Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

Ponieważ organoidy podsumowują natywną organizację strukturalną, a także wiele cech molekularnych nabłonka jelitowego in vivo, technika ta pozwala nam badać normalną biologię i stany chorobowe w laboratorium. Główną zaletą tej techniki jest możliwość genetycznego modyfikowania organoidów przy użyciu bardzo wydajnego podejścia do transdukcji o niskiej cytotoksyczności, co pozwala na badania funkcjonalne tych genetycznie zmanipulowanych organoidów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii chorób jelit, ponieważ możemy wystawić organoidy jelitowe na działanie leków i innych środków lub interwencji.

Metoda ta może być stosowana do badania procesów rozwojowych i patologicznych w innych układach podatnych na hodowle organoidów, takich jak tkanki piersi lub komórki rosnące w standardowych warunkach 2D. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, odniosą sukces z transdukcją w trudnych do zaprojektowania organoidach lub innych komórkach. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy napotkaliśmy trudności z transdukcją naszych organoidów i komórek macierzystych.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ może dojść do utraty struktury organoidów, jeśli próbki nie zostaną odpowiednio poddane obróbce podczas procesu osadzania w matrycy podstawowej w celu kriosekcji. Aby wyhodować organoidy do transdukcji wirusa, należy wysiać hodowle komórek organoidowych z 200 mikrolitrami pożywki transdukcyjnej na dołek na 48-dołkowej płytce i inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych. Rozmrozić fiolki z wirusem do transdukcji, pozwalając na około 50 mikrolitrów skoncentrowanego wirusa do transdukcji każdego dołka w 48-dołkowych płytkach.

W 1,5-mililitrowej probówce wymieszaj wirusa z 12 mikrolitrami roztworu nanocząstek magnetycznych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach dodaj roztwór nanocząstek magnetycznych i mieszaninę wirusa do komórek, które mają być transdukowane. Umieścić 48-dołkową płytkę na płytce magnetycznej i inkubować w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej dwie godziny.

Po zakończeniu transfekcji wirusa przenieś zakażone klastry komórek organoidowych i pożywkę transdukcyjną z każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować 500 razy g przez pięć minut. Odrzucić sklarowany osad przez delikatne odsysanie i schłodzić probówki zawierające osad na lodzie przez pięć minut.

Dodaj 120 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej do każdej probówki i ponownie zawieś granulki, powoli pipetując w górę iw dół. Wysiewaj 30-mikrolitrowe krople mieszaniny matrycy i komórek do nowej 48-dołkowej płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 15 minut, aż matryca zastygnie.

Dodaj pożywkę transdukcyjną do każdej studzienki i inkubuj w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych przez trzy do czterech dni. Po trzech do czterech dniach sprawdź kultury pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby zapewnić organizację klastrów komórek w struktury organoidowe. Delikatnie zastąp pożywkę transdukcyjną w każdym dołku 250 mikrolitrami pożywki ENR do hodowli organoidów.

Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Rozpocznij tę procedurę od usunięcia podłoża ENR przez delikatne odsysanie, uważając, aby nie zakłócić macierzy błony podstawnej. Delikatnie umyć 500 mikrolitrami PBS.

Napraw organoidy, dodając jeden mikrolitr 4% roztworu paraformaldehydu na studzienkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po 30 minutach usunąć roztwór paraformaldehydu przez odsysanie. Delikatnie dodaj jeden mikrolitr PBS na studzienkę, a następnie usuń PBS przez delikatne odsysanie.

W ten sposób umyj dwukrotnie PBS. Usunąć PBS z drugiego płukania i dodać jeden mikrolitr 30% buforu sacharozy do każdej próbki. Inkubować utrwalone organoidy w sacharozie przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu odwodnienia próbek.

Usunąć bufor sacharozy przez odsysanie i dodać tylko tyle związku zatapiającego, aby pokryć warstwę matrycy w każdym dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść próbki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 10 minut lub do momentu, gdy masa do zatapiania stanie się stała i biała.

Umieść płytkę z zamrożoną masą do zatapiania w temperaturze pokojowej, aby umożliwić minimalne stopienie związku wzdłuż krawędzi. Użyj skalpela lub szpatułki, aby oddzielić blok od ścian studni. Pracuj szybko, aby zapobiec topnieniu, używając kleszczy, aby usunąć blok związku zatapiającego matrycę i umieścić go w bloku próbki.

Całkowicie wypełnij formę masą do zatapiania. Zamrażać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut przed użyciem bloku do cięcia. Protokół ten został zoptymalizowany poprzez pierwszą transdukcję organoidów jelitowych za pomocą wektorów lentiwirusowych połączonych z GFP.

GFP wizualizowano na każdym etapie rozwoju organoidów, w tym na wczesnym etapie, gdy komórki krypty organizują się w struktury przypominające torbiele lub w późniejszych punktach czasowych, gdy organoidy tworzą pąki. Pomyślnie transdukowane organoidy jelitowe zostały następnie utrwalone formaliną, poddane kriosekcji i przeanalizowane za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Na tym obrazie jądra są zabarwione na niebiesko, a kolor zielony oznacza cząsteczki adhezyjne komórek nabłonka, które wyznaczają granice komórek.

Kolor czerwony oznacza barwienie lizosomami w celu identyfikacji komórek Panetha. Po opanowaniu, transdukcję organoidów można wykonać w ciągu około trzech godzin, a osadzanie w krisekcji organoidów można wykonać w ciągu około 2 1/2 godziny. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pracy na lodzie podczas pracy z odczynnikami do matrycy piwnicznej.

Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną i inne metody wykrywania białek lub organelli w celu oceny lokalizacji lub względnej obfitości. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania normalnej biologii i stanów chorobowych in vitro, a także do badań in vivo, jeśli transdukowane organoidy lub komórki można wszczepić myszom. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać magnetycznie znakowanych wirusów do genetycznej inżynierii organoidów do kriosekcji.

Nie zapominaj, że praca z wirusami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.