Name: Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę ekspansji kodu genetycznego do generowania homogenicznie acetylowanych białek w określonych miejscach przy użyciu Escherichia coli. Protokół umożliwia badanie modyfikacji potranslacyjnych z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (AI119813), start-up z University of Arkansas, oraz nagrodę od Arkansas Biosciences Institute.

1. Mutageneza docelowego genu ukierunkowana na miejsce
Uwaga: MDH jest wyrażony pod promotorem T7 w wektorze pCDF-1 o pochodzeniu CloDF13 i liczbie kopii od 20 do 4034.
<ol>
	<li>Wprowadzić bursztynowy kodon stop w pozycji 140 w genie za pomocą starterów (starter do przodu: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGGG i starter odwrotny: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGCC), postępując zgodnie z instrukcją zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.</li>
	<li>Amplifikować plazmid matrycowy zawierający gen dehydratazy jabłczanu typu dzikiego i wprowadzić mutację kodonu stop w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W mieszaninie reakcyjnej należy dodać 12,5 μl mieszaniny enzymów polimerazy 2X DNA, 1,25 μl 10 μM startera Forward, 1,25 μL 10 μM startera odwróconego, 1 μL matrycowego DNA (20 ng/μL) (plazmid pCDF-1 zawierający gen MDH typu dzikiego) i 9 μl wody wolnej od nukleaz.
	<ol>
		<li>Parametry reakcji PCR należy stosować w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s; 25 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 3 minuty w temperaturze 72 °C; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty. Po PCR dodać amplifikowany materiał bezpośrednio do mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-DpnI z zestawu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu cyrkularyzacji i usunięcia matrycy. 
		Uwaga: Mieszanina reakcyjna zawiera 1 μl produktu PCR, 5 μl 2X buforu reakcyjnego, 1 μL 10-krotnej mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-DpnI oraz 3 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 μl mieszaniny reakcyjnej do probówki z 25 μl, rozmrożonymi, kompetentnymi komórkami DH5α E. coli z zestawu. Ostrożnie przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut. Szok termiczny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 30 s i umieszczenie na lodzie na dodatkowe 5 minut.
	<ol>
		<li>Odpipetować 600 μl bulionu Super Optimal o temperaturze pokojowej z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) z zestawu do mieszaniny, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut z wytrząsaniem przy 250 obr./min, rozprowadzić 100 μl na płytce agarowej bulionu lizogennego (LB) z odpowiednim antybiotykiem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać 4-6 pojedynczych kolonii do 6 ml świeżej pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Ekstrahuj plazmidy z każdej nocnej hodowli za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu, postępując zgodnie z instrukcją producenta, a następnie wyślij plazmidy do sekwencjonowania DNA zgodnie z protokołem dostawcy usług w celu potwierdzenia mutacji kodonu stop we właściwych pozycjach.</li>
	<li>Szczep należy przechowywać w odpowiedniej kolejności w temperaturze -80 °C, mieszając 1 ml kultury przez noc i 300 μl 100% DMSO.</li>
</ol>
2. Ekspresja białka acetylowanego
<ol>
	<li>Wstaw geny zoptymalizowanej syntetazy acetylylizylo-tRNA33 i zoptymalizowanego tRNAPyl 32 do plazmidu pTech. Umieść gen syntetazy tRNA pod konstytutywnym promotorem lpp. Umieść gen tRNA pod konstytutywnym promotorem proK34.
	<ol>
		<li>Współprzekształcaj wektor wyrażenia34 zawierający zmutowany gen dehydrogenazy jabłczanowej zawierający TAG oraz plazmid zawierający zoptymalizowany system inkorporacji acetylolizyny, w 25 μl rozmrożonych kompetentnych komórek E. coli BL21(DE3) przez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 10 s i umieść na lodzie na dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Odpipetować 600 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej do mieszaniny, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut z wytrząsaniem z prędkością 275 obr./min, rozprowadzić 100 μl na płytce ze 100 μg/ml streptomycyny i 50 μg/ml chloramfenikolu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 275 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić w 15 ml świeżej pożywki LB ze 100 μg/ml streptomycyny i 50 μg/ml chloramfenikolu w probówce o pojemności 50 ml przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Przenieść 15 ml kultury przez noc do 300 ml świeżej pożywki LB z antybiotykami w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Rozpuścić acetylolizynę w wodzie, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy, przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 5 mM acetylolizyny i 20 mM nikotynamidu (inhibitora deacetylaz) do pożywki wzrostowej, gdy absorbancja osiągnie 0,5 przy 600 nm.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki przez dodatkowy 1 h w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, następnie dodaj 0,5 mM IPTG w celu ekspresji białka i hoduj komórki w temperaturze 25 °C przez noc, wytrząsając przy 180 obr. 
		nuta: Warunki ekspresji mogą wymagać optymalizacji dla różnych białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, odrzucić supernatant i przemyć granulki komórek buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Zebrać umyte komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, wyrzucić supernatant i przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie acetylowanego białka
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone granulki komórek na lodzie i ponownie zawiesić 15 ml buforu do lizy (50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu), 5 μl β-merkaptoetanolu i 1 μl nukleazy benzonazy (250 jednostek).</li>
	<li>Rozbij ogniwa za pomocą sonikacji 40 kHz przy 70% mocy wyjściowej z 10 cyklami krótkich serii po 10 sekund, po których następują przerwy 30 s na schłodzenie w celu uzyskania surowego ekstraktu. Odwirować ekstrakt surowy przy 20 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego 0,45 μm i załadować do kolumny zawierającej 1 ml żywicy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) zrównoważonej z 20 ml wody i 20 ml buforu do lizy. 
	nuta: Komórki mogą być również rozbijane przez łagodne detergenty, jeśli sonikacja nie jest dostępna.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 20 ml buforu płuczącego (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu), a następnie wymyć 2 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 150 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu).</li>
	<li>Frakcję elucyjną odsalać buforem odsalającym (25 mM Tris pH 7,8 i 10 mM NaCl) za pomocą kolumny PD-10, postępując zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć stężenie eluowanego białka, postępując zgodnie z instrukcją odczynnika do oznaczania białek Bradforda. Odsolone białko jest gotowe do dalszych eksperymentów. 
	nuta: Przygotuj 50% zapasu glicerolu białka i przechowuj w temperaturze -80 °C do przechowywania.</li>
</ol>
4. Biochemiczna charakterystyka acetylowanego białka
<ol>
	<li>SDS-PAGE i analizy spektrometrii mas.
	<ol>
		<li>Denaturować białka buforem próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS) (5 μl próbki białka z 2 μl 4-krotnym buforem próbki SDS) w probówce o pojemności 2 ml w temperaturze 105 °C przez 5 min, odwirować mieszaninę przy 2000 x g przez 10 s, naładować na 4-20% żel do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), i pracować pod napięciem 200 V przez 30 min.</li>
		<li>Umyj żel wodą destylowaną i delikatnie wstrząsaj przez 5 minut, powtarzając proces 3 razy. Wylej wodę i zaplamij żel niebieską plamą Coomassie przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając. Odplamić żel wodą destylowaną, delikatnie wstrząsać przez 30 minut i powtórzyć to odplamianie 3 razy.</li>
		<li>Przeciąć pasmo o ciśnieniu 33 kDa na barwionym na niebiesko żelu SDS-PAGE Coomassie i wysłać go do zakładów spektrometrii mas lub firm w celu potwierdzenia, że acetylolizyna została włączona w zaprojektowanej pozycji. 
		UWAGA: Protokół analizy spektrometrii mas był zgodny z poprzednim eksperymentem34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachodnia plama
	<ol>
		<li>Uruchom żel SDS-PAGE z tym samym protokołem w kroku 4.1. Po przebiegu żelu nasącz żel buforem transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, pH 8,3 i 20% metanolu) przez 15 minut.</li>
		<li>Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) o wymiarach 0,2 μm, 7 cm x 8,5 cm z metanolem przez 1 minutę i spłucz buforem transferowym przed przygotowaniem kanapki transferowej. 
		nuta: Metanol jest niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami, spożycia lub wdychania. Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć.</li>
		<li>Wykonaj warstwę transferową z katody na anodę (gąbka, bibuła filtracyjna, żel SDS-PAGE, membrana PVDF, bibuła filtracyjna i gąbka). Umieść komin w zbiorniku transferowym, pracuj ze stałym prądem 350 mA przez 45 min. 
		nuta: Czas transferu może wymagać optymalizacji.</li>
		<li>Przemyć membranę PVDF buforem 25 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Zablokować błonę 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforze TBST na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować błonę z przeciwciałem acetylolizynowym sprzężonym z HRP o końcowym stężeniu 1 μg/ml, rozcieńczonym 5% BSA w TBST w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając. 
		nuta: Aby uzyskać szybsze rezultaty, ten krok można wykonać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozcieńczenie przeciwciała może wymagać optymalizacji.</li>
		<li>Przemyć membranę 20 ml buforu TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając, powtarzając krok 4 razy. Podłoże chemiluminescencyjne nanieść na membranę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uchwyć sygnał za pomocą przetwornika obrazu opartego na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, R. G., Wold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Enzymol+Relat+Areas+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification of proteins.</a> Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).</li>
<li>Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+post-translational+modification+codes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Deciphering post-translational modification codes.</a> FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).</li>
<li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+CT+%22Posttranslational+modification+of+proteins+%3A+expanding+nature%27s+inventory%22">Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory</a>. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).</li>
<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Sci Rep. 1, (2011).</li>
<li>Grotenbreg, G., Ploegh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology%3A+dressed-up+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical biology: dressed-up proteins.</a> Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).</li>
<li>Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation%3A+the+tale+of+a+modification+from+transcription+regulation+to+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism.</a> Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).</li>
<li>Cohen, T., Yao, T. P. <a target="_blank" href="http://stke.sciencemag.org/content/2004/245/pe42">AcK-knowledge reversible acetylation.</a> Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42(2004).</li>
<li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+of+protein+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The world of protein acetylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li>
<li>Escalante-Semerena, J. C. <a target="_blank" href="http://www.asmscience.org/content/journal/microbe/10.1128/microbe.5.340.1">Nε-acetylation control conserved in all three life domains.</a> Microbe. 5, 340-344 (2010).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation%3A+a+regulatory+modification+to+rival+phosphorylation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?</a> The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).</li>
<li>Soppa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acetylation+in+archaea%2C+bacteria%2C+and+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes.</a> Archaea. , (2010).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+Methylation+of+Histones+and+Their+Possible+Role+in+the+Regulation+of+Rna+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis.</a> P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).</li>
<li>Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+acetyl+groups+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+j%22%5BJournal%5D)">The presence of acetyl groups of histones.</a> Biochem j. 87, 258-263 (1963).</li>
<li>Sterner, D. E., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+histones+and+transcription-related+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Acetylation of histones and transcription-related factors.</a> Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).</li>
<li>Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+deacetylation+of+non-histone+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Acetylation and deacetylation of non-histone proteins.</a> Gene. 363, 15-23 (2005).</li>
<li>Close, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lysine+acetylation+of+non-nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).</li>
<li>Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation+in+obesity%2C+diabetes+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease.</a> Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).</li>
<li>You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation%3A+enzymes%2C+bromodomains+and+links+to+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases.</a> Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).</li>
<li>Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+in+neuronal+%28dys%29function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation in neuronal (dys)function.</a> Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).</li>
<li>Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+control+of+cardiac+fatty+acid+beta-oxidation+and+energy+metabolism+in+obesity%2C+diabetes%2C+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).</li>
<li>Kaypee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lysine+acetylation+in+tumorigenesis%3A+Implications+in+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics.</a> Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).</li>
<li>Tapias, A., Wang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Acetylation+and+Deacetylation+in+Brain+Development+and+Neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).</li>
<li>Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protein+acetylation%3A+the+dawning+of+a+new+age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age.</a> Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).</li>
<li>Jones, J. D., O'Connor, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acetylation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein acetylation in prokaryotes.</a> Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).</li>
<li>Bernal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bacterial+physiology+by+lysine+acetylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22New+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins.</a> New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).</li>
<li>Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+Biomolecules+in+Prokaryotes%3A+a+Widespread+Strategy+for+the+Control+of+Biological+Function+and+Metabolic+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).</li>
<li>Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+acetylation+in+bacteria%3A+Current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art.</a> Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).</li>
<li>Wolfe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protein+acetylation%3A+new+discoveries+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions.</a> Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).</li>
<li>Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoacetylation+of+the+histone+acetyltransferase+Rtt109%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109.</a> J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).</li>
<li>Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nchembio/journal/v4/n4/full/nchembio.73.html">Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins.</a> Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).</li>
<li>Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+evolving+tRNAPyl+for+efficient+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nucleic Acids Res. 43 (22), e156(2015).</li>
<li>Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).</li>
<li>Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Lysine+Acetylation+of+Malate+Dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase.</a> J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).</li>
<li>Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+the+lysine+acetylation+of+tyrosyl-tRNA+synthetase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli.</a> Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rewriting the Genetic Code.</a> Annu Rev Microbiol. , (2017).</li>
<li>O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgrading+protein+synthesis+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Upgrading protein synthesis for synthetic biology.</a> Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).</li>
<li>Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+and+reprogramming+the+genetic+code+of+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals.</a> Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).</li>
<li>O'Donoghue, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-cognate+suppression+of+amber%2C+opal+and+quadruplet+codons+competes+with+aminoacyl-tRNAPyl+for+genetic+code+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).</li>
<li>Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+amino+acid+composition+of+proteins+within+an+expanded+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code.</a> Nucleic Acids Res. 43 (2), e8(2015).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+method+for+genetic+incorporation+of+multiple+noncanonical+amino+acids+into+one+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli.</a> Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).</li>
<li>Venkat, S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/2211-5463.12320/abstract">Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli.</a> FEBS Open. , (2017).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+the+histone+deacetylase+family%3A+functional+implications+of+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis.</a> J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).</li>
<li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-phosphate+is+a+critical+determinant+of+lysine+acetylation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli.</a> Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Genetyczna inkorporacja aminokwasów niekanonicznych (ncAA) opiera się na supresji przypisanego kodonu, głównie bursztynowego kodonu stop UAG 36,37,38,39, przez naładowane ncAA tRNA zawierające odpowiedni antykodon. Jak wiadomo, kodon UAG jest rozpoznawany przez czynnik uwalniania-1 (RF1) u bakterii, a także może być tłumiony przez prawie pokrewne tRNA z gospodarzy naładowanych przez aminokwasy ...

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek zachodzą po procesie translacji i powstają w wyniku kowalencyjnego dodawania grup funkcyjnych do reszt aminokwasowych, odgrywając ważną rolę w prawie wszystkich procesach biologicznych, w tym transkrypcji genów, reakcji na stres, różnicowania komórkowego i metabolizmu1,2,3. Do tej pory zidentyfikowano około 400 charakterystycznych PTM-ów4. Złożoność genomu i proteomu jest w dużym stopniu wzmacniana przez białkowe PTM, ponieważ regulują one aktywność i lokalizację białek oraz wpływają na interakcję z innymi cząsteczkami, takimi jak białka, kwasy nukleinowe, lipidy i kofaktory5.
Acetylacja białek była w czołówce badań nad PTM w ciągu ostatnich dwóch dekad6,7,8,9,10,11,12. Acetylacja lizyny została po raz pierwszy odkryta w histonach ponad 50 lat temu13,14, została dobrze zbadana i wiadomo, że występuje w ponad 80 czynnikach transkrypcyjnych, regulatorach i różnych białkach15,16,17. Badania nad acetylacją białek nie tylko dostarczyły nam głębszego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych białka, ale także ukierunkowały leczenie wielu chorób spowodowanych dysfunkcyjną acetylacją18,19,20,21,22,23. Uważano, że acetylacja lizyny zachodzi tylko u eukariontów, ale ostatnie badania wykazały, że acetylacja białek odgrywa również kluczową rolę w fizjologii bakterii, w tym chemotaksji, odporności na kwasy, aktywacji i stabilizacji wysp patogenności i innych białek związanych z wirulencji24,25,26,27,28,29.
Powszechnie stosowaną metodą biochemicznego charakteryzowania acetylacji lizyny jest użycie mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Glutamina jest stosowana jako naśladownica acetylolizyny ze względu na jej podobny rozmiar i polarność. Arginina jest wykorzystywana jako nieacetylowany naśladowca lizyny, ponieważ zachowuje swój dodatni ładunek w warunkach fizjologicznych, ale nie może być acetylowana. Jednak obie mimiki nie są prawdziwymi izosterami i nie zawsze dają oczekiwane rezultaty30. Najbardziej rygorystycznym podejściem jest generowanie jednorodnie acetylowanych białek przy określonych resztach lizyny, co jest trudne lub niemożliwe dla większości klasycznych metod ze względu na niską stechiometrię acetylacji lizyny w naturze7,11. Wyzwanie to zostało rozwikłane dzięki strategii ekspansji kodu genetycznego, która wykorzystuje zmodyfikowany wariant syntetazy pirolizylo-tRNA z gatunku Methanosarcinaceae do ładowania tRNAPyl acetylolizyną, wykorzystuje maszynerię translacyjną gospodarza do tłumienia kodonu stop UAG w mRNA i kieruje włączeniem acetylolizyny w zaprojektowanej pozycji docelowego białka31. Ostatnio zoptymalizowaliśmy ten system za pomocą ulepszonego tRNA32 i ulepszonej syntetazy acetylylizylo-tRNA33. Ponadto zastosowaliśmy ten ulepszony system inkorporacji w badaniach acetylacji dehydrogenazy jabłczanowej 34 i syntetazy tyrozylo-tRNA35. W tym miejscu demonstrujemy protokół generowania czysto acetylowanych białek od klonowania molekularnego do identyfikacji biochemicznej przy użyciu dehydrogenazy jabłczanowej (MDH), którą intensywnie badaliśmy jako przykład poglądowy.

<table><tbody><tr><td>Test białkowy</td><td>Bradford Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Stężenie białka</td></tr><tr><td>4x Laemmli Bufor do próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>SDS Bufor do próbek</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>Bio-Rad</td><td>1610786</td><td>SDS-PAGE barwienie w żelu</td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE gotowy żel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td>Oznaczanie białka</td></tr><tr><td>Ac-K-100 (koniugat HRP)</td><td>Komórka Sygnalizacja</td><td>6952</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>194</td><td>Induktor ekspresji</td></tr><tr><td>N&epsilon; -acetylo-L-lizyna</td><td>CHEM-IMPEX</td><td>5364</td><td>Niekanoniczna</td></tr><tr><td>kolumna odsalająca aminokwasy PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>Odsalanie</td></tr><tr><td>Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>NEB</td><td>E0554</td><td>Przedstawiamy komórki kodonu stop</td></tr><tr><td>BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>Eksprymujący szczep</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Ekstrakcja plazmidów</td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>Żywica oczyszczająca powinowactwa</td></tr><tr><td>nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td>Inhibitor deacetylazy</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Środek redukujący</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek BugBuster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70584</td><td>Rozbijanie komórek</td></tr><tr><td>Benzonaza nukleaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>DNaza</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>32106</td><td>Chemiluminescencyjny</td></tr><tr><td>wstępnie zmieszany bulion LB</td><td>VWR</td><td>97064</td><td>Pożywka do wzrostu komórek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td>blokowanie western blot</td></tr></tbody></table>

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w escherichia coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Wykazano, że modyfikacje potranslacyjne, które zachodzą w określonych pozycjach białek, odgrywają ważną rolę w różnych procesach komórkowych. Wśród nich odwracalna acetylacja lizyny jest jedną z najszerzej rozpowszechnionych we wszystkich dziedzinach życia. Chociaż przeprowadzono liczne badania acetylomu oparte na spektrometrii mas, dalsza charakterystyka tych przypuszczalnych celów acetylacji była ograniczona. Jednym z możliwych powodów jest to, że trudno jest wytworzyć czysto acetylowane białka w pożądanych pozycjach za pomocą większości klasycznych podejść biochemicznych. Aby sprostać temu wyzwaniu, zastosowano technikę ekspansji kodu genetycznego w celu wykorzystania pary zmodyfikowanego wariantu syntetazy pirolizylo-tRNA i jej pokrewnego tRNA z gatunków Methanosarcinaceae do kierowania kotranslacyjną inkorporacją acetylolizyny w określonym miejscu w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Po pierwszym zastosowaniu w badaniach nad acetylacją histonów, podejście to ułatwiło badania acetylacji na różnych białkach. W tej pracy zademonstrowaliśmy łatwy protokół wytwarzania specyficznie dla miejsca acetylowanych białek przy użyciu modelowej bakterii Escherichia coli jako gospodarza. Dehydrogenaza jabłczanowa została wykorzystana jako przykład demonstracyjny w tej pracy.

Wydajność acetylowanego białka MDH wyniosła 15 mg na 1 L hodowli, podczas gdy w przypadku MDH typu dzikiego było to 31 mg na 1 L hodowli. Oczyszczone białka przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE, jak pokazano na Ryc. 1. MDH typu dzikiego wykorzystano jako kontrolę pozytywną34. Jako kontrolę negatywną wykorzystano białko oczyszczone z komórek zawierających system inkorporacji acetyloizoleucyny (AcK) oraz zmutowany gen mdh, ale bez...

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

W tej pracy zademonstrujemy łatwy protokół wytwarzania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach przy użyciu E. coli jako gospodarza ekspresji. Odwracalna acetylacja białek lizyną jest jedną z najpowszechniejszych modyfikacji potranslacyjnych w przyrodzie. Odgrywa ważną rolę w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym w transkrypcji genów, reakcji na stres, różnicowaniu komórkowym i metabolizmie.Generowanie czysto acetylowanych białek w pozycjach projektowych jest bardzo przydatne do badania acetylacji białek. Jest to jednak trudne w przypadku większości klasycznych metod. Wyzwanie to zostało rozwiązane dzięki technice ekspansji kodu genetycznego.Wykorzystuje zmodyfikowaną odmianę syntetazy pirolizylo-tRNA do ładowania tRNA-Pyl acetylolizyną, a następnie wykorzystuje maszynerię translacyjną gospodarza do tłumienia kodonu stop UAG w mRNA i kieruje włączeniem acetylolizyny w pozycji projektowej białka docelowego. Po pierwsze, bursztynowy kodon stop musi zostać wprowadzony do odpowiedniej pozycji w genie docelowym za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Amplifikować plazmid matrycowy zawierający gen białek typu dzikiego i wstawić mutację kodonu stop ze starterów w reakcji PCR.Po PCR amplifikowany materiał dodaje się bezpośrednio do mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-Dpn1 na jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu cyrkularyzacji i usunięcia matrycy. Dodaj pięć mikrolitrów mieszanki do probówki z 25 mikrolitrami rozmrożonych kompetentnych komórek E. coli. Ostrożnie przesuń rurkę, aby wymieszać i umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.Szpikuj mieszaninę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund i umieść na lodzie na dodatkowe pięć minut. Odpipetować 600 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze pokojowej do mieszaniny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, wstrząsając.Rozprowadź 100 mikrolitrów na płytce z odpowiednim antybiotykiem i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Plazmid z pojedynczej kolonii jest wysyłany do sekwencjonowania. Drugim krokiem jest ekspresja i oczyszczenie specyficznie acetylowanego białka.Podnieś pojedynczą kolonię z płytki, która zawiera zmutowany gen docelowy zawierający TAG i system inkorporacji acetylolizyny. Zaszczepić w 15 mililitrach świeżej pożywki LB odpowiednimi antybiotykami przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś 15-mililitrową kulturę na noc na 300-mililitrową świeżą pożywkę LB z antybiotykami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj pięciomilimolową acetylolizynę i 20-milimolowy nikotynamid jako końcowe stężenia w pożywce wzrostowej, gdy absorbancja osiągnie 5 przy 600 nanometrach. Hoduj komórki przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj induktor do ekspresji białka i hoduj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc.Zebrać komórki, odwirowując przy 3 000 g przez 15 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osady komórkowe w temperaturze ujemnej 80 stopni. Rozmrozić zamrożone granulki komórek na lodzie i ponownie zawiesić z 15 mililitrami buforu do lizy, pięcioma mikrolitrami beta-merkaptoetanolu i jednym mikrolitrem nukleazy.Komórki są rozbijane przez sonikację. Odwirować surowy ekstrakt w ilości 20 000 g przez 25 minut w temperaturze czterech stopni. Przefiltrować supernatant za pomocą 45-mikrometrowego filtra membranowego.Załadować przefiltrowaną próbkę do kolumny zawierającej jeden mililitr niklowej żywicy NTA, zrównoważonej 20 mililitrami buforu do lizy. Przemyć kolumnę 20 mililitrami buforu do mycia. Białko docelowe wymyka się za pomocą dwóch mililitrów buforu elucyjnego.Oczyszczone białko jest odsalane przez kolumnę PD-10 przez dodanie 2,5 mililitra próbki i zbieranie odsolonej próbki za pomocą 3,5 mililitra buforu odsalającego. Kolejnym krokiem jest biochemiczne scharakteryzowanie oczyszczonego białka acetylowanego. Denaturować białka za pomocą buforu próbki SDS powyżej 100 stopni przez pięć minut.Odwirować mieszaninę, załadować do żelu SDS-PAGE i pracować pod napięciem 200 woltów przez 30 minut. Umyj żel wodą destylowaną i delikatnie wstrząśnij. Aby zrobić kanapkę do western blotting, od katody do anody znajduje się gąbka, bibuła filtracyjna, bufor transferowy, nasączony żel SDS-PAGE, membrana PVDF aktywowana metanolem, kolejna bibuła filtracyjna, usuń pęcherzyki z kanapki i kolejną gąbkę.Umieść stos w zbiorniku transferowym. Pracuj ze stałym prądem 350 miliamperów przez 45 minut. Umyj membranę PVDF 25 mililitrami buforu TBST przez pięć minut, delikatnie wstrząsając.Zablokuj membranę za pomocą 5% BSA i buforu TBST na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę z rozcieńczonym przeciwciałem acetylolizyny sprzężonym z HRP w temperaturze pokojowej przez godzinę lub cztery stopnie przez noc, delikatnie wstrząsając. Przemyj membranę 20 mililitrami buforu TBST przez pięć minut, delikatnie wstrząsając.Powtórz ten krok cztery razy. Nałożyć podłoże chemiluminescencyjne na membranę na jedną minutę. Przechwyć sygnał za pomocą podstawowego imagera kamery CCD.Te same objętości frakcji elucyjnych i oczyszczania białek załadowano do żelu SDS-PAGE. Wydajność acetylowanego białka wynosi około połowy białka typu dzikiego, które jest bardzo wydajne, a ten sam szczep ekspresyjny bez acetylolizyny i pożywki wzrostowej nie może wytwarzać białek o wykrywalnej ilości, co wskazuje na wysoką czystość acetylowanego białka, ponieważ w tej konkretnej pozycji nie ma kanonicznych aminokwasów. Western blot wykazał, że nie ma wykrywalnej acetylacji w białku typu dzikiego, co wskazuje na niskie tło niespecyficznej acetylacji tego systemu ekspresji, podczas gdy acetylowane białko miało wyraźne pasmo.Tandemowa spektrometria mas potwierdziła, że acetylacja zachodzi we właściwym miejscu, którego odpowiadająca mu pozycja w genie została zmutowana do kodonu stop. Aby uzyskać dobre plony i czystość acetylowanych białek, należy zastosować zoptymalizowany system inkorporacji acetylolizyny, aby uzyskać zarówno wysoką wydajność, jak i wysoką czystość. Komórki BL21(DE3) powinny być używane do acetylacji o niskim tle i niespecyficznej w celu zwiększenia czystości.System inkorporacji genetycznej może być wykorzystany w systemach eukariotycznych do szerszych zastosowań.

a-facile-protocol-to-generate-site-specifically-acetylated-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Poznaj metodę ekspansji kodu genetycznego do generowania homogenicznie acetylowanych białek w określonych miejscach przy użyciu Escherichia coli. Protokół umożliwia badanie modyfikacji potranslacyjnych z wysoką wydajnością.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów