Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Ogólnym celem tej techniki jest elektrofizjologiczna identyfikacja połączeń monosynaptycznych u drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i może ujawnić chemiczną naturę synaps. Nadaje się również do badania transmisji objętościowej lub masowej.

Ogólnie rzecz biorąc, w filmach, które są nowe w tej metodzie, zmagamy się z trudnością sekcji. Jednak po prostu rozumiejąc tę metodę, logikę można łatwo przenieść do innych systemów modelowych, takich jak myszy. Do nagrań należy użyć pipet krosowych do pomiaru rezystancji w pobliżu siedmiu megaomów.

Posiadać również zewnętrzną sól fizjologiczną o pH 7,3 lub niższym, stale napowietrzaną karbogenem zawierającym 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Dla badanych należy mieć stado muchowe wyrażające csChrimson, rozmnażające się na pokarmie zawierającym 0,2 milimola wszystkich trans-retinalów. Do nagrań wybierz osoby dorosłe w wieku od jednego do trzech dni.

Załaduj je do szklanej fiolki scyntylacyjnej i unieruchamiaj ją, wystawiając na jednominutową ekspozycję na lodowate warunki. Następnie zmniejsz poziom światła na lunecie sekcyjnej i grubych kleszczach, aby załadować znieczuloną muchę do specjalnie wykonanej komory nagraniowej. Przymocuj muchę do komory, otaczając ją woskiem lub żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV.

Ustaw go grzbietem do góry z folią mniej więcej w połowie wysokości klatki piersiowej. Kluczem do uzyskania świetnego preparatu jest wycięcie otworu w folii tak, aby był odpowiedniego rozmiaru, tak aby mucha nie była ściskana ani nie mogła przez nią przepaść. Oświetl preparat lampami światłowodowymi z obu stron i utrzymuj je tak przyciemnione, jak to możliwe.

Następnie przykryj preparat czterema do sześciu kropli soli fizjologicznej. Następnie naostrz drut wolframowy lub żarnik do rozwarstwienia. Przyłóż około 20 woltów prądu przemiennego do roztworu nasyconego azotanem potasu i kilkakrotnie bardzo szybko zanurz końcówkę drutu w roztworze.

Po 20 zanurzeniach końcówka będzie ostra. Teraz dostosuj światła, aby zapewnić wystarczającą widoczność, aby użyć zaostrzonego drutu do odsłonięcia mózgu, usuwając naskórek, a następnie tchawicę i ciała tłuszczowe. Aby uzyskać dostęp do płatków anteny, użyj wygiętego drutu wolframowego, aby delikatnie wsunąć antenę pod foliową osłonę.

Następnie za pomocą ostrych kleszczy delikatnie oderwij poszycie glejowe pokrywające obszar zainteresowania. Teraz przenieś preparat na stanowisko do elektrofizjologii, aby dokonać nagrań. Na platformie natychmiast rozpocznij perfuzję preparatu solą fizjologiczną, bąbelkową karbogenem.

Użyj grawitacyjnego zbiornika z roztworem soli umieszczonego nad stolikiem mikroskopu. Do zebrania odpadowej soli fizjologicznej należy użyć przewodu próżniowego i kolby o pojemności 2 litrów. Następnie załadować pipetę z plastrem 4 mikrolitrami wewnętrznego roztworu rejestrującego i podłączyć pipetę do mikromanipulatora.

Następnie wyzeruj przesunięcie wzmacniacza i ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe. Następnie dostosuj ukośne oświetlenie w podczerwieni, aby uzyskać wyraźny widok mózgu. Teraz, wywierając nadciśnienie na pipetę, zbliż się do celi z pipetą.

Po nawiązaniu kontaktu z kuwetą zwolnij nadciśnienie, aby uszczelnić pipetę do membrany. Następnie ustaw potencjał utrzymywania membrany na minus 60 miliwoltów. A pipeta powinna tworzyć gigaomowe uszczelnienie z błoną komórkową.

Prąd podtrzymania powinien spaść do tak niskiego poziomu sub-pikoamperowego. Aby uzyskać stałe uszczelnienia gigaomowe, upewnij się, że pipeta jest czysta, utrzymując nadciśnienie i unikając uderzania w tkankę lub zbliżania się do komórek. Aby kontynuować, ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe od minus 50 do minus 60 miliwoltów.

Impulsy testowe ujawnią duży pojemnościowy stan przejściowy reprezentujący prąd niezbędny do naładowania pipety krosowej. Aby usunąć pojemnościową przejściowość, wyreguluj pokrętła kompensacji pojemności na amplifier. Teraz zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać błonę komórkową i uzyskać całą konfigurację komórki.

Duży wzrost pojemnościowej przejściowości wskazuje na sukces. Należy również zaobserwować niewielki wzrost prądu trzymania. Następnie ustaw wzmacniacz w trybie cęgów prądowych.

I dostosuj potencjał ogniwa do zakresu od minus 50 do minus 60 miliwoltów. W ramach przygotowań skonfiguruj system akwizycji danych zgodnie ze wskazaniami w protokole technicznym. System wymaga czerwonej diody LED o dużej mocy umieszczonej pod preparatem, umieszczonej tak, aby oświetlić muchę z mocą 0,238 miliwata na milimetr kwadratowy.

Teraz aktywuj neurony presynaptyczne optogenetycznie, używając pulsacyjnego czerwonego światła w ekspresji csChrimson. Można również zastosować inne metody. Przed zastosowaniem tetrodotoksyny powinno być widoczne połączenie synaptyczne w odpowiedzi na 40-milisekundowy impuls świetlny.

Brak odpowiedzi oznacza, że połączenie jest mało prawdopodobne. Potencjał trzymania można dostosować tak, aby odpowiednio podkreślić połączenia pobudzające lub hamujące. Po zweryfikowaniu połączenia ustaw obfitość soli fizjologicznej do recyrkulacji w soli fizjologicznej.

Ustaw pompę tak, aby poziom soli fizjologicznej w wannie pozostał stabilny. Następnie dodaj do systemu wystarczającą ilość tetrodotoksyny, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromola. To powinno zatrzymać gwałtowną aktywność neuronu z łatką.

Jeśli nie, dodaj więcej tetrodotoksyny do systemu. Teraz zastosuj krótkie impulsy czerwonego światła, aby aktywować to, co prawdopodobnie będzie połączeniem monosynaptycznym. Następnie kontynuuj dodawanie farmakologicznych antagonistów do recyrkulacyjnej soli fizjologicznej, aby przetestować chemiczną naturę połączeń synaptycznych.

Transgeniczna ekspresja tetrodotoksyny we wrażliwym kanale sodowym notchback ratuje pobudliwość neuronów i skutkuje dużym potencjałem plateau. Interneurony w płacie czułkowym reagują na zapachy. Jednak pobudzające prądy postsynaptyczne nie są łatwo rozwiązane w somie.

Czy więc odpowiedzi wynikają bezpośrednio z danych wejściowych neuronów receptora węchowego? Użycie tERP ujawnia, że neurony receptorów węchowych tworzą bezpośrednie połączenia z lokalnymi interneuronami. Stymulacja neuronów serotoninergicznych w płacie czułkowym powoduje mieszaninę pobudzenia i hamowania w lokalnych interneuronach.

Zastosowanie metysergidu, szerokiego antagonisty receptora 5HT, blokowało powolną hiperpolaryzację, ale nie miało wpływu na depolaryzację, podczas gdy mekamylamina blokuje szybką depolaryzację. Sugeruje to, że stymulacja jest cholinergiczna. tERP zastosowano w celu rozwiązania pozasynaptycznej transmisji objętościowej, która występuje za pomocą GABA lub neuromodulatorów.

W jednym z przykładów zastosowanie tetrodotoksyny nie stłumiło sygnału hamującego w lokalnym interneuronie. Hamowanie to zostało zablokowane za pomocą antagonisty serotoniny, metysergidu, co sugeruje bezpośredni sygnał ze specyficznego neuronu serotoninergicznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać nagrania całych komórek z neuronów drosophila i ocenić ich przewodnictwo za pomocą tERP.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o cierpliwości i wielokrotnym ćwiczeniu trudnej sekcji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak farmakologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak natura synapsy chemicznej.

Nie zapominaj, że praca z tetrodotoksyną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca z małymi objętościami.