Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zastosowania multipleksowanej platformy diagnostycznej w miejscu opieki nad pacjentem, która nie wymaga intensywnego przygotowywania próbek i drogiego oprzyrządowania i jest stosowana w różnych próbkach biologicznych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki przyłóżkowej, takie jak wykrywanie różnych celów w pojedynczej probówce reakcyjnej. Dzięki zastosowaniu amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli w połączeniu z sondami przemieszczającymi nici specyficzne dla celu, można skutecznie wykryć trzy różne wirusy.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje amplifikację izotermiczną zamiast PCR i wymaga minimalnego przygotowania próbki i może być stosowana do wielu próbek klinicznych. Zacznij od pocięcia arkuszy papieru Q na małe prostokąty o wymiarach trzy milimetry na cztery milimetry za pomocą dziurkacza do papieru. Następnie użyj mikrotłuczka, aby zmiażdżyć samice komarów Aedes aegypti potencjalnie zarażone wirusem Zika na każdym papierze.

Odpipetować 20 mikrolitrów jednego molowego wodnego roztworu amoniaku na każdy kawałek papieru. Po pięciu minutach umyj każdy papier 20 mikrolitrami 50% etanolu, a następnie 20 mikrolitrami wody bez nukleaz. Suszyć papier na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 przez około godzinę.

Po wysuszeniu za pomocą pęsety całkowicie zanurz każdy papier w 100 mikrolitrach mieszaniny reakcyjnej RT-LAMP i inkubuj w temperaturze od 65 do 68 stopni Celsjusza przez 45 minut. Przeczytaj i zapisz fluorescencję powstającą z wirusa Zika za pomocą wydrukowanego w 3D pudełka obserwacyjnego ze źródłem światła LED i pomarańczowym lub żółtym filtrem. Rozpocznij od dodania 90 mikrolitrów 1,1-krotnego buforu do uwodnienia do każdej probówki reakcyjnej zawierającej liofilizowane odczynniki RT-LAMP i rozpuść przez wstrząsanie.

Następnie na krótko rozkręć się w dół z prędkością 1000 razy większą niż grawitacja. Po odwirowaniu dodać 10 mikrolitrów próbki moczu wzbogaconej wirusowym RNA do probówek reakcyjnych i wymieszać przez pipetowanie. Jeśli testujesz komary, dodaj prostokąt z papieru Q zawierającego tusze komarów wraz z 10 mikrolitrami oczyszczonej wody zamiast moczu.

Umieść zamknięte probówki w bloku grzewczym ustawionym na 65 do 68 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 do 45 minut. Po inkubacji należy trzymać probówki zamknięte, aby zapobiec zanieczyszczeniu przyszłych testów i umieścić w pudełku obserwacyjnym. Włącz przełącznik z tyłu skrzynki obserwacyjnej.

Obserwuj próbkę przez pomarańczowy filtr i uchwyć obraz za pomocą kamery telefonu komórkowego, która jest trzymana w odległości, w której obraz wypełnia 80% pola widzenia. Po zakończeniu wizualizacji wyłącz przełącznik. Przechowuj zamknięte rurki w ciemności, najlepiej w lodówce, jeśli potrzebna jest późniejsza wizualizacja.

Zarówno w przypadku singleplex, jak i multiplex, produkty RT-LAMP pojawiają się jako litera konkamerów, gdy są uruchamiane na żelu agarozowym. Ujemne próbki kontrolne zawierające wodę jako próbkę dały tylko prążki dla samych starterów, w tym niespecyficzną kontrolę docelową, w której całkowity kwas nukleinowy wyekstrahowany z niezakażonej samicy komara użyto jako matrycy. Zielona fluorescencja jest obserwowana dla wirusa Zika przy użyciu sond jako pięciu pierwszych NT znakowanych FAM.

Jasnozielona, żółta fluorescencja jest przypisana do Chikungunya, gdzie sonda ma pięć pierwszych NT oznaczonych HEX. Pomarańczowo-czerwona fluorescencja jest używana dla Dengue-1, gdzie jej sonda ma pięć głównych NT znakowanych TAMRA. Dwie bibułki zawierające komary zanurzono bezpośrednio w mieszaninie RT-LAMP i po inkubacji w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut zaobserwowano jasnozieloną fluorescencję w obecności wirusa Zika.

Używając dziewięciu objętości buforu nawadniającego i jednej objętości próbki moczu, widoczna zielona fluorescencja może zostać wygenerowana w ciągu 30 minut, a obraz może zostać przechwycony przez dowolną kamerę telefonu komórkowego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką kliniczną do badania platform przyłóżkowych do wykrywania wirusów przenoszonych przez komary w moczu, krwi, ślinie lub tuszach komarów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać systemu amplifikacji izotermicznej, w tym przypadku lampy, do wykrywania Zika i innych arbowirusów w sposób multipleksowy w różnych próbkach biologicznych.