzyjny (10-12 obr./min, 5 ml/min) i wytrzymuj zwierzę przez 3 minuty ciepłym (RT) 1x PBS (wolnym od jonów Ca2+/Mg2+). 
		UWAGA: PBS zawierający jony Ca2 + / Mg2 + można wykorzystać do lepszej aktywności serca podczas perfuzji. Całkowita ilość PBS użytego do perfuzji mieści się w zakresie 15-20 ml.</li>
		<li>Oceń jakość perfuzji, zwracając uwagę na kolor wątroby, nerek, które po perfuzji wydają się białe/blade. 
		UWAGA: Perfuzja nerek lub wątroby niekoniecznie wskazuje na perfuzję mózgu, ponieważ tętnice (szyjne/kręgowe) docierające do mózgu z aorty mogą ulec pęknięciu podczas przygotowania w kroku 3, szczególnie podczas nakłucia przedsionków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Pobieranie i przechowywanie organów
	<ol>
		<li>Pod koniec perfuzji potwierdź śmierć zwierzęcia przez zwichnięcie szyjki macicy i zbierz mózg i nerki. Sprawdź perfuzję mózgu na podstawie koloru mózgów (brak widocznej krwi w naczyniach opon mózgowych), aby wykluczyć zwierzęta z analizy przepuszczalności, gdy jakość perfuzji nie jest dobra. Podziel mózg na 2 półmózgi za pomocą skalpela (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
		<li>Wyciąć skalpelem jedną półmózgowisko wolną od płatów węchowych i móżdżku i przenieść hemicerebrum do probówki o pojemności 2 ml. Przechowuj półmóżdżek w dodatkowej tubce, jeśli jest to wymagane do oceny przepuszczalności móżdżku.</li>
		<li>Przenieś pojedynczą nerkę do innej probówki o pojemności 2 ml. Próbki należy natychmiast przechowywać na suchym lodzie.</li>
		<li>Osadź natywnie pozostałą nerkę i półmózg (obejmującą móżdżek i płaty węchowe) w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na suchym lodzie.</li>
		<li>Na koniec odwirować próbki krwi przechowywane na lodzie w probówkach do pobierania surowicy w temperaturze 10 000 g, 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty surowicy do probówek o pojemności 1,5 ml i umieścić je w pojemniku z suchym lodem.</li>
		<li>Wszystkie próbki pobrane z suchego lodu przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. 
		UWAGA: Ważne jest, aby zamrozić próbki przed przystąpieniem do etapów homogenizacji, ponieważ wydajność homogenizacji wzrasta po rozmrożeniu przez zamrożenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja i wirowanie
	<ol>
		<li>Rozmrozić na lodzie próbki półmózgowe i nerkowe zamrożone w temperaturze -80 °C i zważyć probówki zawierające narządy. Od tych wag odejmij średnią wartość kilku pustych probówek (około 20), aby uzyskać masę tkanki. Dodać 300 μL i 200 μL zimnego 1X PBS do probówek zawierających odpowiednio nerki i połowicze mózg. 
		UWAGA: W przypadku mniejszych ilości tkanek (takich jak półmóżdżek, poniżej 100 mg) zaleca się ważenie pojedynczych probówek.</li>
		<li>Homogenizować każdą próbkę w oryginalnej probówce eppendorfa za pomocą tłuczka z politetrafluoroetylenu (PTFE) przymocowanego do elektrycznego mieszadła górnego (1 000 obr./min), wykonując około 15 ruchów (1 suw = 1 w górę i 1 w dół). Opłucz tłuczek z PBS między próbkami i wytrzyj do sucha przed przejściem do następnej próbki. 
		UWAGA: Unikano stosowania detergentów podczas homogenizacji ze względu na potencjalną interferencję z fluorometrią. Jednak w tym protokole wykrywany jest również znacznik wewnątrzkomórkowy, ponieważ tkanka jest dokładnie homogenizowana, co jest bardziej wydajne po jednej rundzie rozmrażania przez zamrożenie.</li>
		<li>Przechowywać homogenizowane próbki na lodzie chronionym przed światłem i na końcu odwirować wszystkie razem w temperaturze 15 000 g, 20 minut, 4 °C w wirówce stołowej. Przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml na lodzie w celu natychmiastowej fluorometrii lub w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar fluorescencji i kwantyfikacja
	<ol>
		<li>W przypadku zamrożenia na końcu poprzedniego etapu, rozmrozić na lodzie próbki supernatantu tkankowego i surowicy przechowywane w temperaturze -80 °C, chroniąc je folią przed światłem.</li>
		<li>Odpipetować 50 μl rozcieńczonej surowicy (30 μl, 1x PBS + 20 μl surowicy) lub supernatanty tkankowe (w stanie, w jakim są) na czarną płytkę 384-dołkową. Włączyć co najmniej jedną próbkę od zwierzęcia pochodzącego od zwierzęcia pozorowanego do supernatantów surowicy i tkanek w celu zapewnienia właściwego odejmowania tła, ponieważ to jednorodne tło tkankowe jest zwykle wyższe niż tło PBS stosowanego jako rozcieńczalnik. 
		UWAGA: Do autofluorescencji można wykorzystać średnio 3 zwierzęta pozorowane, chociaż zaobserwowano bardzo małą zmienność w pozorowanych wartościach autofluorescencji (dane nie pokazane). Ilość użytej surowicy można zmniejszyć, rozcieńczając ją PBS, co może również zwiększyć stosunek sygnału do szumu dla próbek o niskiej fluorescencji, takich jak próbki mózgu. Badano do 10 μl surowicy, rozcieńczając ją 40 μl PBS. Upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków.</li>
		<li>Włóż czarną płytkę 384-dołkową do czytnika płytek i otwórz nowy skrypt wybierający pomiar fluorescencji.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie na optymalne i użyj wartości wzbudzenia/emisji (nm) 550/580 lub 490/520 odpowiednio dla barwnika TMR lub FITC i rozpocznij pomiar w celu uzyskania surowych jednostek fluorescencji (RFU).</li>
		<li>Użyj surowych jednostek fluorescencji (RFU) z czytnika płytek, aby obliczyć wskaźnik przepuszczalności (PI) po odjęciu odpowiednich wartości pozornych.
		<ol>
			<li>*Wskaźnik przepuszczalności (ml/g) =(RFU tkanki/g masy tkanki)/(RFU surowicy/mL surowicy)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przykładowe obliczenie wskaźnika przepuszczalności mózgu (PI) zwierzęcego GOF1 (tabela 1):
		<ol>
			<li>Mózgowe RFU GOF1 - Mózgowe RFU SHAM = 154 - 22,5 = 131,5</li>
			<li>RFU surowicy GOF1 - RFU surowicy SHAM = 38305 - 27 = 38278</li>
			<li>Masa mózgu (g) = 0,195</li>
			<li>Objętość surowicy (ml) = 0,02</li>
			<li>Wskaźnik przepuszczalności mózgu (10-3 ml / g) = (131,5 / 0,195) / (38278 / 0,02) = 0,352 
			UWAGA: Obliczenia wskaźnika przepuszczalności dają wartości, które są bezwzględne i porównywalne między eksperymentami i typami tkanek. Można je jednak przedstawić jako proporcje dla ułatwienia porównania między 2 grupami 12. Można to osiągnąć, dzieląc PI każdego zwierzęcia w obu grupach przez średnią PI grupy kontrolnej, prowadząc średnią grupy kontrolnej przez 1, zachowując jednak zmienność między zwierzętami w grupie kontrolnej. Ta transformacja zapewnia wartości dla grupy eksperymentalnej (lub grup) względem grupy kontrolnej ustawionej na 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunofluorescencyjna wizualizacja znacznika
	<ol>
		<li>Pociąć bloki nerki/półkrwi mózgu osadzone natywnie w związku tkankowym (O.C.T) (krok 2.1) na odcinki 10 μm na kriostacie ustawionym na -20 °C i przenieść skrawki na szkiełka umieszczone w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu skrawków (około 30 min) przenieś szkiełka do zamrażarki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
		<li>W dniu barwienia rozmrozić szkiełka w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie utrwalić skrawki 4% paraformaladehydem (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie szybko umyć w PBS.</li>
		<li>Inkubować skrawki w buforze permeabilizacyjnym/blokującym wykonanym ze sterylnego PBS zawierającego 1 % BSA i 0,5 % Triton X-100 pH 7,5 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować szkiełka podstawowe przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowym przeciwciałem CD31 (0,5 mg/ml, klon MEC 13,3), rozcieńczonym w stosunku 1:100 w buforze zawierającym sterylny PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2), a następnie trzy 5-minutowe płukanie w PBS.</li>
		<li>Przeprowadzić inkubację przeciwciał wtórnych w powyższym buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z specyficznymi dla gatunku przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie rozcieńczonymi w stosunku 1:500 (2 mg/ml). W przypadku CD31 można użyć koziego środka przeciw szczurom Alexa 568 lub Alexa 488 w rozcieńczeniu 1:500. Włączyć DAPI (300 μM) do drugorzędowej mieszaniny przeciwciał (rozcieńczenie 1:1,000 z podstawy) w celu wybarwienia jąder.</li>
		<li>Zamontuj poplamione sekcje za pomocą aqua polymount i pozostaw na noc do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do obrazowania spektralnego. Analiza obrazów za pomocą oprogramowania NIS Elements (wersja 4.3). Oprogramowanie takie jak Photoshop może być używane do generowania figur montażowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16371949">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26590417">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier%3A+differential+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li>
<li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface%3A+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efflux+of+amyloid-%CE%B2+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li>
<li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li>
<li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li>
<li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li>
<li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li>
<li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+%28FITC%29-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption%3A+Technical+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+stroke+research%22%5BJournal%5D)">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+roles+of+cyclooxygenase%2C+oxidative+stress%2C+neuroinflammation%2C+and+elements+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).</li>
<li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li>
<li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-67899-1_5">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li>
<li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/22/1_Supplement/734.1.short">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li>
<li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li>
<li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li>
<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dysfunkcja bariery krew-mózg wiąże się z wieloma zaburzeniami neurologicznymi, w tym pierwotnymi i wtórnymi guzami mózgu lub udarem. Rozpad bariery krew-mózg jest często związany z zagrażającym życiu obrzękiem OUN. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które wyzwalają otwieranie lub zamykanie bariery krew-mózg, ma zatem znaczenie terapeutyczne w zaburzeniach neurologicznych i jest powszechnie badane przez badaczy. Jednak opisywane w literaturze metody badania przepuszczalności BBB in vivo często wiążą się z tru...

Bariera krew-mózg (BBB) składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego (EC) wspieranych przez blisko powiązane perycyty (PC), które są osłonięte blaszką podstawną, oraz astrocytów (AC), które otaczają błonę podstawną swoimi końcami1,2. EC oddziałują z kilkoma typami komórek, które wspierają i regulują funkcję bariery, głównie AC i PC, a także neuronami i mikroglejem, z których wszystkie razem tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU). NVU ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania bariery krew-mózg, która ogranicza transport toksyn i patogenów przenoszonych przez krew do mózgu. Funkcja ta jest wynikiem cząsteczek o ścisłym połączeniu, takich jak klaudyna-5, okludyna, zonula occludens-1, które są obecne między EC, a także z działania transporterów, takich jak p-glikoproteina (P-gp), które wypływają cząsteczki, które dostają się do śródbłonka z powrotem do naczynia lumen1,2,3. BBB pozwala jednak na transport niezbędnych cząsteczek, takich jak składniki odżywcze (glukoza, żelazo, aminokwasy) przez specyficzne transportery ulegające ekspresji na błonach plazmatycznych EC1,2,3. Warstwa EC jest wysoce spolaryzowana w odniesieniu do rozkładu różnych transporterów między światłem (skierowanym do krwi) a abluminalnym (błony skierowane do mózgu), aby umożliwić specyficzną i wektorową funkcję transportu4,5. Podczas gdy bariera krew-mózg działa ochronnie w odniesieniu do ścisłej regulacji środowiska OUN, jest głównym wyzwaniem dla dostarczania leków do OUN w chorobach takich jak choroba Parkinsona z funkcjonalną barierą krew-mózg. Nawet w chorobach neurologicznych z dysfunkcją bariery krew-mózg nie można zakładać, że dostarczanie leków do mózgu jest zwiększone, zwłaszcza że dysfunkcja bariery może obejmować uszkodzenie określonych celów transporterowych, na przykład jak w chorobie Alzheimera (AD). W chorobie Alzheimera wiadomo, że kilka transporterów beta amyloidu, takich jak LRP1, RAGE, P-gp, jest rozregulowanych, a zatem celowanie w te transportery może być daremne6,7,8. Bariera krew-mózg jest upośledzona w kilku chorobach neurologicznych, takich jak udar mózgu, choroba Alzheimera, zapalenie opon mózgowych, stwardnienie rozsiane oraz nowotwory mózgu9,10,11. Przywrócenie funkcji bariery jest kluczową częścią strategii terapeutycznej, a zatem jej ocena ma kluczowe znaczenie.
W tej pracy opisaliśmy obiektywny i ilościowy protokół badania przepuszczalności u gryzoni, który z powodzeniem zastosowaliśmy do kilku linii myszy, zarówno transgenicznych, jak i eksperymentalnych modeli chorób10,12,13,14. Metoda opiera się na prostym wstrzyknięciu dootrzewnowym znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji myszy w celu usunięcia znaczników z przedziału naczyniowego. Mózg i inne narządy są pobierane po perfuzji i przepuszczalności oceniane za pomocą obiektywnego i bezwzględnego wskaźnika przepuszczalności opartego na pomiarach fluorescencji homogenatów tkankowych w czytniku płytkowym. Wszystkie surowe wartości fluorescencji są korygowane pod kątem tła przy użyciu homogenatów tkankowych lub surowicy od zwierząt pozorowanych, które nie otrzymują żadnego znacznika. Uwzględniono obszerne normalizacje objętości surowicy, fluorescencji surowicy i masy tkanek, uzyskując w ten sposób wskaźnik przepuszczalności, który jest bezwzględny i porównywalny między eksperymentami i typami tkanek. Dla ułatwienia porównania między grupami, wartości bezwzględnego wskaźnika przepuszczalności można łatwo przekształcić w stosunki, tak jak to zrobiliśmy wcześniej12. Równocześnie, przechowywane półmózgowie i nerki mogą być wykorzystane do wizualizacji znacznika za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej10. Klasyczna mikroskopia fluorescencyjna może być cenna w uzyskiwaniu regionalnych różnic w przepuszczalności, choć jest kłopotliwa ze względu na subiektywny dobór skrawków tkanek i obrazów do analizy półilościowej. Szczegółowe kroki przedstawiono w protokole, a w stosownych przypadkach dodano uwagi. Dostarcza to informacji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia testu przepuszczalności in vivo na myszach, który można przeskalować na inne małe zwierzęta. Test może być stosowany do wielu rodzajów znaczników, co pozwala na ocenę przepuszczalności na podstawie ładunku i wielkości poprzez połączenie znaczników o wyraźnych widmach fluorescencyjnych.

<table><tbody><tr><td>Rodamid tetrametylowy (TMR) dekstran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) dekstran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,9% Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek Związek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% roztwór formaldhhehydu</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>przygotować 4% roztwór</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>szczurze przeciwciało anty CD31, klon MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>kozia anty szczur alexa 568 Sondy</td><td>molekularne</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>kozie anty szczury Alexa 488 Sondy</td><td>molekularne</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua</td><td>polymount Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Igła motylkowa o rozmiarze 21 BD</td><td></td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>surowicy probówka</td><td>zbiorcza Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL probówki eppendorf</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne Kimtech chusteczki do chusteczek</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek PTFE</td><td>Elektryczne</td><td></td> mieszadło podwieszane Wheaton 358029 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Obrazowanie spektralne konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td></td> System perfuzji perystaltycznej Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do mikrowirówek</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Bariera krew-mózg (BBB) to wyspecjalizowana bariera, która chroni mikrośrodowisko mózgu przed toksynami i patogenami w krążeniu oraz utrzymuje homeostazę mózgu. Głównymi miejscami bariery są komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, których funkcja barierowa wynika ze ścisłych połączeń międzykomórkowych i transporterów wypływu wyrażających się na błonie plazmatycznej. Funkcja ta jest regulowana przez perycyty i astrocyty, które razem tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU). Kilka chorób neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera (AD), guzy mózgu, wiąże się z upośledzoną funkcją BBB. Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg ma zatem kluczowe znaczenie dla oceny ciężkości choroby neurologicznej i powodzenia zastosowanych strategii leczenia.
Prezentujemy tutaj prosty, ale solidny test przepuszczalności, który został z powodzeniem zastosowany do kilku modeli myszy, zarówno genetycznych, jak i eksperymentalnych. Metoda jest wysoce ilościowa i obiektywna w porównaniu z powszechnie stosowaną analizą fluorescencji znacznikowej za pomocą mikroskopii. W tej metodzie myszom wstrzykuje się dootrzewnowo mieszaninę wodnych obojętnych znaczników fluorescencyjnych, a następnie znieczula myszy. Perfuzja serca zwierząt jest wykonywana przed pobraniem mózgu, nerek lub innych narządów. Narządy są homogenizowane i odwirowywane, a następnie mierzone jest fluorescencje z supernatantu. Krew pobrana z wkłucia serca tuż przed perfuzją służy do normalizacji do przedziału naczyniowego. Fluorescencja tkanek jest normalizowana do mokrej masy i fluorescencji surowicy w celu uzyskania ilościowego wskaźnika przepuszczalności znacznika. Dla dodatkowego potwierdzenia, kontralateralna półmózg zachowana do celów immunohistochemicznych może być wykorzystana do celów wizualizacji fluorescencji znacznikowej.

Wcześniej wykazaliśmy, że myszy z wzmocnioną funkcją (gain-of-function, GOF) angiopoetyny-2 (Ang-2) wykazują wyższą przepuszczalność naczyń mózgowych niż myszy kontrolne w warunkach prawidłowych10. Wykazano również, że u myszy z indukowanym udarem myszy GOF miały większe obszary zawału oraz większą przepuszczalność niż kontrolne rodzeństwo z jednego miotu. Wyniki te wskazują na kluczową rolę Ang-2 w przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB). Niniejszy protokół wyko...

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu u myszy przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie znaczników w celu oceny dysfunkcji bariery krew-mózg w modelach zwierzęcych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bariery krew-mózg dotyczące przepuszczalności nerwowo-naczyniowej w chorobach i jej powrotu do zdrowia po terapii. Główną zaletą tej metody jest to, że jest prosta i ilościowa.Daje to możliwość jednoczesnej oceny przepuszczalności za pomocą fluorometrii, która jest ilościowa, a także mikroskopii fluorescencyjnej dla obrony regionalnej. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnozę i terapię kilku zaburzeń neurologicznych, w tym guzów mózgu, udaru mózgu i choroby Alzheimera, ponieważ choroby te są związane z zagrażającym życiu obrzękiem mózgu i poprawą funkcji BBD jako kluczowym celem terapeutycznym. Częścią procedury będzie pani Jadranka Macas, specjalistka ds. technologii naukowej w instytucie.Dootrzewnowo wstrzyknąć myszom 100 mikrolitrów dwumilimolowego roztworu znacznikowego. Wybierz znaczniki utrwalone lizyną, takie jak dextrans znakowany FITC i TMR z wyraźnymi widmami emisji wzbudzenia, aby zminimalizować interferencję między barwnikami. W przypadku łączenia znaczników należy wstrzyknąć dootrzewnowo 200 mikrolitrów połączonego roztworu znacznikowego.Uwzględnij wstrzyknięcia tylko nośnika, aby służyły jako pozorowane kontrole odejmowania tła autofluorescencji. Po każdym wstrzyknięciu należy odczekać pięć minut przed głębokim znieczuleniem myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi. Przygotuj zwierzęta do perfuzji serca 10 minut po podaniu środka znieczulającego.Sprawdź brak reakcji drgania łapy, aby upewnić się, że mysz osiągnęła chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Połóż mysz do perfuzji na plecach i nałóż 80% etanol na skórę brzucha. Po użyciu małych nożyczek do wykonania dwucentymetrowego nacięcia w ścianie brzucha, oddziel wątrobę od przepony, a następnie powoli przetnij przeponę, odsłaniając mnogą jamę.Przetnij klatkę piersiową obustronnie i przymocuj przecięty mostek, aby odsłonić lewą komorę. Włóż igłę motylkową o rozmiarze 21 połączonych z perfuzyjnym systemem perfuzyjnym w tylnej części lewej komory. Nakłuj prawy przedsionek, a następnie użyj jednomililitrowej końcówki pipety z odciętym końcem, aby szybko zebrać od 200 do 300 mikrolitrów uwolnionej krwi i przenieść do probówki do pobierania surowicy.Pobraną krew należy przechowywać na lodzie. Jak tylko krew zostanie pobrana, włącz system perfuzyjny i perfuzjuj zwierzę przez trzy minuty za pomocą PBS o temperaturze pokojowej wolnej od jonów wapnia i magnezu. Oceń jakość perfuzji, zwracając uwagę na kolor wątroby i nerek, które po perfuzji wydają się blade.Po pobraniu mózgu sprawdź, czy w naczyniach opon mózgowych nie jest widoczna krew. Próbka powinna być wyłączona z analizy przepuszczalności, jeżeli jakość perfuzji jest niska. Użyj skalpela, aby rozdzielić mózg na dwie półmózgi.Następnie wypreparuj móżdżek i płat węchowy z jednej półmózgowia i przenieś półmózg do dwumililitrowej rurki. Umieść jedną pobraną nerkę w innej dwumililitrowej probówce. Natychmiast umieścić próbki na suchym lodzie.Naturalnie osadź pozostałą nerkę i półmózg z nienaruszonymi płatami móżdżku i węchu w związku o optymalnej temperaturze cięcia TissueTech i umieść go na suchym lodzie. Na koniec, po odwirowaniu próbek krwi w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieś supernatanty surowicy do 1,5-mililitrowych probówek i umieść je w pojemniku na suchy lód. Przenieś próbki do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, ponieważ wydajność homogenizacji wzrasta po zamrożeniu i rozmrożeniu.Umieść próbki półmózgowia i nerek na lodzie do rozmrożenia, a następnie zważ probówki zawierające narządy. Od tych mas odejmij średnią wartość około 20 pustych probówek, aby uzyskać masę tkanki. Dodać 300 mikrolitrów zimnego PBS do probówki zawierającej nerki i 200 mikrolitrów do probówek zawierających półmózg.Homogenizować każdą próbkę w oryginalnej probówce do mikrofuge za pomocą tłuczka PTFE przymocowanego do elektrycznego mieszadła górnego, wykonując około 15 uderzeń. Homogenizowane próbki należy przechowywać na lodzie, chronić przed światłem. Opłucz tłuczek z PBS między próbkami i wytrzyj do sucha przed przejściem do następnej próbki.Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, odwirować przez 20 minut w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek na lodzie przed przystąpieniem do pomiaru fluorescencji i kwantyfikacji. Przenieść supernatant na płytkę 384-dołkową i włożyć płytkę do czytnika fluorescencji.Upewnij się, że dla znacznika uwzględniono odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji i ustaw wzmocnienie na Optymalne. Rozpocznij pomiar i wyeksportuj dane jako arkusz kalkulacyjny, aby wykonać obliczenia zgodnie z opisem w protokole. W dniu barwienia rozmrażaj 10-mikronowe skrawki kriostatu zamontowane na szkiełkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie utrwal skrawki 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie szybko umyj w PBS. Przepuszczalność i blokowanie niespecyficznego wiązania w skrawkach poprzez inkubację w sterylnym PBS zawierającym 1% PSA i 0,5% Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu inkubować szkiełka z rozcieńczeniem pierwszorzędowym CD31 w proporcji 1 do 100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.Po trzykrotnym przemyciu PBS przez pięć minut każde, przeprowadzić inkubację przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z specyficznymi dla gatunku przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Zamontuj poplamione sekcje za pomocą Aqua-Poly/Mount i pozostaw na noc do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec uzyskaj obrazy za pomocą systemu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do obrazowania spektralnego.W celu ustalenia czasu cyrkulacji znacznika dla testu przepuszczalności, długi czas krążenia wynoszący dwie godziny porównuje się z krótkim czasem krążenia wynoszącym 15 minut po wstrzyknięciu znacznika. Dłuższy czas krążenia wynoszący dwie godziny prowadzi do małej ilości znaczników w nerkach w porównaniu z krótkim 15-minutowym czasem krążenia, potencjalnie z powodu wysokiego klirensu dekstranu FITC pokazanego na zielono z przedziału naczyniowego. Efekt ten jest jeszcze bardziej dramatyczny w mózgu ze względu na ścisłą barierę krew-mózg.Zabarwienie CD31 widoczne w kanale czerwonym potwierdziło obecność naczyń w nerce w obu badanych punktach czasowych oraz w mózgu. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin na 10 myszach przy jednoczesnej współpracy dwóch naukowców. Próbując tej techniki, należy pamiętać o użyciu znaczników o odpowiedniej masie cząsteczkowej, wykresie i charakterystyce fluorescencji, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące przepuszczalności bariery krew-mózg.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia BBD i wypełnianie czynników choroby, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak nasilenie i lokalizacja miejsca choroby.

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film demonstruje procedurę oceny przerwania bariery krew-mózg w mysim modelu EAE. Barwniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach są wstrzykiwane po ortopie i krążą w naczyniach krwionośnych mózgu. Mniejszy barwnik przecieka przez szczeliny do tkanki mózgowej, podczas gdy większy barwnik dostaje się tylko wtedy, gdy zakłócenie jest poważne, co koreluje z zakresem uszkodzenia bariery.

Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Opisano i zweryfikowano metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg opartej na wspólnej hodowli komórek mikronaczyniowych śródbłonka i astrocytów mózgu szczura. System ten okazał się przydatnym narzędziem do badania wpływu nanoformulacji na przenikanie przez barierę cząsteczek fluorescencyjnych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

W tym badaniu prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny uszkodzenia bariery krew-mózg w stanach neurodegeneracyjnych. Aby osiągnąć nasz cel, wstrzyknęliśmy albuminę o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowanej (FITC) do żyły szyjnej myszy i oceniliśmy jej wyciek do miąższu mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Protokół ten przedstawia wiarygodną metodę oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) w modelu dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu oceny Evana opartej na niebieskim barwniku, umożliwiając zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zaburzeń nerwowo-naczyniowych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę oceny przepuszczalności naczyń mózgowych u myszy przy użyciu znaczników fluorescencyjnych. Ta technika umożliwia ilościową analizę uszkodzenia bariery krew-mózg w chorobach neurologicznych.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Przeglądaj więcej filmów