Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Ogólnym celem tego podejścia jest bezpośrednia ocena funkcji oddechowej komórek beta trzustki w warunkach stymulacji insuliny. Można to również wykorzystać do obserwacji wpływu różnych związków na funkcję oddechową komórek beta. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii komórek beta trzustki, takie jak to, czy pewien związek wpływa na funkcję komórek beta trzustki poprzez zmiany w oddychaniu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do bezpośredniej oceny funkcji oddechowej w komórkach beta trzustki, w warunkach podstawowych i insulinoskopujących. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania komórek i obsługi maszyny są trudne do nauczenia się ze względu na wymaganą precyzję w przygotowaniu komórek i pomiarze oddychania. Na początek pochówka komórek beta 832/13 pochodzących z INS-1 w uzupełnionym RPMI 1640.

Usuń komórki z kolby T75, dodając dwa mililitry 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zneutralizuj trypsynę, dodając osiem mililitrów kompletnego podłoża RPMI 1640. Rozcieńczyć 100 mikrolitrów objętości komórki w 900 mikrolitrach PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Następnie ułóż komórki w gęstości miliona komórek na mililitr w 10-centymetrowym naczyniu. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przed rozpoczęciem eksperymentów z oddychaniem. Zmień pożywkę 24 godziny po posianiu i wyhodowaniu komórek 832/13 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Następnie potraktuj komórki kontrolą nośnika lub monomerem epikatechiny pochodzącym z kakao, aby uzyskać końcowe stężenie 100 nanomolowców. Następnie należy dodać posiew z kulturą przez dodatkowe 24 godziny w nawilżanym inkubatorze, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnie umyj komórki w 1x buforze do testów o niskim wydzielaniu glukozy lub SAB przez pięć minut.

Odessać bufor i inkubować komórki w 1x SAB o niskiej glukozie przez trzy godziny, zmieniając bufor co godzinę. Po inkubacji usuń komórki z naczynia za pomocą jednego mililitra 0,25% trypsyny. Połącz komórki w trypsynie z naczynia poddanego działaniu kontroli pojazdu z czterema mililitrami SAB w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Podobnie połącz danie potraktowane interesującym związkiem z buforem. Rozcieńczyć 100 mikrolitrów objętości komórki w 900 mikrolitrach PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć 100 mikrolitrów objętości komórki w 900 mikrolitrach PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Z danych wynika, że stężenie miliona komórek na mililitr jest najbardziej efektywne. Po przygotowaniu respirometru o wysokiej rozdzielczości, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj 2,4 mililitra 1x buforu SAB o niskiej zawartości glukozy do każdej komory oksygraficznej. Mieszać bufor w sposób ciągły za pomocą mieszadeł magnetycznych w komorze przy prędkości 750 obr./min i temperaturze 37 stopni Celsjusza, z interwałem zapisu danych wynoszącym 2,0 sekundy.

Aby to zrobić, wybierz przycisk F7 i otwórz kartę oznaczoną systemy. Wciśnij tłoki do końca, a następnie cofnij je do ustawienia napowietrzania klucza. Pozwól maszynie zrównoważyć się przez co najmniej jedną godzinę, aż do uzyskania stabilnego strumienia tlenu.

Następnie ustaw maszynę na 37 stopni Celsjusza na czas trwania eksperymentu. Naciśnij przycisk F7 i otwórz zakładkę oznaczoną Tlen O2, aby ustawić napięcie polaryzacji na 800 miliwoltów ze wzmocnieniem dwóch. Równoważyć stężenie tlenu w buforze SAB przez co najmniej 30 minut, aż zmiana stężenia tlenu ustabilizuje się.

Następnie wybierz region, w którym zmiana stężenia tlenu jest stabilna, aby ustalić pomiar tła zmiany stężenia tlenu, naciskając Shift, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając myszą po wybranym regionie. Kliknij na literę powiązaną z wybranym regionem i zmień ją na R1 dla każdego śladu odpowiadającego każdej z dwóch komór. Kliknij dwukrotnie pole kalibracji O2 w lewym i prawym dolnym rogu ekranu.

Kliknij przycisk Wybierz Oznacz dla kalibracji powietrza jako R1, a następnie wybierz kalibrację i kopiuj do schowka dla obu komór. Następnie załaduj 2,4 mililitra próbki do każdej komory, ładując jedną komorę komórkami traktowanymi pojazdem kontrolnym i jedną komorę komórkami traktowanymi związkami w 1x SAB o niskiej stężeniu glukozy. Wcisnąć tłok do końca i zassać pozostałą objętość.

Mieszaj komórki w sposób ciągły przez cały eksperyment przy 750 obr./min i 37 stopniach Celsjusza dla wszystkich kolejnych etapów. Utwórz znak, klikając F4 i oznaczając znacznik jako komórki po załadowaniu próbek. Mierzyć próbki przez 30 minut.

Po ustabilizowaniu sygnału należy wybrać obszar zmiany stężenia tlenu odpowiadający warunkom niskiego stężenia glukozy. Następnie dodaj 12,5 mikrolitra 45% sterylnego roztworu glukozy do każdej komory przez tytanowy port ładowania za pomocą strzykawki. Zaznacz glukozę w oznaczeniu po dodaniu leku.

Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. W tym momencie wybierz obszar zmiany stężenia tlenu, który ma reprezentować odczyt glukozy 16,7 milimolowego, który odpowiada warunkom stymulującym. Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodaj jeden mikrolitr pięciomilimolowej oligomycyny A do każdej komory przez port ładowania.

Zrób znak oznaczony jako OligoA po dodaniu leczenia. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. Po osiągnięciu stabilnego strumienia tlenu wybierz ten obszar krzywej.

Oligomycyna A hamuje syntazę ATP, a zatem jedyny zachodzący strumień tlenu odbywa się poprzez wyciek elektronów, a nie fosforylację oksydacyjną. Następnie dodawaj jeden milimolowy FCCP w krokach co jeden mikrolitr, aż do ustalenia maksymalnej częstości oddychania. Reprezentuje to maksymalne oddychanie niesprzężone.

Od trzech do czterech mikrolitrów FCCP wystarcza do wywołania maksymalnego niesprzężonego oddychania komórek beta 832/13 pochodzących z INS-1. Zrób znak oznaczony FCCP po dodaniu leczenia. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu.

Następnie wybierz ten obszar krzywej. FCCP jest środkiem rozprzęgającym, umożliwiającym pomiar oddychania niesprzężonego. Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodaj jeden mikrolitr pięciomilimolowej antymycyny A do każdej komory przez port ładowania.

Zrób znak oznaczony jako AntiA po dodaniu leczenia i powtórz procedurę wyboru krzywej. Wprowadź liczbę komórek na mililitr użytych w teście, naciskając przycisk F3 w programie do analizy respirometru. Zmień jednostki na komórki na mililitr, wprowadź stężenie komórkowe i zmień pożywkę na SAB.

Wybierz odczyty tła, aby znormalizować dane, wybierając i wprowadzając do formularza kalibracji tlenu. Dokonaj wyboru odczytów z 2,5 milimolowej glukozy, 16,7 milimolowej glukozy, oligomycyny A, FCCP i antymycyny A. W programie analizy respirometru wprowadź stężenie białka i wybierz odpowiednie średnie wartości dla każdego zabiegu podczas pomiaru oddechu. Następnie kliknij F2 i kliknij funkcję kopiowania do schowka.

W ten sposób dane zostaną wyeksportowane do wykorzystania w innych programach analitycznych. Do obliczeń należy użyć ujemnych wartości nachylenia O2. Skompiluj dane dla trzech do pięciu niezależnych serii kontrolnych traktowanych nośnikiem i komórek traktowanych związkami naturalnymi, aby określić wpływ na nienaruszone oddychanie komórkowe komórek beta 832/13 pochodzących z INS-1.

Nienaruszone komórki beta 832/13 pochodzące z INS-1 wykazują wzrost wykorzystania tlenu wywołany glukozą. Bardzo ważne jest, aby używana była odpowiednia liczba komórek. Wyniki zebrane w tym eksperymencie pokazują, że milion komórek na mililitr to optymalna ilość.

Komórki beta 832/13 pochodzące z INS-1 leczone kurkuminą nie wykazują zmian w ogólnym oddychaniu. I odwrotnie, komórki beta 832/13 pochodzące z INS-1 leczone monomerycznymi epikatechinami kakaowymi miały zwiększone oddychanie przy 2,5 milimolowej glukozie i 16,7 milimolowej glukozie. Wzmożone oddychanie obserwuje się również w stanie nieszczelności, czyli podstawowym, niefosforylującym stanie oddechowym, a także w oddychaniu systemu transportu elektronów lub w stanie ETS, czyli oddychaniu maksymalnym

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpośrednio ocenić funkcję oddechową komórek beta trzustki w warunkach stymulacji insuliny. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wstępnym potraktowaniu komórek buforem SAB o niskim poziomie glukozy i uzyskaniu dokładnej liczby komórek do testu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z uzyskaniem odpowiedniej liczby komórek do skutecznych pomiarów. Przy zbyt wielu ogniwach sygnał jest trudny do oceny, a przy zbyt małej liczbie sygnał nie jest wystarczająco wysoki, aby można go było konsekwentnie mierzyć. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnozę cukrzycy i każdego stanu, na który wpływają zmiany w funkcji komórek beta trzustki, ponieważ oddychanie mitochondrialne jest kluczowym elementem działania wydzielania insuliny.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaki jest wpływ tych związków na wydzielanie insuliny? Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję komórek beta, można ją również zastosować do innych układów, takich jak analizy mięśni, wątroby, tkanki tłuszczowej i innych mitochondrialnych układów oddechowych.