Name: Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę izolacji wysp trzustkowych od myszy z wykorzystaniem pojedynczego gradientu gęstości i wstrzyknięcia kolagenazy. Protokół zapewnia wysoką wydajność 250–350 wysp na mysz, redukując nakład pracy i koszty badań nad cukrzycą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Pani Jennifer Munguia za jej artystyczną ilustrację schematu. Dziękujemy Panu Michaelowi R. Honigowi z Houston's Community Public Radio Station KPFT za jego pomoc redakcyjną. Badanie to było wspierane przez Amerykańskie Towarzystwo Diabetologiczne #1-15-BS-177 (YS) i NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Prace te były również wspierane przez Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA, projekt Hatch 1010840 (YS) i R01 DK095118 (SG).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Uniwersytetu Texas A&M. Potrzebne narzędzia chirurgiczne są pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 1, a schemat ideowy procedury jest pokazany na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.
1. Rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), dodając 100 ml 10X HBSS (z bulionu) do 900 ml wody destylowanej, aby uzyskać 1 l HBSS (1X).</li>
	<li>Przygotować roztwór STOP (musi być świeży i powinien być zużyty w ciągu 1 godziny), dodając 50 ml 100X płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 450 ml lodowatego 1X HBSS; daje to 500 ml roztworu STOP. Roztwór STOP należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenazy P (musi być świeży w ciągu 1 godziny od użycia), dodając 1 mg/ml kolagenazy P do lodowatego 1X HBSS; użyć 6 ml / mysz.
	<ol>
		<li>Dodać 0,05% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do roztworu kolagenazy P (dostarcza to składniki odżywcze do izolowanych wysp trzustkowych). Na przykład użyj 3 mg BSA w 6 ml roztworu kolagenazy P. Trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Oblicz i przygotuj ilość kolagenazy P potrzebną dla wszystkich myszy w jednej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640, dodając 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, suplementu komórkowego INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu) do 500 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 5,5 mM glukozy, która ma być użyta do nocnej hodowli i inkubacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie
<ol>
	<li>Napełnij trzy probówki o pojemności 50 ml 25 ml roztworu hamującego RNazę, 70% etanolu lub destylowanegoH2O. Roztwory te będą wykorzystywane do czyszczenia narzędzi chirurgicznych przed i w trakcie zabiegu.</li>
	<li>Namocz końcówki narzędzi w roztworze hamującym RNazę na 30 minut przed rozpoczęciem protokołu; eliminuje to wszelkie potencjalne RNazy na narzędziach.</li>
	<li>Wstępnie przycięte wkładki chłonne o wymiarach 6 cali x 6 cali do użytku podczas operacji.</li>
	<li>Przygotować 1X roztwór HBSS wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór STOP przed zabiegiem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bezpośrednio przed zabiegiem należy przygotować roztwór kolagenazy P i przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Należy go zużyć w ciągu 2 godzin od przygotowania.</li>
	<li>Oznacz probówki o pojemności 50 ml do trawienia i oczyszczania; przygotuj 2 probówki dla każdej myszy, jedną do trawienia, a drugą do oczyszczania wysp trzustkowych. Upewnij się, że identyfikator zwierzęcia znajduje się na obu probówkach.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu kolagenazy P do pierwszej probówki o objętości 50 ml. Pozostałe 3 ml kolagenazy P zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Pobrać pozostałe 3 ml roztworu kolagenazy do strzykawki o pojemności 3 ml z igłą o sile 30 G 1/2 cala. Umieścić strzykawkę na lodzie.</li>
</ol>
3. Procedura
<ol>
	<li>Wyjmij wszystkie narzędzia z roztworu hamującego RNazę, a następnie zanurz je najpierw w probówce z 70% etanolem, następnie w probówce zawierającej destylowany H2O, a następnie wysusz na powietrzu na czystym ręczniku papierowym.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze zawierającej 0,5 ml izofluranu, aż mysz zostanie głęboko znieczulona.</li>
	<li>Wyjmij mysz z komory i sprawdź stan znieczulenia, ściskając opuszkę stopy kleszczami. Głębokie znieczulenie opiera się na obserwacji, że oddech staje się coraz wolniejszy, a mysz nie reaguje na szczypanie stóp. Po potwierdzeniu, że mysz jest głęboko znieczulona, należy poddać ją eutanazji ze zwichnięciem szyjki macicy, a następnie umieścić mysz na podkładce chłonnej.
	<ol>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na brzuchu, wywierając nacisk na szyję i zwichając kręgosłup od mózgu, ciągnąc za ogon.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyklej kończyny myszy w pozycji leżącej do wkładki chłonnej, spryskaj ciało 70% etanolem i zetrzyj nadmiar etanolu.</li>
	<li>Do wykonania nacięć użyj kleszczyków ze szkła nakrywkowego i zakrzywionych nożyczek chirurgicznych. Najpierw wykonaj poziome nacięcie na skórze okolicy brzucha (~3 cm), pociągnij skórę szeroko, aby odsłonić ścianę brzucha. Następnie wykonaj pionowe nacięcie (~3–4 cm) na otrzewnej brzusznej, aby w pełni odsłonić trzustkę w jamie brzusznej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Popchnij płaty wątroby wyżej, aby odsłonić przewód żółciowy, pojawi się on jako bladoróżowa rurka (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Ostrożnie przesuń jelita z prawego odcinka lędźwiowego/biodrowego jamy brzusznej w prawo, odsłaniając przewód żółciowy i tętnicę wątrobową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Ostrożnie zaciśnij wspólny przewód żółciowy za pomocą mikro serrefines Schwartza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) jak najbliżej wątroby.</li>
	<li>Zidentyfikuj bańkę Vatera, która znajduje się na brodawce dwunastnicy, utworzonej przez połączenie przewodu trzustkowego i wspólnego przewodu żółciowego. Bańka Vatera wydaje się spuchnięta, gdy patrzy się na nią pod mikroskopem preparacyjnym, który jest punktem wejścia do wspólnego przewodu żółciowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 4). 
	UWAGA: Regulacja intensywności/kąta światła mikroskopu preparacyjnego może ułatwić jego zlokalizowanie.</li>
	<li>Wprowadzić strzykawkę z 3 ml roztworu kolagenazy P do bańki Vatera. Wbij igłę do przewodu na około 1/4 długości wspólnego przewodu żółciowego (bańka prowadzi do kanału), jak pokazano na Rysunek 5.</li>
	<li>Gdy igła znajdzie się w bańce, upewnij się, że orientacja igły jest taka, aby była równoległa do przewodu.</li>
	<li>Ustabilizuj igłę, zaciskając ją mikro kleszczami Adson, aby zapobiec jej przebiciu kanału (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5).</li>
	<li>Powoli i równomiernie wstrzyknij 3 ml roztworu kolagenazy P ze strzykawki do wspólnego przewodu żółciowego (wystarczająco dużo, aby poczuć opór), jak pokazano na Rysunek 6. Celem jest wytworzenie ciśnienia zwrotnego, aby zmusić kolagenazę do wejścia do przewodu trzustkowego. Wstrzyknięcie uważa się za udane, jeśli głowa, szyja, tułów i ogon trzustki są w pełni napompowane. 
	UWAGA: Wydajność wysp trzustkowych będzie niska, jeśli trzustka nie jest w pełni napompowana lub obszar śledziony nie jest w pełni napompowany. Obszar śledziony zawiera największą liczbę wysepek6. Napompowanie można potwierdzić poprzez pojawienie się otwartych przestrzeni między tkanką trzustki, które są wypełnione roztworem.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj napompowaną trzustkę i umieść ją w probówce do wytrawiania o pojemności 50 ml zawierającej 3 ml lodowatego roztworu kolagenazy P.
	<ol>
		<li>Usuń trzustkę za pomocą 2 kleszczy (zakrzywionych i Micro Adson; Zobacz Rysunek 1): (zaczynając od śledziony, odciągnij trzustkę od śledziony i kontynuuj usuwanie z żołądka i wzdłuż dwunastnicy. 
		UWAGA: Nie są wymagane żadne nacięcia.</li>
		<li>Siekaj trzustkę przez 3-5 s w probówce wytrawiającej z 3 ml lodowatego roztworu kolagenazy P za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych (<silna klasa = "xfig">Ryc. 7A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj probówkę do stojaka w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i potrząsaj z prędkością 100–120 obr./min przez około 12–13 minut.</li>
	<li>Po inkubacji delikatnie potrząśnij probówkami ręcznie, aby rozbić tkankę, aż roztwór do trawienia kolagenazy P stanie się jednorodny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7B). Jednorodność potwierdza przypominający piasek wygląd drobnych cząstek trzustki. Zwykle wystarcza około 30 sekund delikatnego uścisku dłoni. Trzymaj probówkę do światła, aby sprawdzić, czy tkanka jest dobrze zhomogenizowana; W razie potrzeby wstrząsaj przez kolejne ~15 s.</li>
	<li>Po strawieniu natychmiast umieść probówki na lodzie i dodaj 40 ml lodowatego roztworu STOP, aby zakończyć trawienie enzymatyczne. 
	UWAGA: W tym momencie rurki do wytrawiania można pozostawić na lodzie do 2 godzin, jeśli pracujesz na wielu myszach.</li>
	<li>Odwirować probówkę w wirówce z odchylanym wiadrem o sile 300 x g przez 30 s (temperatura wirówki jest elastyczna). 
	UWAGA: Użyj wirówki z wahadłowym wiadrem, tak aby osad tkankowy powstał na dnie probówki o pojemności 50 ml, a nie na ściance probówki; Ma to kluczowe znaczenie dla lepszego plonowania wysepek.</li>
	<li>Zdekantować i powtórzyć wirowanie z roztworem STOP jeszcze 2 razy, dekantując roztwór po każdym wirowaniu. Do każdego kolejnego prania należy stosować 20 ml roztworu STOP.
	<ol>
		<li>Przed każdym wirowaniem należy rozbić osad, delikatnie potrząsając osadem tkankowym w probówce o pojemności 50 ml w roztworze STOP o pojemności 20 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad tkankowy w 40 ml lodowatego HBSS i odwirować przy 300 x g przez 30 s.</li>
	<li>Zdekantować i powtórzyć wirowanie za pomocą wirówki z odchylanym wiadrem z roztworem HBSS jeszcze dwa razy, dekantując roztwór po każdym wirowaniu. Użyj 20 ml HBSS do każdego prania.
	<ol>
		<li>Przed każdym wirowaniem należy rozbić osad, aby oderwać go od dna probówki, delikatnie potrząsając probówką zawierającą 20 ml roztworu HBSS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ostatnim odwirowaniu usuń wszystkie HBSS.</li>
	<li>Następnie dodać 5 ml gradientu gęstości w temperaturze pokojowej do probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad. Krótko mieszać na niskich obrotach, aż do homogenizacji.</li>
	<li>Dodaj kolejne 5 ml gradientu gęstości temperatury pokojowej do probówki o pojemności 50 ml. Nie mieszać/mieszać. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pozostać stabilnym i nieruchomym, aby umożliwić tworzenie się lepszego nachylenia bez zakłóceń.</li>
	<li>Odpipetować 10 ml buforu HBSS o temperaturze pokojowej do probówki (zawierającej gradient gęstości), kropla po kropli, delikatnie i powoli, aby umożliwić utworzenie gradientu. Użyj pistoletu do pipet z pipetą o pojemności 10 ml, aby dodać HBSS kroplami.</li>
	<li>Za pomocą wirówki z obrotowym kubełkiem wiruj probówki o sile 1700 x g przez 15 minut. Upewnij się, że prędkość zarówno przyspieszania/zwalniania, jak i zwalniania została zmieniona na najniższą, aby utrzymać nachylenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C).</li>
	<li>Po wirowaniu ostrożnie wyjmij rurki, nie naruszając gradientu. Za pomocą pistoletu do pipet wstępnie zwilżonego zimnym HBSS (pipeta HBSS w górę i w dół) odpipetuj warstwę wysepek (5–10 ml) utworzoną między gradientem gęstości a HBSS do nowej probówki do pobierania wysepek o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Pomocne jest zwilżenie pipety zimnym HBSS przed pipetowaniem wysepek, aby zapobiec przywieraniu wysepek do wewnętrznych ścianek pipety.
	<ol>
		<li>W przypadku, gdy separacja jest niekompletna, wysepki będą widoczne w warstwie gradientu gęstości, odpipetuj całe 10 ml gradientu gęstości (dolna warstwa) wraz z warstwą wysepek utworzoną na granicy faz (tylko po to, aby pozostawić około 8–10 ml górnej warstwy HBSS z tyłu). 
		UWAGA: Zbieranie zarówno warstwy wysepek, jak i warstwy gradientu gęstości (warstwa dolna) może spowodować zbieranie zanieczyszczeń, co może wydłużyć czas wybierania wysepek, ale żadne inne kroki nie zostaną zmienione. Zbieranie obu tych warstw nie jest konieczne, gdy warstwa wysepek jest dobrze uformowana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 ml lodowatego HBSS do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej wysepki, a następnie odwirować przy 350 x g przez 3 minuty w wirówce z odchylanym wiadrem.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować (nie dekantować) supernatant (pozostawić ~3 ml na dnie) bez naruszania osadu zawierającego wysepki na dnie. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz mycie i odwirowywanie co najmniej 3 razy. Za każdym razem dodawaj 20 ml HBSS i pamiętaj, aby zawiesić granulkę przed każdym wirowaniem.</li>
	<li>Przed użyciem podgrzej kompletną butelkę z mediami RPMI-1640 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Po ostatnim odwirowaniu usunąć cały HBSS i dodać 4 ml wcześniej przygotowanej kompletnej pożywki RPMI-1640 (zawierającej FBS, dodatek komórkowy INS-1 i penicylinę/streptomycynę) do osadu.</li>
	<li>Usuń osad, delikatnie obracając probówkę i natychmiast wlej pożywkę RPMI-1640 do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Dodaj kolejne 5 ml pożywki RPMI-1640 do probówki i delikatnie ją zamieszaj, aby zmyć wszelkie pozostałe wysepki, a następnie wlej pożywkę do tej samej szalki Petriego.
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym pobrać zdrowe wysepki z szalki Petriego za pomocą pipety o pojemności 20 μl i umieścić je na nowej szalce Petriego zawierającej 10 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Oglądane pod mikroskopem sekcyjnym wysepki powinny mieć kulisty/podłużny i złotobrązowy kolor z gładką powierzchnią w porównaniu ze stosunkowo przezroczystą, delikatną tkanką zewnątrzwydzielniczą. 
		UWAGA: Powiększenie mikroskopu preparacyjnego jest zwykle ustawione na 12,5–16x. Wydajność wysepek będzie się różnić w zależności od różnych czynników, w tym odmiany, wieku i płci myszy. Ten protokół zwykle daje 250-350 zdrowych wysepek od zdrowej myszy C57BL/6J w wieku 4-10 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować wyspy trzustkowe w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% naparemCO2 i 95% nawilżonym powietrzem przez noc do eksperymentów następnego dnia lub zamrozić wysepki do pożądanej analizy w późniejszym czasie.
	<ol>
		<li>Po zamrożeniu wysp trzustkowych nie można ich używać do oznaczania wydzielania, a jedynie do oznaczania ilościowego RNA lub białka. Aby zebrać komórki do zamrożenia, umieścić je w buforze HBSS, zebrać wszystkie wysepki w 200–500 μl buforu, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować 350 x g przez 1–2 min, usunąć supernatant pozostawiając nie więcej niż 30–40 μl roztworu, umieścić w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego przechowywania (kilka dni) lub -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten obejmuje perfuzję i trawienie kolagenazy, a następnie oczyszczanie wysp trzustkowych. Najbardziej krytycznymi etapami tego protokołu są skuteczne wstrzyknięcie i całkowita perfuzja trzustki 1,4,7. Metoda dostarczania tego protokołu pozwala enzymowi pokonywać szlaki anatomiczne w celu lepszego trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej otaczającej wyspy trzustkowe1. Ponadto technika ta doskonale n...

W literaturze istnieją dwie popularne metody izolacji wysp trzustkowych. Należy wyciąć trzustkę i pokroić ją w małe kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych, a następnie trawić w roztworze kolagenazy1,2,3. Inną, bardziej precyzyjną metodą jest wykorzystanie sieci przewodów obecnych w trzustce do wprowadzenia enzymu trawiennego. Do wstrzykiwania enzymu trawiennego wykorzystano następujące miejsca: połączenie przewodu żółciowego i torbielowatego, pęcherzyk żółciowy do przewodu żółciowego wspólnego lub sam przewód żółciowy wspólny1,4,5. Wiadomo, że wysepki nie są równomiernie rozmieszczone w trzustce; Obszar śledziony zawiera najwięcej wysepek6. Podczas gdy druga metoda wykorzystująca anatomiczne drogi dostarczania enzymów trawiennych pozwala na pełniejszą perfuzję trzustki, w tym okolicy śledziony, procedura ta często wymaga zaciśnięcia lub zszycia bańki Vatera, co jest technicznie trudne. Jeśli chodzi o oczyszczanie wysepek, do oczyszczania wysepek zastosowano wiele gradientów gęstości, a także sitka komórkowe i retrakcję magnetyczną3,7. Wykorzystanie tych gradientów może być czasochłonne, a gradienty Ficoll mogą powodować toksyczne uszkodzenia wysepek8.
Obecny protokół jest zbudowany na metodzie opisanej przez Li et al.7, z dodatkowymi modyfikacjami dodanymi w oparciu o doświadczenia nasze i innych1,4. Najbardziej krytycznymi krokami naszego protokołu są zaciśnięcie wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu końca wątroby, wstrzyknięcie kolagenazy P przez bańkę Vatera w celu strawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej, a następnie użycie wstrząsającej łaźni wodnej w celu mechanicznego przyspieszenia trawienia1,4,7. Następnie stosuje się roztwór "STOP" w celu zahamowania dalszego trawienia wysp trzustkowych; HBSS służy do zmywania pozostałego roztworu kolagenazy P i STOP. Gdy metoda Ficoll została użyta do oczyszczenia ludzkich wysp trzustkowych, stwierdzono, że wydajność była dwukrotnie wyższa niż w przypadku wysepek o większej zdolności funkcjonalnej (np. wydzielaniu insuliny) w porównaniu z zastosowaniem gradientów Percolla9. Jednak badania zakwestionowały stosowanie gradientu Ficoll ze względu na jego toksyczny wpływ na wysepki1,10. Doniesiono, że gradient histopistyczny zapewnia optymalną kinetykę oczyszczania dla izolacji mysich wysp trzustkowych, co daje dobry plon wysokiej jakości wysepek przy prostszych krokach i niższych kosztach1. W naszym protokole Histopaque-1077 służy do oczyszczania wysp trzustkowych z innych pozostałości tkanki8,11. Zebrane wysepki mogą być hodowane w kompletnych pożywkach RPMI-1640 lub bezpośrednio wykorzystywane do ilościowego oznaczania RNA/białka.
Nasz protokół, wykorzystujący kombinację trawienia kolagenazy P i pojedynczego etapu oczyszczania gradientowego, jest prostszy niż inne opublikowane protokoły. Nasza metoda nie wymaga wymagających zabiegów chirurgicznych i składa się z zaledwie kilku prostych kroków. Co ważniejsze, protokół ten konsekwentnie zapewnia dobre plony wysokiej jakości funkcjonalnych wysepek (250-350/mysz), jak poinformowaliśmy12.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Kolagenaza Hodinga P</td></tr><tr><td>Kleszczyki szklane VWR</td><td></td><td>82027-396</td><td>Trzymanie skóry myszy w celu ułatwienia procedury nacięcia</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168696</td><td>Trzymanie tkanek podczas usuwania trzustki</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Piramal</td><td>B13B16A</td><td>Do znieczulenia myszy przed operacją</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 mm</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>Używany do hodowli wysp trzustkowych</td></tr><tr><td>30 G. & frac12; igła calowa</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Do penetracji bańki w celu dostarczenia kolagenazy P - ten miernik jest używany, ponieważ dobrze pasuje do większości</td></tr><tr><td>tubek CBD 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Utrzymuje strawioną tkankę trzustkową, kolagenazę P i oczyszczone wyspy trzustkowe</td></tr><tr><td>Wkłady chłonne z wodoodporną barierą dla wilgoci</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Aby wchłonąć krew z procesów urgicznych</td></tr><tr><td>Wirówka 5810R z wiadrem wahadłowym i funkcją zwalniania</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>Służy do granulowania tkanek, na dnie stożkowej rurki tworzy się osad - potrzebna jest wirówka z wiadrem wahadłowym. Również funkcja dezelacji jest ważna dla tworzenia warstw gradientu.</td></tr><tr><td>Kolagenaza P-1g</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11249002001</td><td>Do trawienia zewnątrzwydzielniczej trzustki</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki chirurgiczne</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>Do rozcinania brzucha myszy</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Służy do identyfikacji kluczowych struktur anatomicznych w celu dokładnego dostarczenia kolagenazy do trzustki</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>Komórki myjące</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>Do tworzenia gradientów</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Leeds</td><td>LR92240</td><td>Poprawa widoczności mikroskopu</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>Do usuwania RNazy</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Podłoża bez L-Glutaminy</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td>Hodowla wysepek</td></tr><tr><td>Mikro serfineny Schwartza (zacisk mikronaczyniowy)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-01</td><td>Zaciskanie wspólnego przewodu żółciowego i tętnicy wątrobowej</td></tr><tr><td>Wstrząsająca kąpiel wodna</td><td>Boekel/Grant</td><td>8R0534008</td><td>Ważne dla mechanicznego trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej</td></tr><tr><td>Małe nożyczki chirurgiczne</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Tkanka tnąca, która przylega do trzustki</td></tr></tbody></table>

prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Wysepki składają się głównie z pięciu typów komórek wydzielających hormony: α komórki wydzielają glukagon, β komórki wydzielają insulinę, δ komórki wydzielają somatostatynę, ε komórki wydzielają grelinę, a komórki PP wydzielają polipeptyd trzustkowy. Sześćdziesiąt do 80% komórek w wyspach trzustkowych to β komórki, które są najważniejszą populacją komórek do badania wydzielania insuliny. Wyspy trzustkowe są kluczowym systemem modelowym do badania wydzielania insuliny ex vivo. Pozyskiwanie wysokiej jakości wysepek ma ogromne znaczenie dla badań nad cukrzycą. Większość procedur izolacji wysp trzustkowych wymaga technicznie trudnego dostępu do miejsca wstrzyknięcia kolagenazy, trudnych i złożonych procedur trawienia oraz wielu etapów oczyszczania w gradieniu gęstości. W artykule przedstawiono prostą, wysokowydajną metodę izolacji wysepek trzustkowych myszy ze szczegółowymi opisami i realistycznymi demonstracjami, pokazującymi następujące konkretne kroki: 1) wstrzyknięcie kolagenazy P do bańki Vatera, małego obszaru łączącego przewód trzustkowy i przewód żółciowy wspólny, 2) trawienie enzymatyczne i mechaniczne oddzielenie zewnątrzwydzielniczej trzustki oraz 3) pojedynczy etap oczyszczania gradientowego. Zaletami tej metody są wstrzyknięcie enzymu trawiennego przy użyciu bardziej dostępnej bańki Vatera, pełniejsze trawienie przy użyciu kombinacji metod enzymatycznych i mechanicznych oraz prostszy etap oczyszczania z pojedynczym gradientem. Ten protokół generuje około 250—350 wysepek na mysz; a wysepki nadają się do różnych badań ex vivo. Możliwymi zastrzeżeniami tej procedury są potencjalnie uszkodzone wyspy trzustkowe w wyniku trawienia enzymatycznego i/lub długotrwałej inkubacji gradientowej, których w dużej mierze można uniknąć poprzez staranne uzasadnienie czasu inkubacji.

Prawidłowe przeprowadzenie tej procedury wymaga pewnej wiedzy z zakresu anatomii jamy brzusznej myszy. Pozwala to na właściwą identyfikację zbiorniczki Vatera oraz zaklemowanie wspólnego przewodu żółciowego. Cała procedura trwa zazwyczaj 1–2 h. Bardziej wydajne jest izolowanie wysepek z 4–6 myszy jednocześnie, co pozwala na wspólne wirowanie kilku próbek. Czas wyławiania wysepek jest zmienny i zależy od ich liczby oraz efektywności trawienia; wyłowienie 250–350 wysepek z jednej myszy może zająć około godziny.
<p clas...

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Protokół ten wymaga użycia pojedynczego gradientu gęstości, dzięki czemu jest znacznie mniej pracochłonny i bardziej opłacalny w porównaniu z bardziej złożonymi konwencjonalnymi metodami izolacji wysepek. Główną zaletą tego protokołu jest to, że enzym jest dostarczany bezpośrednio do trzustki, co skutkuje zwiększonym trawieniem tkanek i zwiększoną wydajnością wysp trzustkowych. Zacznij od przyklejenia kończyn myszy w pozycji leżącej na plecach i spryskania ciała 70% etanolem.Za pomocą kleszczy szklanych i zakrzywionych nożyczek chirurgicznych wykonaj około trzycentymetrowe poziome nacięcie skóry brzucha i rozciągnij skórę, aby odsłonić ścianę brzucha. Wykonaj pionowe nacięcie na otrzewnej brzusznej o grubości od trzech do czterech centymetrów, aby całkowicie odsłonić trzustkę i umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym. Popchnij płat wątroby wyżej, aby odsłonić przewód żółciowy, który wygląda jak bladoróżowa rurka i delikatnie przesuń jelita z prawej okolicy lędźwiowej i biodrowej na prawo od jamy brzusznej, aby odsłonić przewód żółciowy i tętnicę wątrobową.Użyj mikro serrefinów Schwartza, aby ostrożnie zacisnąć wspólny przewód żółciowy jak najbliżej wątroby i zidentyfikować bańkę

a-simple-high-efficiency-protocol-for-pancreatic-islet-isolation-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj uproszczoną metodę izolacji wysp trzustkowych od myszy z wykorzystaniem pojedynczego gradientu gęstości i wstrzyknięcia kolagenazy. Protokół zapewnia wysoką wydajność 250–350 wysp na mysz, redukując nakład pracy i koszty badań nad cukrzycą.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Przeglądaj więcej filmów