Name: Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę oznaczania bromourydyną i immunoprecypitacji do pomiaru syntezy RNA w hodowlach komórkowych. Technika ta pozwala określić, czy zmiany poziomów RNA wynikają ze zmian w syntezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundacja Lundbeck, Uniwersytet w Aarhus, Dandrite i Lundbeck A/S wsparły tę pracę.

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej, i przechowuj na lodzie lub w lodówce (z wyjątkiem buforu elucyjnego zawierającego SDS). Protokół podzielony jest na 5 sekcji: Przygotowanie próbek RNA; przygotowanie koralików do IP; wiązanie RNA znakowanego BrU z kulkami; elucja i oczyszczanie związanego RNA znakowanego BrU za pomocą 3-etapowej ekstrakcji fenol-fenol/chloroform-chloroform; analiza RNA (w tym przykładzie z wykorzystaniem RT-qPCR)
1. Przygotowanie próbek RNA
<ol>
	<li>Policz HEK293T komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej 3 500 000 komórek na 10 cm szalce Petriego w 10 ml pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą i 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny), aby uzyskać łącznie >40 μg RNA po ekstrakcji 48 godzin później. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>48 godzin po wysiewie odessać 8 ml pożywki wzrostowej i pozostawić 2 ml, aby uniknąć wysuszenia komórek. Dodać 2 mM BrU i dowolną obróbkę do 8 ml aspirowanej pożywki wzrostowej i usunąć pozostałe 2 ml z komórek przed ponownym nałożeniem pożywki zawierającej 8 ml BrU. Należy unikać stosowania świeżych pożywek po nałożeniu BrU na komórki, ponieważ może to wywołać zmiany w ekspresji genów.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 1 godzinę z BrU i leczeniem. Umyj komórki w 5 ml buforze Hanka i trypsynizuj komórki za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny. Dodaj 8 ml pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję, przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj komórki przez 2 minuty przy 1,000 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i wyekstrahować całkowity RNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów) lub innej preferowanej metody, a następnie wymyć w H2O, wolnym od RNaz. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do kontynuowania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie koralików do IP
<ol>
	<li>Przygotować kulki w partiach w zależności od liczby próbek, które mają być badane, plus jedna dodatkowa w celu uwzględnienia strat podczas pipetowania i mieszania wirowego. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne anty-mysie IgG przez mieszanie wirowe i wyjąć 20 μl kulek na próbkę w probówce 1,5 ml wolnej od RNaz. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml w stojaku magnetycznym i pozostaw około 20 sekund, aby kulki zebrały się z boku.</li>
	<li>Usunąć supernatant, wyjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić w 400 μl 1x buforze BrU-IP przez pipetowanie. Wirować probówkę bardzo krótko przez 2 sekundy w wirówce stołowej, umieścić ją z powrotem w stojaku magnetycznym i usunąć supernatant. Powtórz krok prania raz.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie z koralikami za pomocą heparyny. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 1x BrU-IP+ 1 mg/ml buforu heparyny i pozostawić na 30 minut. Umyj koraliki raz, jak w kroku 2.2. 
	UWAGA: Heparyna jest ujemnie naładowanym polimerem, który będzie konkurował z RNA o wiązanie. tRNA lub inne nieistotne RNA mogą być również używane, jeśli dalsza aplikacja nie sekwencjonuje.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 1x bufor BrU-IP i dodać 1,25 μg / próbkę przeciwciała anty-α-bromodeoksyurydyny, które również rozpoznaje BrU. Inkubuj koraliki przez 1 godzinę podczas obracania lub przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj koraliki trzy razy, jak w kroku 2.2. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl / próbkę 1x bufor BrU-IP uzupełniony 1 mM BrU i pozostawić obracając się przez 30 minut, aby obniżyć czułość przeciwciała związanego z kulkami, a tym samym ryzyko niespecyficznego wiązania podczas IP.</li>
	<li>Umyć kulki trzy razy, jak w kroku 2.2, i ponownie zawiesić w 50 μl/próbkę buforze 1xBrU-IP.</li>
</ol>
3. Wiązanie znakowanego BrU RNA z koralikami
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenia RNA w ekstraktach RNA z kroku 1.3 za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie widzialnym i rozcieńczyć 40 μg RNA z każdej próbki w H2O wolnym od RNaz do całkowitej objętości 200 μl.</li>
	<li>Podgrzewać próbki RNA przez 2 minuty w temperaturze 80 °C w celu denaturacji RNA i krótko odwirować w wirówce stołowej. Dodać 200 μL 2x inhibitor BrU-IP+BSA/RNAzy.</li>
	<li>Dodać 50 μl ponownie zawieszonych i przygotowanych kulek z kroku 2.6 do każdej próbki i pozostawić na 1 godzinę do obrotu. Umyć kulki cztery razy, jak w kroku 2.2.</li>
</ol>
4. Elucja i oczyszczanie RNA za pomocą 3 etapów: ekstrakcja fenol-fenol/chloroform-chloroform
<ol>
	<li>Elutować RNA i przeprowadzić ekstrakcję fenolową
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnym w celu elucji RNA, a następnie szybko dodać 200 μl fenolu o pH 6,6 (UWAGA: Toksyczny, patrz uwaga poniżej kroku 4.1.2) w celu usunięcia wszelkich cząsteczek innych niż RNA z próbki.</li>
		<li>Wirowo wymieszać próbkę i wirować przez 3 minuty przy 25 000 x g w wirówce stołowej. 
		UWAGA: Fenol jest toksyczny i należy z nim obchodzić się pod wyciągiem w osłonie skóry. Lekko kwaśne pH zapewnia, że ekstrahowane jest tylko RNA, a nie DNA. RNA pozostanie w górnej fazie wodnej ze względu na hydrofilowy charakter ładunków. Hydrofobowe rdzenie białek wiążą fenol i przechodzą do niższej organicznej fazy fenolowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową
	<ol>
		<li>Odessać jak najwięcej górnej fazy (około 190 μl z 200 μl, w zależności od doświadczenia w obsłudze) i przenieść ją do probówki z 200 μl fenolu/chloroformu, pH 6,6 (UWAGA: Toksyczny, patrz uwaga). Upewnij się, że zasysasz tę samą ilość do wszystkich próbek.</li>
		<li>Wirować próbkę i wirować przez 3 minuty w temperaturze 25 000 x g. 
		UWAGA: Chloroform jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium z zachowaniem ochrony skóry. Chloroform jest dodawany w celu usunięcia fenolu, który może wpływać na dalszą analizę RNA poprzez hamowanie odwrotnej transkrypcji14 i reakcji łańcuchowych polimerazy15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję chloroformem, zasysając górną fazę wody wodnej jak poprzednio (teraz około 180 μl) i przenieść do probówki zawierającej 200 μl chloroformu. Wirować próbkę i wirować przez 3 minuty przy 25 000 x g.</li>
	<li>Odessać górną fazę wodną jak poprzednio (teraz około 170 μl) i przenieść ją do probówki zawierającej 17 μl (1/10 objętości) 3 M CH3COONa, pH 6,0. Aby zneutralizować i wytrącić RNA z roztworu wodnego, dodaj 2 μl glikogenu (20 mg/ml), który wytrąca się razem z RNA i sprawia, że osad RNA jest bardziej widoczny.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 96% etanolu, aby zwiększyć wiązanie jonów soli i RNA i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze -20 °C lub 15 minut na suchym lodzie.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 25 000 x g, 4 °C przez 30 minut. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i umyć osad w 185 μl 75% etanolu w celu usunięcia pozostałości soli. Wirować w temperaturze 25 000 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i pozostawić osad do wyschnięcia na 5-10 minut z otwartą pokrywą. Zawiesić w 10 μl H2O wolnym od RNaz nałożonym z boku probówki, aby uniknąć naruszenia osadu.</li>
</ol>
5. Analiza RNA
<ol>
	<li>Przygotować cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA (patrz tabela materiałów) lub innej preferowanej metody przy użyciu próbki 2 μl RNA i 1 μg całkowitego RNA drożdży jako nośnika RNA do reakcji syntezy cDNA (niestosowane, jeśli cDNA jest używane do sekwencjonowania nowej generacji). Użyj 1 μg RNA bez drożdżowego RNA do przygotowania cDNA odpowiedniego wejścia.</li>
	<li>Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:25 i zmieszać 9 μl rozcieńczonego cDNA z 10 μl qPCR Master mix i 1 μl sondy fluorogenicznej, oba określone w Tabeli Materiałów. 
	UWAGA: Rozcieńczenie cDNA zależy od zastosowanego preparatu cDNA i metody qPCR.</li>
	<li>Uruchom następujący program qPCR (np. w systemie 7500 Fast Real-time PCR lub równoważnym): 2 min w 50 °C, 20 s w 95 °C, 40 cykli po 3 s w 95 °C i 30 s w 60 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
<li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra%3A+Positive+and+negative+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li>
<li>Cooper, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+exosomal+siRNA+delivery+reduced+alpha-synuclein+aggregates+in+brains+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice.</a> Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li>
<li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li>
<li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li>
<li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose%3F+How+to+evaluate+its+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-2253-6_19">Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology</a>. 1262, 305-320 (2015).</li>
<li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Alkynyl-2%27-deoxyuridines%3A+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li>
<li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje zastosowanie BrU-IP do oznaczania produkcji RNA poprzez znakowanie nowo wytworzonego RNA przez 1 godzinę BrU, a następnie natychmiastową ekstrakcję RNA i immunoprecypitację RNA znakowanego BrU. Metoda ta została wcześniej opisana w odnośniku16, a ten artykuł zawiera kilka dodatkowych kroków w celu zwiększenia specyficzności IP i czystości RNA, poprzez wstępną obróbkę kulek o niskich stężeniach BrU, a także etap oczyszczania fenolowo-chloroformowego w celu zwiększenia czystości...

5-bromouridine (BrU) immunoprecypitacja (IP) pozwala na badanie produkcji RNA w komórkach bez lub z bardzo ograniczonym wpływem na fizjologię komórki podczas krótkiego okresu znakowania1,2. Metoda opiera się na włączeniu syntetycznej pochodnej urydyny BrU do nowo zsyntetyzowanego RNA, a następnie IP znakowanego RNA przy użyciu przeciwciał anty-BrU (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
Od dziesięcioleci wiadomo, że synteza białek może być regulowana transkrypcyjnie, a istnienie czynników transkrypcyjnych zostało postawione hipotezę ponad 50 lat temu3. Obecnie wiadomo, że wiele chorób jest spowodowanych rozregulowaniem transkrypcji i stabilności RNA (rysunek uzupełniający S1 w referencji4), a możliwość pomiaru zmian w produkcji RNA ma ogromne znaczenie w zrozumieniu rozwoju choroby.
Z drugiej strony, narzędzia do regulacji produkcji RNA dają nowe możliwości leczenia chorób spowodowanych zbyt małą lub zbyt dużą ekspresją białka, lub akumulacją białek, jak np. w chorobie Parkinsona (PD). Dominującym białkiem gromadzącym się w postaci nierozpuszczalnych agregatów w PD jest α-synukleina, a poziom α-synukleiny jest bezpośrednio związany z chorobą, ponieważ namnażanie się genu α-synukleiny powoduje rodzinną PD5. Ponadto α-synukleina agreguje się w sposób zależny od stężenia. Obniżenie poziomu mRNA α-synukleiny jest zatem interesującą strategią terapeutyczną, którą udało się osiągnąć przy użyciu interferencji RNA w celu zmniejszenia utraty komórek neuronalnych w modelach gryzoni PD6,7.
Ważne jest, aby móc mierzyć zmiany w produkcji RNA spowodowane chorobą lub interwencjami terapeutycznymi. Najnowocześniejsze metody pomiaru poziomów RNA w stanie stacjonarnym, takie jak odwrotna transkrypcja, a następnie ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR), nie są w stanie odróżnić zmian spowodowanych regulacją transkrypcji lub zmienioną stabilnością RNA. Szeroko stosowaną metodą badania szybkości rozpadu RNA jest blokowanie maszynerii transkrypcyjnej za pomocą związków takich jak α-amanityna lub aktynomycyna D, a następnie pomiary rozpadających się RNA. Istnieją jednak pewne problemy związane z ogólnym zablokowaniem transkrypcji w komórkach, takie jak indukcja apoptozy8,9. Oprócz efektów cytotoksycznych, inhibitory transkrypcji stwarzają również kilka problemów technicznych, takich jak powolny wychwyt komórkowy α-amantyny i brak swoistości aktynomycyny D (przegląd w reference10).
Aby uniknąć ogólnego zablokowania transkrypcji, użyto analogów nukleotydów, takich jak 5-etynylourydyna (5-EU), 4-tiourydyna (4-TU) i BrU. Są one łatwo wchłaniane przez komórki ssaków i włączane do nowo zsyntetyzowanego RNA, umożliwiając znakowanie impulsowe RNA w określonym czasie. BrU jest mniej toksyczny niż 5-EU i 4-TU, co czyni go preferowanym analogiem z wyboru11,12.
BrU-IP może być używany do badania zarówno szybkości syntezy RNA, jak i stabilności, a tym samym do rozróżniania podstawowych przyczyn zmian w całkowitym RNA. W tym artykule skupimy się na pomiarze syntezy RNA i odniesiemy się do reference2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat badania stabilności RNA. Aby zbadać syntezę RNA, komórki są krótko znakowane BrU, np. przez 1 godzinę, a następnie BrU-IP1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Umożliwia to pomiary RNA zsyntetyzowanego w krótkim czasie znakowania, a obserwowane zmiany pozwolą lepiej oszacować regulacje w syntezie RNA niż pomiar zmian całkowitego RNA za pomocą RT-qPCR. Należy jednak wspomnieć, że nawet jeśli czas znakowania wynosi np. tylko 1 godzinę, degradacja może mieć wpływ na obserwowane poziomy RNA.
RNA z eksperymentów BrU-IP nadaje się do dalszej analizy zarówno za pomocą RT-qPCR1, jak i sekwencjonowania nowej generacji2,13. Inne standardowe metody wykrywania RNA, takie jak test ochrony przed rybonukleazą lub rybonukleazą, mogą być również stosowane w przypadku niektórych RNA.

<table><tbody><tr><td>Inhibitor Ribolock Rnazy</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Owca anty-mysie IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-bromodeoksyurydyna mysie przeciwciało BD</td><td>Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Spektrofotometria ultrafioletowo-widzialna</td></tr><tr><td>Nasycony wodą fenol pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Sondy RNA Taqman</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Sondy flurogeniczne</td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biosystems stosowane biosystemy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T linii komórkowej</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> Hanka <td>5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 i 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoklawowane.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0,1% dietilowęglanem traktowany H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP Bufor</td><td></td><td></td><td>40 mM Tris-HCl pH 7,5 i 500 mM NaCl w DEPC H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAzy</td><td></td><td></td>, <td>inhibitor 2xBrU-IP, bufor 2xBrU-IP uzupełniony 1 &mu; g/&mu; L BSA i 80 U/ml Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 mg/ml heparyny</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP bufor rozcieńczony 1:1 DEPC-H2O i uzupełniony 1mg/ml heparyny</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>bufor 2xBrU-IP rozcieńczony 1:1 w DEPC-H2O i uzupełniony 0,5 &mu; g/&mu; L BSA i 20 U/ml</td></tr><tr><td>bufor elucyjny rybolocku</td><td></td><td></td><td>0,1% SDS w H2O wolnym od RNAzy</td></tr></tbody></table>

badanie syntezy rna z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Gdy poziomy RNA w stanie ustalonym są porównywane między dwoma warunkami, nie jest możliwe rozróżnienie, czy zmiany są spowodowane zmianami w produkcji czy degradacją RNA. Protokół ten opisuje metodę pomiaru produkcji RNA, wykorzystującą znakowanie 5-bromourydyny RNA, a następnie immunoprecypitację, co umożliwia badanie RNA zsyntetyzowanego w krótkim czasie (np. 1 godzina). Przewaga znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji w porównaniu ze stosowaniem toksycznych inhibitorów transkrypcji, takich jak α-amantyna i aktynomycyna D, polega na tym, że nie ma wpływu na żywotność komórek lub jest on bardzo niski podczas krótkotrwałego stosowania. Ponieważ jednak immunoprecypitacja 5-bromourydyny wychwytuje tylko RNA wytworzony w krótkim czasie znakowania, powolne wytwarzanie, jak również szybko degradowane RNA może być trudne do zmierzenia tą metodą. RNA znakowane 5-bromourydyną wychwycone przez immunoprecypitację 5-bromourydyny można analizować za pomocą odwrotnej transkrypcji, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy i sekwencjonowania nowej generacji. Można badać wszystkie typy RNA, a metoda nie ogranicza się do pomiaru mRNA, jak pokazano w tym przykładzie.

Wstępne testy czasu znakowania BrU przeprowadzono w komórkach AsPC-1. Komórki traktowano BrU przez 0, 1, 2 i 4,5 h, po czym wykonano ekstrakcję całkowitego RNA oraz BrU-IP. Poziomy GAS5 i GAPDH zmierzono w RNA po BrU-IP, co wykazało, że 1 h znakowania było wystarczające do osiągnięcia około odpowiednio 9- i 44-krotnej zmiany w porównaniu z tłem (0 h) dla GAPDH i GAS5.
Metodę BrU-IP oraz opisaną powyżej analizę wykorzystano do zb...

Ta metoda może być użyta do pomiaru syntezy RNA. 5-bromourydyna jest dodawana do komórek i włączana do syntetyzowanego RNA. Syntezę RNA mierzy się przez ekstrakcję RNA bezpośrednio po znakowaniu, a następnie immunoprecypitację znakowanego RNA ukierunkowaną na 5-bromourydynę i analizę za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest pomiar zmian w syntezie RNA poprzez znakowanie bromourydyną i immunoprecypitację. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu RNA poprzez pomiar, czy zmiana poziomu RNA jest spowodowana zmianami w syntezie RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować na dowolnym preferowanym typie hodowli komórkowej, a użyte materiały są łatwo dostępne.Aby rozpocząć protokół, wysiewaj 3,5 razy 10 do szóstego HEK293T komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego w 10 mililitrach pożywki wzrostowej, aby uzyskać w sumie ponad 40 mikrogramów RNA po ekstrakcji 48 godzin później. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.48 godziny po wysianiu, odessaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej i pozostaw dwa mililitry, aby zapobiec wysychaniu komórek. Dodaj dwa milimole bromourydyny i poddaj działaniu substancji do pożywki wzrostowej i usuń pozostałe dwa mililitry z komórek przed ponownym nałożeniem ośmiu mililitrów pożywki wzrostowej zawierającej bromourydynę.Następnie inkubuj komórki przez godzinę. Po inkubacji umyj komórki w pięciu mililitrach buforu Hanka i trypsynizuj komórki dwoma mililitrami 0,05% trypsyny przez pięć minut. Dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i obracaj komórki przez dwie minuty w temperaturze 1,000 razy g.Następnie usuń supernatant i wyekstrahuj całkowite RNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji RNA i wymyj RNA w wodzie wolnej od RNaz. Ta technika jest bardzo czuła, dlatego ważne jest, aby pracować z RNA wysokiej jakości. Ekstrakcja RNA jest zatem krytycznym krokiem, ale można ją również łatwo przeprowadzić za pomocą dzisiejszych zestawów do ekstrakcji RNA.Przygotować kulki w jednej partii w ilości odpowiadającej liczbie próbek, które mają być badane, plus jedna dodatkowa próbka w celu uwzględnienia strat podczas pipetowania i mieszania wirowego. Dokładnie zawieś kulki magnetyczne anty-mysie IgG przez mieszanie wirowe i wyjmij 20 mikrolitrów kulek na próbkę w probówce o pojemności 1,5 mililitra bez RNaz. Umieść 1,5-mililitrową rurkę w stojaku magnetycznym na 20 sekund, aby koraliki zebrały się z boku.Usunąć supernatant, wyjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 40 mikrolitrach jednorazowego buforu bromourydyny-IP przez pipetowanie. Obracaj probówkę przez dwie sekundy w wirówce stołowej, umieść ją z powrotem w stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie się z kulkami za pomocą heparyny.Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze jednorazowej bromouridine-IP plus jeden miligram na mililitr buforu heparyny i obracać probówkę przez 30 minut. Następnie umyj koraliki jeden raz. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze jednorazowego buforu bromouridine-IP i dodać 1,25 mikrograma na próbkę przeciwciała anty-alfa-bromodeoksyurydyny.Inkubuj koraliki przez godzinę podczas obracania. Po inkubacji umyj koraliki trzy razy. Ponownie zawiesić umyte kulki w 50 mikrolitrach na próbkę jednorazowego buforu bromouridine-IP uzupełnionego jedną milimolową bromourydyną i pozostawić kulki obracające się przez 30 minut.Po obróceniu umyj kulki trzy razy i ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach na próbkę jednorazowego buforu bromouridine-IP. Zmierz stężenia RNA w ekstraktach RNA za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie i rozcieńczyć 40 mikrogramów RNA z każdej próbki w wodzie wolnej od RNaz do całkowitej objętości 200 mikrolitrów. Po denaturacji RNA przez dwie minuty w temperaturze 80 stopni Celsjusza, należy krótko odwirować próbki w wirówce stołowej.Po odwirowaniu dodać 200 mikrolitrów dwukrotnej bromouridine-IP plus BSA, inhibitora RNazy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawieszonych i przygotowanych kulek do każdej próbki i obracaj próbki przez jedną godzinę. Po inkubacji umyj koraliki cztery razy.Ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu elucyjnego, aby wymyć RNA, i szybko dodaj 200 mikrolitrów fenolu o pH 6,6, aby usunąć wszelkie cząsteczki inne niż RNA z próbki. Wirować próbkę do wymieszania i wirować ją przez trzy minuty z prędkością 25 000 g w wirówce stołowej. Następnie odessaj jak najwięcej górnej fazy, około 190 mikrolitrów, i przenieś ją do probówki z 200 mikrolitrami pH 6,6 fenolu-chloroformu.Upewnij się, że zasysasz tę samą ilość do wszystkich próbek. Zawiruj próbkę i obróć ją. Po wirowaniu przeprowadzić ekstrakcję chloroformu, odsysając górną fazę wodnistą, około 180 mikrolitrów, i przenieść ją do probówki zawierającej 200 mikrolitrów chloroformu.Odwirować, a następnie odwirować próbkę. Odessać górną fazę wodną, około 170 mikrolitrów, i przenieść ją do probówki zawierającej 17 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH sześcioma w celu zneutralizowania i wytrącenia RNA z roztworu wodnego. Następnie dodaj dwa mikrolitry glikogenu, który wytrąci się z RNA i sprawi, że osad będzie bardziej widoczny.Dodaj 500 mikrolitrów 96% etanolu, aby zwiększyć wiązanie między jonami soli a RNA i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub na 15 minut na suchym lodzie. Schłodzoną próbkę odkręcić, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i umyć osad w 185 mikrolitrach 75% etanolu w celu usunięcia pozostałości soli.Następnie obracaj próbkę pod ciśnieniem 25 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i pozostawić osad do wyschnięcia na pięć do 10 minut przy otwartej pokrywie. Ponownie zawiesić granulkę w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNaz nałożonej na bok probówki, aby uniknąć naruszenia granulki.Komórki AsPC-1 traktowano bromourydyną przez zero, jedną, dwie i 4,5 godziny, a następnie całkowitą ekstrakcję RNA i bromouridynę-IP. GAS5 i GAPDH mierzono w RNA bromouridyno-IP, co wykazało, że jedna godzina znakowania wystarczyła, aby osiągnąć dziewięcio- i 44-krotną zmianę w porównaniu z tłem. Dwa milimole po podaniu bromourydyny nie wywołały żadnych zmian morfologicznych w HEK293T komórkach ani przez jedną godzinę, ani przez dłuższe czterogodzinne leczenie.Hamowanie PLK-2 spowodowało wzrost mRNA alfa-synukleiny zarówno w wejściu, jak i bromourydynie-IP, co sugeruje, że wzrost RNA w stanie stacjonarnym jest spowodowany wzrostem syntezy RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować nowo zsyntetyzowane RNA bromourydyną i przeprowadzić następnie immunoprecypitację bromourydyny i znakowanego RNA.

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Opisujemy podstawowe eksperymentalne podejście do analizy zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo przy użyciu BrUTP metodą TRO (swoistą dla nici) w pączkujących drożdżach. Protokół ten można rozszerzyć o badanie terminacji transkrypcji przez inne polimerazy RNA zarówno u drożdży, jak i wyższych eukariontów.

Analiza zakończenia transkrypcji przy użyciu podejścia TRO (Thread-specificion Transcription Run-on) BrUTP

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Użycie tiolowanego uracylu do wrażliwego i specyficznego oczyszczania nowo przepisanego RNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Poznaj metodę oznaczania bromourydyną i immunoprecypitacji do pomiaru syntezy RNA w hodowlach komórkowych. Technika ta pozwala określić, czy zmiany poziomów RNA wynikają ze zmian w syntezie.

Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

Przeglądaj więcej filmów