Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy
30 sierpnia 2019
Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.
Protokół ten wymaga użycia pojedynczego gradientu gęstości, dzięki czemu jest znacznie mniej pracochłonny i bardziej opłacalny w porównaniu z bardziej złożonymi konwencjonalnymi metodami izolacji wysepek. Główną zaletą tego protokołu jest to, że enzym jest dostarczany bezpośrednio do trzustki, co skutkuje zwiększonym trawieniem tkanek i zwiększoną wydajnością wysp trzustkowych. Zacznij od przyklejenia kończyn myszy w pozycji leżącej na plecach i spryskania ciała 70% etanolem.
Za pomocą kleszczy szklanych i zakrzywionych nożyczek chirurgicznych wykonaj około trzycentymetrowe poziome nacięcie skóry brzucha i rozciągnij skórę, aby odsłonić ścianę brzucha. Wykonaj pionowe nacięcie na otrzewnej brzusznej o grubości od trzech do czterech centymetrów, aby całkowicie odsłonić trzustkę i umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym. Popchnij płat wątroby wyżej, aby odsłonić przewód żółciowy, który wygląda jak bladoróżowa rurka i delikatnie przesuń jelita z prawej okolicy lędźwiowej i biodrowej na prawo od jamy brzusznej, aby odsłonić przewód żółciowy i tętnicę wątrobową.
Użyj mikro serrefinów Schwartza, aby ostrożnie zacisnąć wspólny przewód żółciowy jak najbliżej wątroby i zidentyfikować bańkę Vatera, która znajduje się na brodawce dwunastnicy i jest utworzona przez połączenie przewodu trzustkowego i wspólnego przewodu żółciowego. Używając mikro kleszczyków Adson do pociągnięcia wspólnego przewodu żółciowego, włóż półcalową igłę o rozmiarze 30 wielkości przymocowaną do trzymililitrowej strzykawki zawierającej trzy mililitry świeżo przygotowanego roztworu kolagenazy P do bańki Vatera, wpychając igłę do przewodu równolegle do naczynia przez około jedną czwartą długości naczynia. Gdy igła znajdzie się na miejscu, ustabilizuj igłę za pomocą mikro kleszczyków Adson i powoli i stabilnie wstrzyknij trzy mililitry roztworu kolagenazy P do kanału.
Wstrzyknięcie uważa się za udane, jeśli okolice głowy, szyi, tułowia i ogona trzustki są całkowicie napompowane. Prawidłowe wejście do bańki i kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego mają kluczowe znaczenie dla udanych zbiorów trawiennych. Przebijanie ścianek kanałów zmniejsza skuteczność izolacji.
Za pomocą zakrzywionych i mikro kleszczy Adson ostrożnie wyciągnij napompowaną trzustkę, zaczynając od śledziony i kontynuując w kierunku żołądka i wzdłuż dwunastnicy. Następnie umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce do wytrawiania zawierającej trzy mililitry lodowatego roztworu kolagenazy P. Aby zebrać wysepki, najpierw użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby posiekać trzustkę przez trzy do pięciu sekund, a następnie umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością od 100 do 120 obrotów na minutę przez 12 do 13 minut.
Pod koniec inkubacji delikatnie potrząsać probówką przez około 30 sekund, aby rozbić tkankę, aż roztwór stanie się jednorodny, co potwierdzają drobne cząsteczki tkanki trzustki przypominające piasek. Jak tylko tkanka zostanie strawiona, umieść probówkę na lodzie i dodaj 40 mililitrów lodowatego roztworu, aby zakończyć reakcję enzymatyczną. Po delikatnym rozdrobnieniu osadu, odwiruj strawioną tkankę w wirówce z wahadłowym wiadrem, a następnie wykonaj dwa wirowania z 20 mililitrami świeżego roztworu zatrzymującego na mycie.
Po ostatnim praniu ponownie zawiesić granulat w 40 mililitrach lodowatego HBSS na trzy dodatkowe prania, ponownie zawieszając granulat w pięciu mililitrach roztworu gradientu gęstości w temperaturze pokojowej po ostatnim praniu. Krótko obracaj probówkę z niską prędkością, aż roztwór zostanie zhomogenizowany, a następnie dodaj do probówki kolejne pięć mililitrów gradientu gęstości w temperaturze pokojowej. Teraz użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie i powoli dodać 10 mililitrów HBSS o temperaturze pokojowej do probówki w sposób kroplowy, aby umożliwić utworzenie gradientu i użyj wirówki z wahadłowym wiadrem, aby wyizolować populacje komórek przez separację gradientu gęstości.
Pod koniec wirowania użyj 10-mililitrowej pipety wstępnie zwilżonej zimnym HBSS, aby zebrać od pięciu do 10 mililitrów warstwy wysepek między gradientem gęstości a HBSS. Przenieś wysepki do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów świeżego, lodowatego HBSS i zbierz komórki przez odwirowanie w wirówce z wahadłowym wiadrem. Ostrożnie odessać wszystkie oprócz ostatnich trzech mililitrów supernatantu bez naruszania osadu i umyć wysepki jeszcze co najmniej trzy razy 20 mililitrami świeżego HBSS na przemycie.
Po ostatnim praniu zastąp supernatant czterema mililitrami pożywki RMPI 1640 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie zakręć rurką, aby usunąć osad. Natychmiast wlej wysepki do 100-milimetrowej szalki Petriego i umyj probówkę pięcioma mililitrami świeżej pożywki RPMI 1640, aby zebrać wszelkie pozostałe wysepki, łącząc płukanie z innymi wysepkami. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego i końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby wybrać zdrowe kuliste lub podłużne złotobrązowe wysepki o gładkiej powierzchni z szalki Petriego w celu przeniesienia na nową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640.
Po zebraniu wszystkich wysepek umieść je w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym powietrzu na noc. Dobre, zdrowe wysepki wydają się mieć gładki, okrągły kształt, podczas gdy złe, uszkodzone wysepki mają ostre krawędzie. Niestrawiona tkanka zewnątrzwydzielnicza ma półprzezroczysty wygląd i nieregularny kształt.
Prawidłowa kaniulacja i dystrybucja enzymu kolagenazy P może być potwierdzona przez napompowanie części śledziony trzustki. Nocna inkubacja w pożywce o niskim poziomie glukozy może przygotować wyspy trzustkowe do testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą następnego dnia, umożliwiając wgląd w zdolność wydzielniczą insuliny wysp trzustkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowy protokół izolacyjny wysp wykorzystujący iniekcję kolagenazy dla ulepszonej trawienia tkanki i wydajności izolacji wysp. Metoda upraszcza proces separacji gradientowej, pozwalając na udaną izolację 250–350 wysokiej jakości wysp na jedną mysz.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Techniki izolacji wysp
Tło
- Izolacja wysp jest kluczowa dla badań nad cukrzycą.
- Konwencjonalne metody mogą być pracochłonne i kosztowne.
- Ulepszone techniki mogą zwiększyć wydajność i funkcjonalność wysp.
- Iniekcja kolagenazy bezpośrednio celuje w trzustkę.
Cel badania
- Rozwój mniej pracochłonnego protokołu izolacji wysp.
- Zwiększenie wydajności funkcjonalnych wysp z trzustki myszy.
- Upraszczenie procedury przy zachowaniu jakości wysp.
Stosowane metody
- Jedno-gęstościowy gradient dla czyszczenia wysp.
- Enzymatyczne trawienie tkanki zewnątrzwydzielniczej.
- Ręczne zbieranie wyizolowanych wysp.
- Zastosowanie technik chirurgicznych do ekspozycji trzustki.
Główne wyniki
- Ulepszone trawienie tkanki prowadzi do wyższej wydajności wysp.
- Protokół daje 250–350 wysokiej jakości wysp na jedną mysz.
- Mniej pracochłonne w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.
- Kosztowo efektywne podejście do izolacji wysp.
Wnioski
- Nowy protokół znacząco poprawia wydajność izolacji wysp.
- Bezpośrednie dostarczanie enzymów poprawia ogólną wydajność i jakość.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad cukrzycą.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Pancreatic islet isolation is a critical bottleneck in diabetes research, where low yield and labor-intensive protocols limit throughput for target validation and mechanistic studies. This protocol enhances predictive confidence by delivering collagenase P directly to the ampulla of Vater, enabling more complete enzymatic and mechanical digestion of exocrine tissue. The resulting increase in islet yield and quality supports reliable ex vivo insulin secretion assays, directly informing lead identification and preclinical model selection for diabetes therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of β-cell function and insulin secretion pathways through high-yield islet recovery.
- Operational Value: Reduces technical barriers to islet access, supporting consistent target validation across multiple mouse strains or disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces islets suitable for glucose-stimulated insulin secretion assays, providing quantitative readouts for compound screening.
- Operational Value: Simplifies purification via a single density gradient, improving assay standardization and reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by providing primary islets that maintain endocrine function for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical work by delivering islets ready for functional validation in diabetic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary islets for downstream applications in lead identification and preclinical validation, particularly for diabetes-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of insulin secretion mechanisms through access to functional islet populations.
- Screening: Delivers standardized islet preparations enabling reliable compound evaluation in secretion assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., insulin release) that help compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant islets for validation in diabetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that reduces dependency on external suppliers and increases internal assay throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in islet function.
- Operational Value: Standardization and scalability via simplified single-gradient purification and direct enzyme delivery.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in diabetes programs by improving success rates of islet-based assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on reliable insulin secretion data from high-yield islet preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for pancreatic duct cannulation and tissue handling.
- Depends on access to dissection microscopes, centrifuges, and temperature-controlled water baths for enzymatic digestion.
- Necessitates standardization of collagenase P concentration and incubation timing across operators to ensure consistent islet quality.
- Requires adaptation of gradient volumes and wash protocols when scaling to different mouse strains or ages.
- Practical limitations include potential islet damage from over-digestion, which can be mitigated by optimizing enzymatic exposure time as described in the protocol.
