Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli
9 grudnia 2017
Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.
W tej pracy zademonstrujemy łatwy protokół wytwarzania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach przy użyciu E. coli jako gospodarza ekspresji. Odwracalna acetylacja białek lizyną jest jedną z najpowszechniejszych modyfikacji potranslacyjnych w przyrodzie. Odgrywa ważną rolę w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym w transkrypcji genów, reakcji na stres, różnicowaniu komórkowym i metabolizmie.
Generowanie czysto acetylowanych białek w pozycjach projektowych jest bardzo przydatne do badania acetylacji białek. Jest to jednak trudne w przypadku większości klasycznych metod. Wyzwanie to zostało rozwiązane dzięki technice ekspansji kodu genetycznego.
Wykorzystuje zmodyfikowaną odmianę syntetazy pirolizylo-tRNA do ładowania tRNA-Pyl acetylolizyną, a następnie wykorzystuje maszynerię translacyjną gospodarza do tłumienia kodonu stop UAG w mRNA i kieruje włączeniem acetylolizyny w pozycji projektowej białka docelowego. Po pierwsze, bursztynowy kodon stop musi zostać wprowadzony do odpowiedniej pozycji w genie docelowym za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Amplifikować plazmid matrycowy zawierający gen białek typu dzikiego i wstawić mutację kodonu stop ze starterów w reakcji PCR.
Po PCR amplifikowany materiał dodaje się bezpośrednio do mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-Dpn1 na jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu cyrkularyzacji i usunięcia matrycy. Dodaj pięć mikrolitrów mieszanki do probówki z 25 mikrolitrami rozmrożonych kompetentnych komórek E. coli. Ostrożnie przesuń rurkę, aby wymieszać i umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.
Szpikuj mieszaninę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund i umieść na lodzie na dodatkowe pięć minut. Odpipetować 600 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze pokojowej do mieszaniny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, wstrząsając.
Rozprowadź 100 mikrolitrów na płytce z odpowiednim antybiotykiem i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Plazmid z pojedynczej kolonii jest wysyłany do sekwencjonowania. Drugim krokiem jest ekspresja i oczyszczenie specyficznie acetylowanego białka.
Podnieś pojedynczą kolonię z płytki, która zawiera zmutowany gen docelowy zawierający TAG i system inkorporacji acetylolizyny. Zaszczepić w 15 mililitrach świeżej pożywki LB odpowiednimi antybiotykami przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś 15-mililitrową kulturę na noc na 300-mililitrową świeżą pożywkę LB z antybiotykami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Dodaj pięciomilimolową acetylolizynę i 20-milimolowy nikotynamid jako końcowe stężenia w pożywce wzrostowej, gdy absorbancja osiągnie 5 przy 600 nanometrach. Hoduj komórki przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj induktor do ekspresji białka i hoduj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc.
Zebrać komórki, odwirowując przy 3 000 g przez 15 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osady komórkowe w temperaturze ujemnej 80 stopni. Rozmrozić zamrożone granulki komórek na lodzie i ponownie zawiesić z 15 mililitrami buforu do lizy, pięcioma mikrolitrami beta-merkaptoetanolu i jednym mikrolitrem nukleazy.
Komórki są rozbijane przez sonikację. Odwirować surowy ekstrakt w ilości 20 000 g przez 25 minut w temperaturze czterech stopni. Przefiltrować supernatant za pomocą 45-mikrometrowego filtra membranowego.
Załadować przefiltrowaną próbkę do kolumny zawierającej jeden mililitr niklowej żywicy NTA, zrównoważonej 20 mililitrami buforu do lizy. Przemyć kolumnę 20 mililitrami buforu do mycia. Białko docelowe wymyka się za pomocą dwóch mililitrów buforu elucyjnego.
Oczyszczone białko jest odsalane przez kolumnę PD-10 przez dodanie 2,5 mililitra próbki i zbieranie odsolonej próbki za pomocą 3,5 mililitra buforu odsalającego. Kolejnym krokiem jest biochemiczne scharakteryzowanie oczyszczonego białka acetylowanego. Denaturować białka za pomocą buforu próbki SDS powyżej 100 stopni przez pięć minut.
Odwirować mieszaninę, załadować do żelu SDS-PAGE i pracować pod napięciem 200 woltów przez 30 minut. Umyj żel wodą destylowaną i delikatnie wstrząśnij. Aby zrobić kanapkę do western blotting, od katody do anody znajduje się gąbka, bibuła filtracyjna, bufor transferowy, nasączony żel SDS-PAGE, membrana PVDF aktywowana metanolem, kolejna bibuła filtracyjna, usuń pęcherzyki z kanapki i kolejną gąbkę.
Umieść stos w zbiorniku transferowym. Pracuj ze stałym prądem 350 miliamperów przez 45 minut. Umyj membranę PVDF 25 mililitrami buforu TBST przez pięć minut, delikatnie wstrząsając.
Zablokuj membranę za pomocą 5% BSA i buforu TBST na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę z rozcieńczonym przeciwciałem acetylolizyny sprzężonym z HRP w temperaturze pokojowej przez godzinę lub cztery stopnie przez noc, delikatnie wstrząsając. Przemyj membranę 20 mililitrami buforu TBST przez pięć minut, delikatnie wstrząsając.
Powtórz ten krok cztery razy. Nałożyć podłoże chemiluminescencyjne na membranę na jedną minutę. Przechwyć sygnał za pomocą podstawowego imagera kamery CCD.
Te same objętości frakcji elucyjnych i oczyszczania białek załadowano do żelu SDS-PAGE. Wydajność acetylowanego białka wynosi około połowy białka typu dzikiego, które jest bardzo wydajne, a ten sam szczep ekspresyjny bez acetylolizyny i pożywki wzrostowej nie może wytwarzać białek o wykrywalnej ilości, co wskazuje na wysoką czystość acetylowanego białka, ponieważ w tej konkretnej pozycji nie ma kanonicznych aminokwasów. Western blot wykazał, że nie ma wykrywalnej acetylacji w białku typu dzikiego, co wskazuje na niskie tło niespecyficznej acetylacji tego systemu ekspresji, podczas gdy acetylowane białko miało wyraźne pasmo.
Tandemowa spektrometria mas potwierdziła, że acetylacja zachodzi we właściwym miejscu, którego odpowiadająca mu pozycja w genie została zmutowana do kodonu stop. Aby uzyskać dobre plony i czystość acetylowanych białek, należy zastosować zoptymalizowany system inkorporacji acetylolizyny, aby uzyskać zarówno wysoką wydajność, jak i wysoką czystość. Komórki BL21(DE3) powinny być używane do acetylacji o niskim tle i niespecyficznej w celu zwiększenia czystości.
System inkorporacji genetycznej może być wykorzystany w systemach eukariotycznych do szerszych zastosowań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół generowania białek homogenicznie acetylowanych w określonych miejscach z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza ekspresyjnego. Technika ta wykorzystuje rozszerzenie kodu genetycznego, aby przezwyciężyć trudności związane z tradycyjnymi metodami acetylowania białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Inżynieria białek
- Modyfikacje potranslacyjne
Wprowadzenie
- Acylacja lizyny jest powszechną modyfikacją potranslacyjną.
- Odgrywa ona kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, takich jak transkrypcja genów i metabolizm.
- Generowanie białek acylowanych w określonych miejscach ułatwia badanie ich funkcji.
- Tradycyjne metody acylacji są często nieskuteczne.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody produkcji białek acetylowanych w E. coli.
- Ułatwienie badania mechanizmów acetylacji białek.
- Pogłębienie zrozumienia roli acetylacji w procesach biologicznych.
Zastosowane metody
- Technika rozszerzania kodu genetycznego.
- Ekspresja białek w Escherichia coli.
- Acetylacja białek w konkretnym miejscu.
- Opracowanie protokołu dla homogenicznej acetylacji.
Główne wyniki
- Skuteczne otrzymanie homogenicznie acetylowanych białek.
- Wykazano efektywność techniki rozszerzania kodu genetycznego.
- Dostarczono nowego narzędzia do badania acetylacji białek.
- Pogłębiono zrozumienie roli acetylacji w funkcjach biologicznych.
Wnioski
- Opracowany protokół upraszcza proces otrzymywania acetylowanych białek.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach dotyczących modyfikacji białek.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać tę technikę do analizy procesów związanych z acetylacją.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Specyficzna dla konkretnych miejsc acetylacja białek w Escherichia coli umożliwia precyzyjną analizę modyfikacji potranslacyjnych, które są kluczowe dla walidacji celu oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Niniejszy protokół rozwiązuje długotrwałe problemy związane z generowaniem homogenicznie modyfikowanych białek, wspierając wiarygodność prognostyczną i ciągłość translacyjną w portfelach badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie testowanie hipotez zależnych od acetylacji w określonych miejscach białka.
- Ułatwia analizę mechanistyczną poprzez izolację funkcjonalnego wpływu konkretnych zdarzeń acetylacji lizyny.
- Wspiera rzetelną walidację celu, dostarczając czyste, modyfikowane w konkretnych miejscach białka do dalszych analiz.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne odczynniki białkowe w formie acetylowanej do ilościowych analiz biochemicznych i biofizycznych.
- Zwiększa wiarygodność analizy poprzez eliminację tła wynikającego z niespecyficznego acetylowania.
- Umożliwia skalowalną produkcję modyfikowanych białek dla platform wysokoprzepustowego przesiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność wyników biochemicznych in vitro z istotnymi dla przebiegu choroby modyfikacjami potranslacyjnymi obserwowanymi in vivo.
- Wsparcie ciągłości procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie funkcjonalnych badań acetylacji w systemach modelowych.
- Zmniejszenie ryzyka translacyjnego dzięki wyjaśnieniu biologicznych konsekwencji specyficznych zdarzeń acetylacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w proces od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając generowanie białek acetylowanych w konkretnych miejscach na potrzeby weryfikacji hipotez, opracowywania testów oraz badań nad mechanizmami działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania wariantów białka typu dzikiego oraz acetylowanego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, wysokiej czystości odczynniki do opracowywania analiz ilościowych i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar zmian funkcjonalnych zależnych od acetylacji z wykorzystaniem western blottingu i spektrometrii mas.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników in vitro do wzorców acetylacji in vivo istotnych dla modeli chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do generowania zróżnicowanych białek modyfikowanych specyficznie w określonych miejscach dla wielu celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje produkcję zmodyfikowanych białek przy zachowaniu wysokiej wydajności i czystości.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez wyjaśnienie funkcjonalnego wpływu acetylacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i szlaków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dowody biochemiczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w klonowaniu molekularnym, ekspresji białek oraz analizie modyfikacji potranslacyjnych.
- Wymaga dostępu do systemów ekspresyjnych E. coli, narzędzi do mutogenezy celowanej oraz platform analitycznych, takich jak western blotting i spektrometria mas.
- Wymaga standaryzacji protokołów między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Może wymagać dostosowania do różnych białek docelowych lub gospodarzy ekspresyjnych, w zależności od potrzeb projektu.
- Wydajność i czystość zależą od optymalizacji systemu inkorporacji acetylolizyny oraz wyboru szczepu gospodarza.
