Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji
3 maja 2018
Ta metoda może być użyta do pomiaru syntezy RNA. 5-bromourydyna jest dodawana do komórek i włączana do syntetyzowanego RNA. Syntezę RNA mierzy się przez ekstrakcję RNA bezpośrednio po znakowaniu, a następnie immunoprecypitację znakowanego RNA ukierunkowaną na 5-bromourydynę i analizę za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest pomiar zmian w syntezie RNA poprzez znakowanie bromourydyną i immunoprecypitację. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu RNA poprzez pomiar, czy zmiana poziomu RNA jest spowodowana zmianami w syntezie RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować na dowolnym preferowanym typie hodowli komórkowej, a użyte materiały są łatwo dostępne.
Aby rozpocząć protokół, wysiewaj 3,5 razy 10 do szóstego HEK293T komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego w 10 mililitrach pożywki wzrostowej, aby uzyskać w sumie ponad 40 mikrogramów RNA po ekstrakcji 48 godzin później. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.48 godziny po wysianiu, odessaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej i pozostaw dwa mililitry, aby zapobiec wysychaniu komórek. Dodaj dwa milimole bromourydyny i poddaj działaniu substancji do pożywki wzrostowej i usuń pozostałe dwa mililitry z komórek przed ponownym nałożeniem ośmiu mililitrów pożywki wzrostowej zawierającej bromourydynę.
Następnie inkubuj komórki przez godzinę. Po inkubacji umyj komórki w pięciu mililitrach buforu Hanka i trypsynizuj komórki dwoma mililitrami 0,05% trypsyny przez pięć minut. Dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i obracaj komórki przez dwie minuty w temperaturze 1,000 razy g.
Następnie usuń supernatant i wyekstrahuj całkowite RNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji RNA i wymyj RNA w wodzie wolnej od RNaz. Ta technika jest bardzo czuła, dlatego ważne jest, aby pracować z RNA wysokiej jakości. Ekstrakcja RNA jest zatem krytycznym krokiem, ale można ją również łatwo przeprowadzić za pomocą dzisiejszych zestawów do ekstrakcji RNA.
Przygotować kulki w jednej partii w ilości odpowiadającej liczbie próbek, które mają być badane, plus jedna dodatkowa próbka w celu uwzględnienia strat podczas pipetowania i mieszania wirowego. Dokładnie zawieś kulki magnetyczne anty-mysie IgG przez mieszanie wirowe i wyjmij 20 mikrolitrów kulek na próbkę w probówce o pojemności 1,5 mililitra bez RNaz. Umieść 1,5-mililitrową rurkę w stojaku magnetycznym na 20 sekund, aby koraliki zebrały się z boku.
Usunąć supernatant, wyjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 40 mikrolitrach jednorazowego buforu bromourydyny-IP przez pipetowanie. Obracaj probówkę przez dwie sekundy w wirówce stołowej, umieść ją z powrotem w stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie się z kulkami za pomocą heparyny.
Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze jednorazowej bromouridine-IP plus jeden miligram na mililitr buforu heparyny i obracać probówkę przez 30 minut. Następnie umyj koraliki jeden raz. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze jednorazowego buforu bromouridine-IP i dodać 1,25 mikrograma na próbkę przeciwciała anty-alfa-bromodeoksyurydyny.
Inkubuj koraliki przez godzinę podczas obracania. Po inkubacji umyj koraliki trzy razy. Ponownie zawiesić umyte kulki w 50 mikrolitrach na próbkę jednorazowego buforu bromouridine-IP uzupełnionego jedną milimolową bromourydyną i pozostawić kulki obracające się przez 30 minut.
Po obróceniu umyj kulki trzy razy i ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach na próbkę jednorazowego buforu bromouridine-IP. Zmierz stężenia RNA w ekstraktach RNA za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie i rozcieńczyć 40 mikrogramów RNA z każdej próbki w wodzie wolnej od RNaz do całkowitej objętości 200 mikrolitrów. Po denaturacji RNA przez dwie minuty w temperaturze 80 stopni Celsjusza, należy krótko odwirować próbki w wirówce stołowej.
Po odwirowaniu dodać 200 mikrolitrów dwukrotnej bromouridine-IP plus BSA, inhibitora RNazy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawieszonych i przygotowanych kulek do każdej próbki i obracaj próbki przez jedną godzinę. Po inkubacji umyj koraliki cztery razy.
Ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu elucyjnego, aby wymyć RNA, i szybko dodaj 200 mikrolitrów fenolu o pH 6,6, aby usunąć wszelkie cząsteczki inne niż RNA z próbki. Wirować próbkę do wymieszania i wirować ją przez trzy minuty z prędkością 25 000 g w wirówce stołowej. Następnie odessaj jak najwięcej górnej fazy, około 190 mikrolitrów, i przenieś ją do probówki z 200 mikrolitrami pH 6,6 fenolu-chloroformu.
Upewnij się, że zasysasz tę samą ilość do wszystkich próbek. Zawiruj próbkę i obróć ją. Po wirowaniu przeprowadzić ekstrakcję chloroformu, odsysając górną fazę wodnistą, około 180 mikrolitrów, i przenieść ją do probówki zawierającej 200 mikrolitrów chloroformu.
Odwirować, a następnie odwirować próbkę. Odessać górną fazę wodną, około 170 mikrolitrów, i przenieść ją do probówki zawierającej 17 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH sześcioma w celu zneutralizowania i wytrącenia RNA z roztworu wodnego. Następnie dodaj dwa mikrolitry glikogenu, który wytrąci się z RNA i sprawi, że osad będzie bardziej widoczny.
Dodaj 500 mikrolitrów 96% etanolu, aby zwiększyć wiązanie między jonami soli a RNA i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub na 15 minut na suchym lodzie. Schłodzoną próbkę odkręcić, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i umyć osad w 185 mikrolitrach 75% etanolu w celu usunięcia pozostałości soli.
Następnie obracaj próbkę pod ciśnieniem 25 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i pozostawić osad do wyschnięcia na pięć do 10 minut przy otwartej pokrywie. Ponownie zawiesić granulkę w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNaz nałożonej na bok probówki, aby uniknąć naruszenia granulki.
Komórki AsPC-1 traktowano bromourydyną przez zero, jedną, dwie i 4,5 godziny, a następnie całkowitą ekstrakcję RNA i bromouridynę-IP. GAS5 i GAPDH mierzono w RNA bromouridyno-IP, co wykazało, że jedna godzina znakowania wystarczyła, aby osiągnąć dziewięcio- i 44-krotną zmianę w porównaniu z tłem. Dwa milimole po podaniu bromourydyny nie wywołały żadnych zmian morfologicznych w HEK293T komórkach ani przez jedną godzinę, ani przez dłuższe czterogodzinne leczenie.
Hamowanie PLK-2 spowodowało wzrost mRNA alfa-synukleiny zarówno w wejściu, jak i bromourydynie-IP, co sugeruje, że wzrost RNA w stanie stacjonarnym jest spowodowany wzrostem syntezy RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować nowo zsyntetyzowane RNA bromourydyną i przeprowadzić następnie immunoprecypitację bromourydyny i znakowanego RNA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Tę metodę można wykorzystać do pomiaru syntezy RNA za pomocą znakowania bromourydyną i immunoprecypitacji. Pozwala ona ustalić, czy zmiany w poziomach RNA wynikają ze zmian w syntezie RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolizm RNA
- Techniki hodowli komórkowych
- Analiza ilościowa
Wstęp
- Synteza RNA jest kluczowym procesem w funkcjonowaniu komórki.
- Bromurydyna jest analogiem nukleozydu stosowanym do znakowania RNA.
- Immunoprecypitacja umożliwia izolację znakowanego RNA.
- Technika ta ma zastosowanie w różnych typach komórek.
Cel badania
- W celu pomiaru zmian w syntezie RNA.
- W celu zbadania związku między poziomem RNA a szybkością syntezy.
- W celu zastosowania metody dostępnej i możliwej do adaptacji w różnych hodowlach komórkowych.
Zastosowane metody
- Wysiej komórki HEK293T w szalce Petriego.
- Dodaj bromourydynę do pożywki wzrostowej.
- Wyizoluj RNA po określonym czasie inkubacji.
- Przeprowadź immunoprecypitację i przeanalizuj RNA za pomocą ilościowego PCR.
Główne wyniki
- Pomyślne wbudowanie bromourydyny do syntetyzowanego RNA.
- Osiągnięcie ilościowego pomiaru syntezy RNA.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych typach komórek.
- Przedstawienie wglądu w dynamikę metabolizmu RNA.
Wnioski
- Ta metoda jest skuteczna w badaniu syntezy RNA.
- Może ona pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów metabolizmu RNA.
- Dostępność materiałów i technik zwiększa jej przydatność w badaniach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni pomiar syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji pozwala zespołom biofarmaceutycznym odróżnić produkcję transkrypcyjną od degradacji RNA, co stanowi kluczowy punkt zwrotny w walidacji celu i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w wczesnej fazie odkrywania leków, wyjaśniając, czy obserwowane zmiany poziomu RNA wynikają ze zmienionych szybkości syntezy. Kompatybilność tej metody z różnorodnymi systemami komórkowymi i ilościowymi analizami końcowymi zwiększa jej przydatność w całym portfolio badawczym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywności transkrypcyjnej w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie zmian w RNA wynikających z syntezy od tych wynikających z degradacji.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w badaniach nad modulacją szlaków i zaangażowaniem celu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane odczyty syntezy RNA do dalszych analiz ilościowych.
- Umożliwia standaryzację i powtarzalność testu dzięki określonym etapom znakowania i immunoprecypitacji.
- Wspiera skalowalny screening wpływu związków na produkcję RNA w różnych typach komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z modelami istotnymi dla przebiegu choroby, umożliwiając pomiar syntezy RNA w różnych systemach komórkowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wsparcie ilościowej analizy biomarkerów.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań dzięki wyjaśnieniu mechanizmów transkrypcyjnych leżących u podstaw zmian fenotypowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, zapewniając bezpośredni odczyt syntezy RNA, co wspiera zarówno weryfikację hipotez, jak i analizę ilościową.
- Biologia odkrywcza: Pozwala ustalić, czy modulacja celu wpływa na produkcję lub stabilność RNA, co dostarcza informacji do analizy szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych o syntezie RNA, odpowiednich do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia przeprowadzenie dalszej analizy qPCR i sekwencjonowania w celu dokładnego pomiaru nowo zsyntetyzowanego RNA.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez pomiar syntezy RNA istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalny schemat postępowania do badań nad metabolizmem RNA w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar syntezy RNA przy użyciu dostępnych odczynników i protokołów.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go poprzez wyjaśnienie mechanizmów transkrypcyjnych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez rozróżnienie zmian w poziomie RNA wynikających z syntezy od tych spowodowanych degradacją.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z RNA oraz w technikach immunoprecypitacji.
- Niezbędny jest dostęp do hodowli komórkowych, immunoprecypitacji z wykorzystaniem kulek magnetycznych oraz platform analitycznych do analiz ilościowych.
- Wymagana jest rygorystyczna kontrola jakości RNA w celu zapewnienia powtarzalności i czułości metody.
- Może być konieczna adaptacja metody dla RNA syntetyzowanych powoli lub szybko degradowanych ze względu na krótkie okna znakowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną niedoreprezentację niektórych gatunków RNA w zależności od kinetyki syntezy i degradacji.
