Name: Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do badania funkcji mitochondriów komórek beta trzustki w warunkach stymulacji insulinowej. Ta metoda pozwala ocenić wpływ związków naturalnych na oddychanie komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratoriów Tessem i Hancock za asystę i naukową dyskusję. Autorzy dziękują dr Andrew Neilsonowi (Virginia Tech) za dostarczenie frakcji monomeru epikatechiny pochodzącej z kakao. Badanie to zostało wsparte grantem z Fundacji Badań i Edukacji nad Działaniami na rzecz Cukrzycy dla JST.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla INS-1 pochodząca z 832/13 komórek beta w RPMI 1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną, 10 mM HEPES, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu9,10,11,12,13.</li>
	<li>Usunąć komórki 832/13 z kolby T75 za pomocą 2 ml 0,25% trypsyny, inkubując w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zneutralizować trypsynę, dodając 8 ml pełnej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz 100 μl objętości komórki z kroku 1.2 w 900 μl PBS.</li>
	<li>Płytka 832/13 komórek o gęstości 2 x 106 komórek/ml w naczyniu 6-dołkowym.</li>
	<li>Hodować komórki przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed rozpoczęciem eksperymentów z oddychaniem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do respirometrii wysokorozdzielczej
<ol>
	<li>Traktowanie komórek 832/13 monomerem epikatechiny pochodzącym z kakao.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek 832/13 przez 24 godziny po posianiu w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zmienić pożywkę 24 godziny po posiewie i potraktować komórki 832/13 kontrolą nośnika (3 dołki) lub monomerem kakaowym 100 nM (3 dołki), a następnie hodować przez dodatkowe 24 godziny (łącznie 48 godzin) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Umyj komórki 832/13 w 1x buforze do testów o niskim wydzielaniu glukozy (SAB) przez 5 minut. Odsysaj bufor i inkubuj 832/13 komórek w 1x SAB o niskim poziomie glukozy przez 3 godziny, zmieniając 1x SAB o niskiej glukozie co godzinę.
		<ol>
			<li>Wykonać 10x SAB z 33,32 g NaCl, 1,73 g KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 gMgSO4 i dodaćH2Odo końcowej objętości 500 ml. Sterylny filtr końcowego roztworu.</li>
			<li>Przygotować 1x SAB o niskiej zawartości glukozy z 10 ml 10x SAB, 100 μL 45% glukozy, 2 ml 1 M HEPES, 1 ml 0,25M CaCl2, 0,57 ml 35% roztworu BSA, 0,21 g NaHCO3 i dodaćH2Odo końcowej objętości 100 ml. Sterylny filtr końcowego roztworu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie 832/13 komórek kurkuminą.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek 832/13 przez 48 godzin po posianiu w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Myj komórki 832/13 w 1x SAB o niskiej glukozie przez 5 minut. Odsysaj bufor i inkubuj 832/13 komórek w 1x SAB o niskiej glukozie przez 3 godziny, zmieniając 1x SAB o niskiej glukozie co godzinę.</li>
		<li>Po 2,5 h z 3 h inkubacji w 1x Low Glucose SAB, odaspiruj bufor i inkubuj komórki w 1x Low Glucose SAB z kontrolą nośnika lub 40 μM kurkuminą przez 30 min. Po inkubacji odessać bufor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek za pomocą trypsyny do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
	<ol>
		<li>Po 3 godzinnej inkubacji w 1x SAB o niskiej zawartości glukozy, usuń komórki z płytki z 250 μl 0,25% trypsyny na dołek.</li>
		<li>Połącz komórki w trypsynie z 3 studzienek potraktowanych kontrolą nośnika lub związkiem będącym przedmiotem zainteresowania z 4 ml SAB w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć 100 μl objętości komórki z kroku 2.3.2 w 900 μl PBS.</li>
		<li>Rozcieńczyć odpowiednią liczbę komórek w 1x Low Glucose SAB, aby uzyskać 3 ml w odpowiednim stężeniu dla każdej komory. Dane pokazują, że stężenie 1 x 106 komórek/ml jest najskuteczniejsze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek z dysocjacją mechaniczną do respirometrii o wysokiej rozdzielczości
	<ol>
		<li>Po 3 godzinnej inkubacji w 1x SAB o niskiej zawartości glukozy, dodaj 1 ml 1x SAB o niskiej zawartości glukozy do każdego dołka i delikatnie zdmuchnij komórki z płytki za pomocą dysocjacji mechanicznej, pipetując końcówką do pipety o pojemności 1000 μl.</li>
		<li>Połącz komórki z 3 studzienek potraktowanych kontrolą nośnika lub związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w sumie 3 ml SAB w stożkowej probówce o pojemności 15 ml do oddychania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Respirometria o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Przygotowanie respirometru o wysokiej rozdzielczości.
	<ol>
		<li>Włącz respirometr o wysokiej rozdzielczości i połącz się z pulpitem, uruchamiając program do analizy respirometru.</li>
		<li>Odessać 70% etanolu z obu komór. Namocz te komory w 70% etanolu przez minimum 45 minut.</li>
		<li>Umyj komory dwukrotnie 70% etanolem, odsysając po każdym kroku.</li>
		<li>Przemyć komory trzykrotnie ddH2O, odsysając po każdym kroku.</li>
		<li>Przepłukać tłoki komory w ddH2O. To usuwa resztki etanolu z tłoków i z tytanowego portu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja polarograficznych czujników tlenu.
	<ol>
		<li>Dodać 2,4 ml 1x buforu SAB o niskiej zawartości glukozy do każdej komory oksygraficznej, mieszając bufor w sposób ciągły za pomocą mieszadeł magnetycznych w komorze przy 750 obr./min i 37 °C z interwałem zapisu danych co 2,0 s, naciskając przycisk F7 i otwierając zakładkę oznaczoną "Systemy". Wciśnij tłoki do końca, a następnie cofnij się do ustawienia napowietrzania klucza. Pozwól maszynie zrównoważyć się przez co najmniej 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnego strumienia tlenu.</li>
		<li>Ustaw maszynę na 37 °C na czas trwania eksperymentu. Ustaw napięcie polaryzacji na 800 mV, ze wzmocnieniem 2, naciskając przycisk F7 i otwierając zakładkę oznaczoną "Tlen, O2". Równoważyć stężenie tlenu w buforze SAB przez co najmniej 30 minut, podczas gdy zmiana stężenia tlenu jest stabilna (mniej niż 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Po ustabilizowaniu się stężenia tlenu wybierz obszar, w którym zmiana stężenia tlenu jest stabilna, aby ustalić pomiar tła zmiany stężenia tlenu.
		<ol>
			<li>Wybierz region, naciskając Shift, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając myszą po wybranym regionie. Kliknij na literę powiązaną z wybranym regionem i zmień na "R1" dla każdej ścieżki, odpowiadającej każdej z dwóch komór.</li>
			<li>Kliknij dwukrotnie pole "Kalibracja O2" w lewym i prawym dolnym rogu ekranu, kliknij przycisk "wybierz znak" dla "kalibracji powietrza" jako R1, a następnie wybierz "kalibruj i kopiuj do schowka" dla obu komór.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena oddychania komórek beta 832/13 przygotowanych w krokach 2.1.5 lub 2.2.5.
	<ol>
		<li>Załaduj 2,4 ml próbki do każdej komory (jedna komora z komórkami traktowanymi nośnikiem kontrolnym, jedna komora z komórkami traktowanymi związkami) do 1x SAB o niskiej zawartości glukozy. Zachować 0,5 ml próbki komórkowej do ilościowego oznaczania białka za pomocą testu BCA (kwas bicinchoninowy) w przypadku stosowania metody dysocjacji mechanicznej (zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszego pomiaru).
		<ol>
			<li>Wcisnąć tłok do końca i zassać pozostałą objętość. Mieszać komórki w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu w temperaturze 750 obr./min i w temperaturze 37 °C dla wszystkich kolejnych etapów. Zaznacz go, klikając F4 i oznaczając go jako "komórki" po załadowaniu próbek.</li>
			<li>Mierzyć próbki przez 30 minut. Po ustabilizowaniu sygnału należy wybrać obszar zmiany stężenia tlenu odpowiadający warunkom niskiego stężenia glukozy (2,5 mM glukozy) zgodnie z opisem w ppkt 3.2.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodaj 12,5 μl 45% sterylnego roztworu glukozy (16,7 mM stężenie końcowe) do każdej komory przez tytanowy port ładowania za pomocą strzykawki. Zaznaczyć zmierzoną wartość "Glukoza" zgodnie z opisem w ppkt 3.3.1 po dodaniu substancji. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. Należy wybrać ten obszar zmiany stężenia tlenu, jak opisano w ppkt 3.2.3. Jest to odczyt glukozy 16,7 mM i odpowiada warunkom stymulującym7.</li>
		<li>Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodać 1 μL 5mM oligomycyny A (stężenie końcowe 2,5 μM) do każdej komory przez port ładowania. Wykonać znak o zmierzonej wartości "OligoA" zgodnie z opisem w ppkt 3.3.1 po dodaniu substancji. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. Wybierz ten obszar krzywej zgodnie z opisem w ppkt 3.2.3. Oligomycyna A hamuje syntazę ATP, a zatem jedyny strumień tlenu zachodzący odbywa się poprzez wyciek elektronów, a nie fosforylację oksydacyjną7.</li>
		<li>Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodawać 1 mM FCCP w odstępach co 1 μl, aż do ustalenia maksymalnej częstości oddychania. Reprezentuje to maksymalne oddychanie niesprzężone. Między 3-4 μL FCCP jest wystarczające (1,5-2,0 μM stężenie końcowe), aby indukować maksymalne oddychanie niesprzężone komórek INS-1 832/13. Zrób znak oznaczony "FCCP" zgodnie z opisem w ppkt 3.3.1 po dodaniu leczenia. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. Wybierz ten obszar krzywej zgodnie z opisem w ppkt 3.2.3. FCCP jest środkiem rozprzęgającym. To pozwala nam mierzyć oddychanie niesprzężone7.</li>
		<li>Po osiągnięciu stabilizacji sygnału dodać 1 μL 5 mM antymycyny A (stężenie końcowe 2,5 μM) do każdej komory przez port ładowania. Wykonać znak oznaczony jako "AntiA", jak opisano w ppkt 3.3.1, po dodaniu leku. Pozwól, aby sygnał ustabilizował się i rejestruj oddychanie komórkowe, aż do osiągnięcia stabilnego strumienia tlenu. Wybierz ten obszar krzywej zgodnie z opisem w 3.2.3. 
		Uwaga: Antymycyna A wiąże reduktazę cytochromu C, hamuje utlenianie ubichinonu i blokuje całe oddychanie. To pozwala nam całkowicie zatrzymać oddychanie7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar 832/13 komórek beta pod kątem stężenia białka i normalizacji oddychania.
	<ol>
		<li>Korzystając z 0,5 ml próbki zatrzymanej podczas ładowania, zmierz próbkę białka za pomocą metody BCA13.</li>
		<li>Każdą próbkę należy rozprowadzić trzykrotnie, bez rozcieńczania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczenia oddychania komórek beta 832/13 z komórek trypsynizowanych.
	<ol>
		<li>Wprowadź liczbę komórek na ml użycia w teście, naciskając przycisk F3 w programie do analizy respirometru. Zmień jednostki na komórki/ml, wprowadź stężenie komórkowe i zmień pożywkę na SAB.</li>
		<li>Wybierz odczyty tła, aby znormalizować dane, wybierając i wprowadzając do formularza kalibracjiO2 zgodnie z opisem w 3.2.3.</li>
		<li>Dokonaj wyboru odczytów z 2,5 mM glukozy, 16,7 mM glukozy, oligomycyny A, FCCP i antymycyny A, jak opisano w 3.3.1.</li>
		<li>W ramach programu do analizy respirometrycznej eksportuj odczyty dla każdej komory po wprowadzeniu stężenia białka i wybraniu odpowiednich wartości średnich dla każdego zabiegu podczas pomiaru oddechu. Odbywa się to poprzez kliknięcie F2, a następnie naciśnięcie funkcji "kopiuj do schowka". W ten sposób dane zostaną wyeksportowane do wykorzystania w innych programach analitycznych. Do obliczeń należy użyć wartości "O2 neg nachylenia".</li>
		<li>Skompiluj dane dla 3-5 niezależnych serii kontrolnych traktowanych nośnikiem i komórek traktowanych związkami naturalnymi, aby określić wpływ komórek beta INS-1 832/13 na nienaruszone oddychanie komórkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>832/13 Obliczenia oddychania komórek beta z komórek zdysocjowanych mechanicznie.
	<ol>
		<li>Wprowadź obliczenia białka z testu BCA, naciskając przycisk F3 w programie do analizy respirometru. Zmień jednostki na mg, wprowadź stężenie BCA i zmień pożywkę na SAB.</li>
		<li>Wybierz odczyty tła, aby znormalizować dane, wybierając i wprowadzając do formularza kalibracjiO2 zgodnie z opisem w 3.2.3.</li>
		<li>Dokonaj wyboru odczytów z 2,5 mM glukozy, 16,7 mM glukozy, oligomycyny A, FCCP i antymycyny A, jak opisano w 3.3.1.</li>
		<li>W ramach programu do analizy respirometrycznej eksportuj odczyty dla każdej komory po wprowadzeniu stężenia białka i wybraniu odpowiednich wartości średnich dla każdego zabiegu podczas pomiaru oddechu. Odbywa się to poprzez kliknięcie F2, a następnie naciśnięcie funkcji "kopiuj do schowka". W ten sposób dane zostaną wyeksportowane do wykorzystania w innych programach analitycznych. Do obliczeń należy użyć wartości "O2 neg nachylenia".</li>
		<li>Skompiluj dane dla 3-5 niezależnych serii kontrolnych traktowanych nośnikiem i komórek traktowanych związkami naturalnymi, aby określić wpływ komórek beta INS-1 832/13 na nienaruszone oddychanie komórkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC2+%28GLUT%29+family+of+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li>
<li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li>
<li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+cocoa+catechins+enhance+%CE%B2-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li>
<li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells%3A+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558(2015).</li>
<li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li>
<li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854(2015).</li>
<li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804(2016).</li>
<li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities%2C+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li>
<li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204(2017).</li>
<li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li>
<li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li>
<li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623989/">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li>
<li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tego protokołu jest wykorzystanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru częstości oddechów w nienaruszonych komórkach beta trzustki. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi komórek beta na zwiększony poziom glukozy. Protokół pozwala również na wstępne traktowanie różnymi związkami, jak wykazano w tym protokole z naturalnie występującą monomeryczną epikatechiną lub kurkuminą 4,5. Leczenie różnymi innymi związkami ...

Głównym celem komórki beta trzustki jest utrzymanie systemowej normoglikemii poprzez stymulowane glukozą wydzielanie insuliny. Komórki beta wyczuwają fizjologiczne zmiany w krążącej glukozie, głównie dzięki transporterowi glukozy o niskim powinowactwie i dużej pojemności GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Wraz ze wzrostem poziomu glukozy w krążeniu, ten transporter o dużej pojemności i niskim powinowactwie ułatwia proporcjonalny wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu glukozy w komórce beta. Glukoza jest metabolizowana poprzez glikolizę, cykl TCA (cykl kwasów trikarboksylowych) i oddychanie mitochondrialne, co powoduje podwyższony poziom ATP (adenozynotrójfosforanu). Podwyższone stężenie ATP blokuje wrażliwe na ATP kanały K+, powodując depolaryzację błony. Depolaryzacja błony powoduje otwarcie bramkowanych napięciem kanałów Ca2+, a następnie uwolnienie granulek insuliny związanych z pęcherzykami2. Dysfunkcja komórek beta jest cechą charakterystyczną cukrzycy typu 2 (T2D) i skutkuje zmniejszonym i słabo kontrolowanym wydzielaniem insuliny, a ostatecznie śmiercią komórek beta3. Mechanizmy, które utrzymują lub poprawiają funkcję komórek beta, mogą być stosowane w leczeniu cukrzycy typu 2.
Badania wykazały korzystny wpływ naturalnie występujących związków roślinnych na komórkę beta trzustki4. Związki te mogą mieć swój wpływ poprzez zwiększenie proliferacji komórek beta, przeżycia lub stymulowanego glukozą wydzielania insuliny. Na przykład, ostatnie badania wykazały, że monomeryczna epikatechina zwiększa wydzielanie insuliny stymulowane przez glukozę poprzez zwiększenie oddychania mitochondrialnego i zwiększenie poziomu ATP w komórkach5. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób związki te mogą zwiększać funkcjonalną masę komórek beta, jest ważne, aby wykorzystać te związki jako potencjalne środki terapeutyczne.
Oddychanie komórkowe można zmierzyć za pomocą wielu narzędzi. Użycie respirometru o wysokiej rozdzielczości pozwala na miareczkowanie modulatorów chemicznych do przepuszczalnej lub nienaruszonej populacji komórek6. Narzędzie to pozwala na dodawanie różnych związków, w różnych stężeniach, dając w ten sposób szeroki wachlarz informacji.
Biorąc pod uwagę ścisły związek między metabolizmem glukozy a funkcją komórek beta, pomiary oddychania komórkowego są krytyczne. Pomiary oddychania komórkowego można wykonać przy użyciu przepuszczalnych lub nienaruszonych komórek beta, z których każda ma swój własny zestaw zalet i wad7,8. Podczas gdy przenikanie komórek beta pozwala na pomiar różnych aspektów łańcucha transportu elektronów, robi to bez względu na mechanizm indukowania oddychania w komórce beta, wychwyt glukozy i metabolizm. Dlatego zastosowanie nieprzepuszczalnego oddychania komórkami beta jest bardzo przydatną techniką określania odpowiedzi komórek beta na różne poziomy glukozy, wykorzystując zużycie tlenu jako odczyt.
Celem tej techniki jest pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach beta pochodzących z INS-1 832/13. Technika ta pozwala nam określić odpowiedź komórek beta na niestymulujące warunki glukozy (2,5 mM glukozy), a także stymulujące warunki glukozy (16,7 mM glukozy). Podczas gdy nieprzepuszczalne komórki nie pozwalają nam na indywidualne testowanie kompleksu I, II lub III łańcucha transportu elektronów, technika ta pozwala na pomiary dotyczące hamowania kompleksu IV (oligomycyna A), oddychania niesprzężonego (FCCP-cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon) i całkowicie zahamowanego oddychania (antymycyna A). Badanie to pokazuje skuteczność pomiaru oddychania w nienaruszonych nieprzepuszczalnych komórkach beta trzustki, a także wpływ dwóch naturalnie występujących związków, monomerycznej epikatechiny i kurkuminy, na oddychanie komórek beta.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Program komputerowy do analizy respirometrii o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Linia komórkowa INS-1 832/13</td><td>Centrum Medyczne Uniwersytetu Duke'a</td><td>BRAK</td><td>Linia komórkowa beta, dar od dr Christophera Newgarda</td></tr><tr><td>Kurkumina</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Wstępne leczenie komórek beta</td></tr><tr><td>Monomer epikatechiny kakaowej</td><td>Virginia Polytechnic Institute i Uniwersytet Stanowy</td><td>BRAK</td><td>Wstępna obróbka komórek beta, prezent od dr Andrew Neilsona</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 pożywka dla komórek beta</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 składnik pożywki dla komórek beta</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 składnik pożywki dla komórek beta</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 składnik pożywki dla komórek beta / 1x bufor SAB</td></tr><tr><td>Keson glutaminy</td><td></td><td>GLL01</td><td>832/13 składnik pożywki dla komórek beta</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 składnik pożywki dla komórek beta</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 składnik pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>beta NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Składnik 10x bufor SAB</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Składnik 10x bufor SAB</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Składnik 10x buforu SAB</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Składnik 10x bufor SAB</td></tr><tr><td>D-(+)-roztwór glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Składnik 1x buforu SAB, chemiczny do oznaczania oddychania</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Składnik 1x bufor SAB</td></tr><tr><td>35% roztwór BSA</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Składnik 1x bufor SAB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Składnik 1x bufor SAB</td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Mycie oksygrafu O2k Komory</td></tr><tr><td>Oligomycyna A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemikalia do oznaczania oddychania</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemikalia do oznaczania oddychania</td></tr><tr><td>Anitmycyna A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemikalia do oznaczania oddychania</td></tr><tr><td>Zestaw białkowy BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Do oznaczania stężenia białka</td></tr></tbody></table>

respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez izolowane mitochondria, komórki i tkanki. Komórki beta odgrywają kluczową rolę w organizmie, kontrolując poziom glukozy we krwi poprzez wydzielanie insuliny w odpowiedzi na podwyższone stężenie glukozy. Wydzielanie insuliny jest kontrolowane przez metabolizm glukozy i oddychanie mitochondrialne. Dlatego pomiar nienaruszonego oddychania komórek beta jest niezbędny, aby móc poprawić funkcję komórek beta w leczeniu cukrzycy. Korzystając z nienaruszonych komórek beta pochodzących z 832/13 INS-1, możemy zmierzyć wpływ wzrostu stężenia glukozy na oddychanie komórkowe. Protokół ten pozwala nam zmierzyć oddychanie komórek beta w obecności lub braku różnych związków, co pozwala określić wpływ danych związków na oddychanie nienaruszonych komórek. Tutaj pokazujemy wpływ dwóch naturalnie występujących związków, monomerycznej epikatechiny i kurkuminy, na oddychanie komórek beta w obecności warunków niskiego (2,5 mM) lub wysokiego (16,7 mM). Technika ta może być wykorzystana do określenia wpływu różnych związków na nienaruszone oddychanie komórek beta w obecności różnych stężeń glukozy.

Komórki beta INS-1 832/13 przygotowane i zebrane zgodnie z opisem w protokole wykażą modulację zużycia tlenu w zależności od zastosowanych interwencji chemicznych (Rysunek 1A). Wzrost respiracji zostanie zaobserwowany po zwiększeniu stężenia glukozy do 16.7 mM Glucose (Rysunek 1B). Respiracja spadnie po potraktowaniu nienaruszonych komórek oligomycyną A. Taka respiracja jest określana jako LEAK, co definiuje się jako podstawowy, niefosforylujący stan oddechowy. ...

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Ogólnym celem tego podejścia jest bezpośrednia ocena funkcji oddechowej komórek beta trzustki w warunkach stymulacji insuliny. Można to również wykorzystać do obserwacji wpływu różnych związków na funkcję oddechową komórek beta. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii komórek beta trzustki, takie jak to, czy pewien związek wpływa na funkcję komórek beta trzustki poprzez zmiany w oddychaniu.Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do bezpośredniej oceny funkcji oddechowej w komórkach beta trzustki, w warunkach podstawowych i insulinoskopujących. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania komórek i obsługi maszyny są trudne do nauczenia się ze względu na wymaganą precyzję w przygotowaniu komórek i pomiarze oddychania. Na początek pochówka komórek beta 832/13 pochodzących z INS-1 w uzupełnionym RPMI 1640.Usuń komórki z kolby T75, dodając dwa mililitry 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zneutralizuj trypsynę, dodając osiem mililitrów kompletnego podłoża RPMI 1640. Rozcieńczyć 100 mikrolitrów objętości komórki w 900 mikrolitrach PBS i po

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Tutaj pokazujemy, że komora 0,5 ml do respirometrii o wysokiej rozdzielczości pokazuje wyniki, które są zgodne z komorą 2,0 ml, jeśli zastosuje się odpowiednią instrumentalną korekcję tłaO2. Wymaga mniejszej próbki, co jest korzystne w przypadku badań o ograniczonej dostępności lub niskiej wydolności oddechowej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do badania funkcji mitochondriów komórek beta trzustki w warunkach stymulacji insulinowej. Ta metoda pozwala ocenić wpływ związków naturalnych na oddychanie komórkowe.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków (Wideo) | JoVE Journal

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Przeglądaj więcej filmów