Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Ogólnym celem tej procedury jest ocena przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu u myszy przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie znaczników w celu oceny dysfunkcji bariery krew-mózg w modelach zwierzęcych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bariery krew-mózg dotyczące przepuszczalności nerwowo-naczyniowej w chorobach i jej powrotu do zdrowia po terapii. Główną zaletą tej metody jest to, że jest prosta i ilościowa.

Daje to możliwość jednoczesnej oceny przepuszczalności za pomocą fluorometrii, która jest ilościowa, a także mikroskopii fluorescencyjnej dla obrony regionalnej. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnozę i terapię kilku zaburzeń neurologicznych, w tym guzów mózgu, udaru mózgu i choroby Alzheimera, ponieważ choroby te są związane z zagrażającym życiu obrzękiem mózgu i poprawą funkcji BBD jako kluczowym celem terapeutycznym. Częścią procedury będzie pani Jadranka Macas, specjalistka ds. technologii naukowej w instytucie.

Dootrzewnowo wstrzyknąć myszom 100 mikrolitrów dwumilimolowego roztworu znacznikowego. Wybierz znaczniki utrwalone lizyną, takie jak dextrans znakowany FITC i TMR z wyraźnymi widmami emisji wzbudzenia, aby zminimalizować interferencję między barwnikami. W przypadku łączenia znaczników należy wstrzyknąć dootrzewnowo 200 mikrolitrów połączonego roztworu znacznikowego.

Uwzględnij wstrzyknięcia tylko nośnika, aby służyły jako pozorowane kontrole odejmowania tła autofluorescencji. Po każdym wstrzyknięciu należy odczekać pięć minut przed głębokim znieczuleniem myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi. Przygotuj zwierzęta do perfuzji serca 10 minut po podaniu środka znieczulającego.

Sprawdź brak reakcji drgania łapy, aby upewnić się, że mysz osiągnęła chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Połóż mysz do perfuzji na plecach i nałóż 80% etanol na skórę brzucha. Po użyciu małych nożyczek do wykonania dwucentymetrowego nacięcia w ścianie brzucha, oddziel wątrobę od przepony, a następnie powoli przetnij przeponę, odsłaniając mnogą jamę.

Przetnij klatkę piersiową obustronnie i przymocuj przecięty mostek, aby odsłonić lewą komorę. Włóż igłę motylkową o rozmiarze 21 połączonych z perfuzyjnym systemem perfuzyjnym w tylnej części lewej komory. Nakłuj prawy przedsionek, a następnie użyj jednomililitrowej końcówki pipety z odciętym końcem, aby szybko zebrać od 200 do 300 mikrolitrów uwolnionej krwi i przenieść do probówki do pobierania surowicy.

Pobraną krew należy przechowywać na lodzie. Jak tylko krew zostanie pobrana, włącz system perfuzyjny i perfuzjuj zwierzę przez trzy minuty za pomocą PBS o temperaturze pokojowej wolnej od jonów wapnia i magnezu. Oceń jakość perfuzji, zwracając uwagę na kolor wątroby i nerek, które po perfuzji wydają się blade.

Po pobraniu mózgu sprawdź, czy w naczyniach opon mózgowych nie jest widoczna krew. Próbka powinna być wyłączona z analizy przepuszczalności, jeżeli jakość perfuzji jest niska. Użyj skalpela, aby rozdzielić mózg na dwie półmózgi.

Następnie wypreparuj móżdżek i płat węchowy z jednej półmózgowia i przenieś półmózg do dwumililitrowej rurki. Umieść jedną pobraną nerkę w innej dwumililitrowej probówce. Natychmiast umieścić próbki na suchym lodzie.

Naturalnie osadź pozostałą nerkę i półmózg z nienaruszonymi płatami móżdżku i węchu w związku o optymalnej temperaturze cięcia TissueTech i umieść go na suchym lodzie. Na koniec, po odwirowaniu próbek krwi w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieś supernatanty surowicy do 1,5-mililitrowych probówek i umieść je w pojemniku na suchy lód. Przenieś próbki do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, ponieważ wydajność homogenizacji wzrasta po zamrożeniu i rozmrożeniu.

Umieść próbki półmózgowia i nerek na lodzie do rozmrożenia, a następnie zważ probówki zawierające narządy. Od tych mas odejmij średnią wartość około 20 pustych probówek, aby uzyskać masę tkanki. Dodać 300 mikrolitrów zimnego PBS do probówki zawierającej nerki i 200 mikrolitrów do probówek zawierających półmózg

Homogenizować każdą próbkę w oryginalnej probówce do mikrofuge za pomocą tłuczka PTFE przymocowanego do elektrycznego mieszadła górnego, wykonując około 15 uderzeń. Homogenizowane próbki należy przechowywać na lodzie, chronić przed światłem. Opłucz tłuczek z PBS między próbkami i wytrzyj do sucha przed przejściem do następnej próbki.

Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, odwirować przez 20 minut w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek na lodzie przed przystąpieniem do pomiaru fluorescencji i kwantyfikacji. Przenieść supernatant na płytkę 384-dołkową i włożyć płytkę do czytnika fluorescencji.

Upewnij się, że dla znacznika uwzględniono odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji i ustaw wzmocnienie na Optymalne. Rozpocznij pomiar i wyeksportuj dane jako arkusz kalkulacyjny, aby wykonać obliczenia zgodnie z opisem w protokole. W dniu barwienia rozmrażaj 10-mikronowe skrawki kriostatu zamontowane na szkiełkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie utrwal skrawki 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie szybko umyj w PBS. Przepuszczalność i blokowanie niespecyficznego wiązania w skrawkach poprzez inkubację w sterylnym PBS zawierającym 1% PSA i 0,5% Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu inkubować szkiełka z rozcieńczeniem pierwszorzędowym CD31 w proporcji 1 do 100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.

Po trzykrotnym przemyciu PBS przez pięć minut każde, przeprowadzić inkubację przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z specyficznymi dla gatunku przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Zamontuj poplamione sekcje za pomocą Aqua-Poly/Mount i pozostaw na noc do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec uzyskaj obrazy za pomocą systemu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do obrazowania spektralnego.

W celu ustalenia czasu cyrkulacji znacznika dla testu przepuszczalności, długi czas krążenia wynoszący dwie godziny porównuje się z krótkim czasem krążenia wynoszącym 15 minut po wstrzyknięciu znacznika. Dłuższy czas krążenia wynoszący dwie godziny prowadzi do małej ilości znaczników w nerkach w porównaniu z krótkim 15-minutowym czasem krążenia, potencjalnie z powodu wysokiego klirensu dekstranu FITC pokazanego na zielono z przedziału naczyniowego. Efekt ten jest jeszcze bardziej dramatyczny w mózgu ze względu na ścisłą barierę krew-mózg.

Zabarwienie CD31 widoczne w kanale czerwonym potwierdziło obecność naczyń w nerce w obu badanych punktach czasowych oraz w mózgu. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin na 10 myszach przy jednoczesnej współpracy dwóch naukowców. Próbując tej techniki, należy pamiętać o użyciu znaczników o odpowiedniej masie cząsteczkowej, wykresie i charakterystyce fluorescencji, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące przepuszczalności bariery krew-mózg.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia BBD i wypełnianie czynników choroby, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak nasilenie i lokalizacja miejsca choroby.